基于HPLC-Q-Orbitrap-MSn的血三七化學成分分析

嚴晟 李漓 黃晨存 趙元 許光明

〔摘要〕 目的 鑒定血三七藥材的化學成分。方法 采用HPLC-Q-Orbitrap-MSn技術分析及鑒定血三七中的化學成分。色譜條件：色譜柱為C18柱（250 mm×4.6 mm×5 μm），流動相為0.1%甲酸水-甲醇，梯度洗脫，柱溫30 °C，流速1 mL/min，波長280 nm，進樣體積5 μL。質譜條件：加熱電噴霧電離源（HESI）;正、負離子檢測模式;鞘氣60 mL/min;輔助氣體流量20 mL/min;噴霧電壓3.5 kV;毛細管溫度380 ℃;輔助氣加熱器溫度380 ℃;掃描模式：FuLL MS/dd-MS2，FuLL MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500;掃描范圍m/z 100～1200;碰撞能量為30 eV。數據庫、對照品及相關文獻比對質譜信息，分析化學元素組成和裂解途徑，推斷化學結構。結果 鑒定了33種化合物，包括9種酚酸類、6種黃酮類、10種香豆素類、7種苷類和其他類成分1種。結論 從血三七中首次發現了24個化合物，其中1個成分為潛在的新巖白菜素類化合物。

〔關鍵詞〕 血三七;高效液相色譜;四級桿軌道阱高分辨質譜;鑒定;化學成分

〔中圖分類號〕R284.1? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2023.06.012

〔Abstract〕 Objective To identify the chemical composition of Xuesanqi （Polygonum amplexicaule D. Don var. sinense Forb）. Methods High-resolution mass spectrometry （HPLC-Q-Orbitrap-MSn） technology was used to identify the chemical composition in Xuesanqi （Polygonum amplexicaule D. Don var. sinense Forb）. Chromatographic conditions were as follows： the column was C18 column [Shimadzu， DiamondiL （250 mm × 4.6 mm × 5 μm）]; the mobile phase was 0.1% formic acid water-methanol for gradient elution; the column temperature was 30 ℃; the flow rate was 1 mL/min; the wavelength was 280 nm， and the sample volume was 5 μL. Mass spectrometry conditions were established： heated electrospray ionization source （HESI）; positive and negative ion detection mode; sheath gas （60 mL/min）; auxiliary gas flow （20 mL/min）; spray voltage （3.5 kV）; capillary temperature （380 ℃）; auxiliary gas heater temperature （380 ℃）. Samples were analyzed in two scan modes： Full MS （resolution： 70000） and dd-MS2 （resolution： 17500）， with can range of m/z100～1200 and collision energy of 30eV. Database， control articles and related literature were used to compare MS spectrometry information， and the chemical element composition and cleavage pathways were analyzed to infer the chemical structure. Results A total of 33 compounds were identified， including 9 phenolic acids， 6 flavonoids， 10 coumarins， 7 glycosides， and 1 other component. Conclusion A total of 24 compounds were first identified from Xuesanqi （Polygonum amplexicaule D. Don var. sinense Forb）， one of these components is a potential new rock cabbage compound.

〔Keywords〕 Xuesanqi （Polygonum amplexicaule D. Don var. sinense Forb）; high performance liquid chromatography; quadrupole orbitrap high-resolution mass spectrometry; identification; chemical composition

血三七，蓼科植物中華抱莖蓼（Polygonum amplexicaule D. Don var. sinense Forb）的根莖，分布于湖北、湖南和陜西等地，具有行氣活血、止血生肌、清熱解毒等功效，可治療胃脘痛、痛經、崩漏等癥狀，主要作用是散瘀止血、活血止痛[1]。現代藥理學研究發現，血三七具有抗動脈粥樣硬化[2]、抗血栓[3]、抗炎[4]、抗真菌[5]、抗氧化[6]等藥理作用。

血三七藥理作用廣泛，化學成分復雜，藥效物質基礎尚未闡明。多項研究[7-12]表明從石油醚、正丁醇和乙酸乙酯部位發現主要化學成分包括黃酮類、酚酸類、機酸類、香豆素類和蒽醌類等化合物。研究發現類黃酮[13]具有抗氧化、清除自由基、擴張血管、增加血流量以及改善心腦血管循環等作用，沒食子酸[14]具有抗病毒、消炎、鎮痛、抗氧化作用;綠原酸[15]具有抗病毒和抗菌作用。但是，目前對血三七活性成分的具體研究還有所欠缺，隨著對血三七藥理活性不斷深入研究，全面和快速鑒定其化學成分成為亟待解決的問題。

中醫藥是中華民族的寶庫，但中藥成分成千上萬且含量較低，定性分析需提供準確、可靠且豐富的化合物信息;Orbitrap高分辨質譜在中藥組分分析中具有較高的靈敏度和掃描速度，可對痕量組分進行分析，其獨特的優勢在中藥組分分析中發揮日益重要的作用[16]。本實驗采用HPLC-Q-Orbitrap-MSn技術，快速鑒定了血三七中的化學成分，為血三七的質量控制和藥效研究提供了物質研究基礎。

1 材料

1.1? 實驗藥材

血三七藥材（安徽亳州，湖南振興中藥有限公司，批號為190920），經湖南中醫藥大學藥學院周小江教授鑒定為蓼科屬植物中華抱莖蓼的根莖。

1.2? 實驗試劑

沒食子酸（批號：DSTDM000801）、阿魏酸（批號：DSTDF008102）、表兒茶素（批號：DSTDB003501）均購自成都德斯特生物技術有限公司，純度均大于98%。甲醇為色譜純;其他化學試劑均為分析純。

1.3? 實驗儀器

Q-ExactiveTM組合型四極桿OrbitrapTM質譜儀（美國Thermo Scientific公司）;YM-020S超聲波清洗機（深圳市方奧微電子有限公司）;RE-52AA旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）;DFD-700智能儀表恒溫水浴鍋（上海錦錨工業科技有限公司）;T-214電子天平（美國丹佛儀器公司）;H1850高速離心機（湘儀儀器有限公司）;GN-0005超純水儀（上海和泰儀器有限公司）。

2 方法

2.1? 供試品溶液的制備

精密稱定血三七粉末1.0 g，置于50 mL錐形瓶中，加入70%乙醇50 mL，靜置2 h，回流提取1 h，取1 mL溶液，甲醇稀釋。置于進樣小瓶中，待測。

2.2? 對照品溶液的制備

分別精密稱定各對照品2.0 mg，甲醇溶液定容，制成40 μg/mL的標準溶液，0.22 μm有機濾膜過濾，即得。

2.3? HPLC-ESI-MS條件

色譜柱為C18柱（日本島津，DiamondiL系列，250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為A（0.1%甲酸水）-B（甲醇），洗脫條件：0～5 min，5%～18% B;5～14 min，18%～24% B;14～19 min，24%～24% B;19～34 min，24%～46%B;34～40 min，46%～64% B;40～50 min，64%～95% B。柱溫30 °C，流速1 mL/min，波長280 nm，進樣體積5 μL。

離子源：加熱電噴霧電離源（ESI）;正、負離子檢測模式;鞘氣60 mL/min;輔助氣體流量20 mL/min;噴霧電壓3.5 kV;毛細管溫度380 ℃;輔助氣加熱器溫度380 ℃;掃描模式：FuLL MS/dd-MS2，FuLL MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500;掃描范圍m/z 100～1200;碰撞能量為30 eV。

3 結果

3.1? HPLC-MS/MS分析結果

按照“2.3”項下的色譜及質譜條件，進行分析，樣品總離子圖如圖1。

3.2? 結構鑒定

XcaLibur軟件分析質譜數據，將處理后的數據導入Compound Discoverer 3.0軟件進行峰提取和歸一化;質量偏差<10 ppm（1 ppm=1×10-6），化合物推測通過檢索HMDB數據庫及標準品和相關文獻進行指認，從血三七中發現了33個化學成分。詳見表1。

3.3? 血三七化學成分裂解規律

3.3.1? 酚酸類化合物結構鑒定? 酚酸類化合物主要是沒食子酸類以及少量奎寧酸類和阿魏酸類。根據沒食子酸類化合物二級質譜及裂解規律，化合物9～12，19，24～27和33被鑒定為沒食子酸類化合物。見圖2，以化合物9的二級質譜裂解規律為例，化合物9質核比為m/z 343，推測分子式為C14H15O10，根據二級質譜可知，在負離子模式下存在m/z 169和m/z 125的離子碎片，表明結構存在一部分沒食子酸。由于結構中存在酯鍵，在質譜中酯基容易斷裂形成豐度更高的m/z 189的離子碎片。結構中環烷烴對位羥基處發生RDA裂解，再進一步脫去一分子水和末端雙鍵，形成m/z 267的離子碎片，推測該化合物為3-沒食子酰基奎寧酸。化合物9～12，19，24～27和33均首次在血三七中報道。

3.3.2? 黃酮類化合物的結構鑒定? 黃酮類化合物主要是表兒茶素類化合物。根據對表兒茶素類化合物二級質譜及裂解規律，化合物16、21、28和30被鑒定為表兒茶素類化合物。見圖3，以化合物28的二級質譜裂解規律為例，化合物質核比為m/z 441，推測分子式為C22H18O10。根據二級質譜可知，在負離子模式下存在m/z 169和m/z 125的離子碎片，表明結構存在一部分沒食子酸。由于結構中存在酯鍵，在質譜中酯基容易斷裂形成豐度更高的m/z 289的離子碎片，進一步在A環間位羥基上失去一分子CO2，形成m/z 254的離子碎片，推測該化合物為表兒茶素沒食子酸酯。化合物16和30首次在血三七中報道。

3.3.3? 香豆素類化合物的結構鑒定? 香豆素類化合物主要是巖白菜素類化合物。根據對巖白菜素類化合物二級質譜及裂解規律，化合物13～15、18、20、25和31～33被鑒定為香豆素類化合物。見圖4，以化合物22的二級質譜裂解規律為例，化合物22質核比為m/z 443，推測分子式為C19H24O12。根據二級質譜可知，在負離子模式下存在m/z 369和m/z 327的離子碎片，化合物22丟失一分子的碳酸甲乙酯基團，形成m/z 369的碎片離子;進一步丟失C3H8基團，形成m/z 327的碎片離子。m/z 327、m/z 249、m/z 234、m/z 201、m/z 192為巖白菜素的質譜裂解碎片，主要發生在C環上的內部裂解。m/z 249為C環上3，4位RDA裂解形成3，4A碎片離子，進一步在A環上脫去甲基形成m/z 234的碎片離子;在C環上10b，4a位發生非典型RDA裂解丟失C4H8O4（120DA）的基團，形成m/z 207的10b，4aA特征離子，進一步在A環上脫去甲基形成m/z 192的碎片離子。故推測該化合物為甲基吡啶-O-巖白菜素。化合物13～15、18、25和31～33首次在血三七中報道。

4 討論

Q-Orbitrap四級桿-軌道阱高分辨質譜同時具有高分辨率和高靈敏度的特點，可得到微量成分的高分辨質譜信息以及觸發的多級質譜數據，缺少對照品的情況下，單針進樣即可高通量獲取中藥中成百上千化合物的定性信息，提高中藥復雜體系中化學成分的快速分析鑒定能力[20]。本研究比較了回流提取和超聲提取、70%乙醇和100%乙醇提取液的提取效率，結果顯示：回流、超聲提取，在HPLC中差異不明顯;70%乙醇提取液中的質譜信息豐富;利用HPLC-Q-Orbitrap-MSn技術，對血三七的70%乙醇提取部位進行快速定性分析，鑒定出33種化合物，首次發現了24個化合物，1個成分為潛在的新巖白菜素類化合物，表明HPLC-Q-Orbitrap-MSn四級桿-軌道阱高分辨質譜在快速篩查天然藥物方面獨具優勢。

采用ESI正、負離子模式采集數據，分別適用于堿性、酸性基團化合物的結構鑒定[24]。血三七中酚酸類和香豆素類等成分在負離子模式下有較好的響應，故主要以ESI負離子模式鑒定血三七成分及解析質譜裂解規律。本實驗進一步豐富了血三七中沒食子酸類、巖白菜素類等化學成分，較好地闡明血三七的藥效物質基礎，為其更深入的開發利用提供了理論依據。

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