慢性鎘暴露下食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的lncRNAmRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

彭 琳，曾明欽，陳炯玉，張廈蓉，朱 芮，黃裔騰

（1．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院中心實驗室，廣東 汕頭 515041；2．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院健康管理中心，廣東 汕頭 515041）

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤，位列全球惡性腫瘤發(fā)病率第7位和死亡率第6位[1]。鱗狀細(xì)胞癌和腺癌是食管癌的兩種主要組織學(xué)類型，其中食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）主要高發(fā)于東亞男性，尤其在中國約占食管癌病例的90%[2-3]。ESCC 具有的明顯地域、性別差異的流行病學(xué)特征[4]，高度提示其病因?qū)W的特殊性，環(huán)境因素被認(rèn)為是ESCC發(fā)生的重要危險因素[5]。鎘是環(huán)境中廣泛存在的重金屬污染物，職業(yè)人群鎘暴露主要通過呼吸道吸入和皮膚暴露，一般人群主要通過空氣、吸煙、食物和水等途徑，其中，膳食攝入是日常暴露的主要來源，如稻谷、水產(chǎn)品、馬鈴薯、蔬菜、肉類和海產(chǎn)品等[6-7]。調(diào)查顯示，中國男性和女性成年人平均每周飲食鎘攝入量分別為3.9和4.1 μg/kg[8]，約為歐洲國家人均每周飲食鎘暴露水平（2.04 μg/kg）的2 倍[9]。近年來，已有若干基于中國人群的流行病學(xué)證據(jù)指出鎘暴露與食管癌的關(guān)聯(lián)[10-12]。本課題組前期在我國食管癌高發(fā)唯一沿海地區(qū)——潮汕地區(qū)開展的人群研究也表明，血鎘負(fù)荷是ESCC 發(fā)生和不良預(yù)后的危險因素之一，且通過構(gòu)建持續(xù)低劑量鎘暴露人ESCC 細(xì)胞株（CCT-EC109和CCT-EC9706）的系列體內(nèi)外實驗證明慢性低濃度鎘暴露促進(jìn)ESCC 細(xì)胞生長、侵襲、遷移能力，增強(qiáng)腫瘤干細(xì)胞特性和對放化療耐受性[13]，但具體機(jī)制有待深入解析。

鎘是非直接遺傳毒性致癌物，表觀遺傳途徑是其主要致癌機(jī)制[14]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度超過200 nt 的無蛋白編碼功能的RNA。新近研究指出，鎘的毒性效應(yīng)存在組織器官特異性，可能與其調(diào)控不同lncRNA 激活相應(yīng)的信號通路或分子事件有關(guān)[15]。然而，lncRNA 在鎘促ESCC 中的調(diào)控機(jī)制尚無報道。本文擬基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，利用課題組前期建立的慢性鎘暴露ESCC 細(xì)胞模型之一CCT-EC109細(xì)胞系，通過比較其與親本細(xì)胞EC109 在lncRNA 和mRNA 水平的表達(dá)差異，運用生物信息學(xué)方法構(gòu)建lncRNA-mRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，為探討慢性鎘暴露促進(jìn)ESCC 演進(jìn)相關(guān)機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞模型構(gòu)建

EC109 細(xì)胞由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院中心實驗室細(xì)胞庫提供，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下培養(yǎng)于含10%胎牛血清和含青-鏈霉素的RPIM-1640 培養(yǎng)基中。EC109 細(xì)胞經(jīng)含5 μmol/L 氯化鎘的培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)12周，建立慢性鎘暴露細(xì)胞模型CCT-EC109。

1.2 主要試劑

氯化鎘（純度99%）購自美國Sigma 公司，RPMI-1640 培養(yǎng)基和10%胎牛血清均購自美國Gibco，青霉素/鏈霉素、0.25% EDTA 胰蛋白酶均購于北京索萊寶科技有限公司，RNA later 購自美國Invitrogen。細(xì)胞總RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司；實時熒光定量PCR（quantitative real time PCR，qPCR）試劑盒購自上海翌圣生物科技股份有限公司。

1.3 總RNA提取及細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序

EC109 和CCT-EC109 兩株細(xì)胞各收集3 個樣本，使用miRNeasy Mini 試劑盒（德國Qiagen）抽提總RNA，使用Qubit?3.0 Fluorometer 和NanoDrop One 分光光度計定量，并利用Agilent Bioanalyzer 2100 選擇RNA 完整性指數(shù)值大于7.0的樣品用于測序建庫，1 μg RNA用于后續(xù)RNA樣品制備。建庫測序委托上海鯨舟基因科技有限公司完成，lncRNA 和mRNA 測序采用Illumina NovaSeq 6000 測序儀，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn): 每個樣本數(shù)據(jù)量約10 G，所有類型堿基質(zhì)量大于20 的比例不小于90%。

1.4 差異表達(dá)lncRNA和mRNA的篩選

使用Hisat 2.0.5 將測序后的原始數(shù)據(jù)匹配到參考基因組，將輸出的序列比對/圖文件轉(zhuǎn)換為二進(jìn)制比對/圖文件，并使用SAMtools 1.3.1 進(jìn)行排序。使用R軟件包進(jìn)行分位數(shù)歸一化以及后續(xù)數(shù)據(jù)處理，以每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段數(shù)表示基因豐度，利用Stringtie 軟件對每個基因中的片段進(jìn)行計數(shù)，并根據(jù)TMM算法進(jìn)行歸一化。使用R包edgeR進(jìn)行mRNA和lncRNA的差異表達(dá)分析，篩選條件為:P＜0.05，|log2（fold change）|≥1。

1.5 差異lncRNA相關(guān)靶基因篩選

應(yīng)用ENCORI（http://starbase.sysu.edu.cn） 對DElncRNA 進(jìn)行順式與反式靶基因預(yù)測，繼而利用RNAplex 軟件計算lncRNA-mRNA 互補配對熱動力學(xué)參數(shù)值，根據(jù)軟件閾值進(jìn)一步篩選靶基因。最后，將DE-lncRNA 預(yù)測的靶基因集與DE-mRNA 基因集取交集，獲得DE-lncRNA調(diào)控的鎘暴露相關(guān)基因。

1.6 功能預(yù)測

為進(jìn)一步了解DE-lncRNA調(diào)控的靶基因功能，利用R包Enrich進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能注釋，同時采用京都基因與基因組大百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫（http://www.genome.ad.jp/kegg），進(jìn)行通路富集分析。

1.7 LncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)1.5 篩選的lncRNA 相關(guān)靶基因結(jié)果，采用Pearson's 相關(guān)分析篩選相關(guān)系數(shù)≥0.9（P＜0.05）的結(jié)果，利用Cytoscape 軟件構(gòu)建lncRNA-mRNA關(guān)系對。

1.8 qPCR 驗證共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵lncRNA 和mRNA 的表達(dá)

提取EC109、CCT-EC109 細(xì)胞總RNA，利用HiScript?III cDNA 第1 鏈合成試劑盒和HiScript?III RT SuperMix for qPCR 試劑盒（諾唯贊，中國）分別將lncRNA和mRNA逆轉(zhuǎn)錄成模板cDNA后，以β-actin為內(nèi)參，qPCR 測定目的lncRNA 和mRNA。PCR 引物序列見表1，引物由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)體系: cDNA 模板1 μL，上下游引物各0.4 μL，2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master 混合物10 μL，雙 蒸 水8.2 μL。使 用Bio-Rad CFX96 Deep Well PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，條件: 預(yù)變性95 ℃、30 s；循環(huán)反應(yīng)95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，共40 個循環(huán)。記錄各孔CT值，目的基因的相對表達(dá)水平為2-ΔΔCT。每組實驗重復(fù)3次。

表1 目的lncRNA和mRNA的引物序列

1.9 統(tǒng)計分析

采用R4.0.5 軟件和SPSS 24.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。組間差異比較采用Student'st檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 暴露株與親本的差異lncRNA和mRNA表達(dá)譜

層次聚類分析表明，lncRNA和mRNA表達(dá)譜可較明顯區(qū)分暴露株和親本株（圖1）。散點圖可視化顯示，2 794個DE-lncRNA包含1 248個上調(diào)lncRNA和1 546個下調(diào)lncRNA；4 267 個DE-mRNA 則包括2 766 個上調(diào)基因和2 947個下調(diào)基因（圖2）。

圖1 EC-109與CCT-EC109細(xì)胞lncRNA和mRNA差異表達(dá)譜

圖2 差異lncRNA相關(guān)的靶mRNA

2.2 差異表達(dá)lncRNA相關(guān)的靶mRNA

如圖2 所示，將DE-lncRNA 預(yù)測的7 216 個靶基因與4 267個DE-mRNA取交集，篩選得到1 546個與lncRNA相關(guān)的靶基因，其中上調(diào)基因737個，下調(diào)基因810個。

2.3 鎘暴露相關(guān)lncRNA的靶基因生物學(xué)功能分析

將上述篩選的1 546 個交集基因進(jìn)行GO 聚類分析，結(jié)果顯示靶基因富含57 個功能項，包括28 個生物學(xué)過程項、12個分子功能項和17個細(xì)胞成分項。涉及的生物學(xué)過程主要包括代謝、生物調(diào)節(jié)、刺激應(yīng)答、免疫系統(tǒng)、細(xì)胞增殖等；細(xì)胞組分方面主要為膜、膜性腔、含蛋白質(zhì)的復(fù)合物等；分子功能項主要與催化活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性、分子功能調(diào)節(jié)等密切相關(guān)（圖3）。KEGG 分析1 546 個靶基因富集信號通路包含324 種途徑，癌癥和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是最主要的條目，其中，最顯著的富集項為Hippo 信號通路（富集基因數(shù)23，P=0.003）和病毒致癌作用（富集基因數(shù)29，P=0.002），其他重要信號通路包括癌癥信號通路（富集基因數(shù)54，P=0.044）、溶酶體（富集基因數(shù)137，P=0.051）等。KEGG顯示鎘暴露相關(guān)lncRNA的靶基因通路富集分析的前30個信號通路見圖4。

圖3 鎘暴露相關(guān)lncRNA的靶基因GO功能富集分析

圖4 鎘暴露相關(guān)lncRNA的靶基因通路富集分析

2.4 鎘暴露相關(guān)lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

根據(jù)Pearson's 相關(guān)系數(shù)篩選出的前1 000 個lncRNA-mRNA 共表達(dá)基因?qū)Π?31 個DE-lncRNA和347 個DE-mRNA，Cytoscape 軟件構(gòu)建的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)如圖5 所示。將差異表達(dá)最顯著的前10 個lncRNA（NONHSAT244320.1、NONHSAT071835.2、NONHSAT 225909.1、NONHSAT107780.2、NONHSAT256799.1、NONHSAT097388.2、NONHSAT188800.1、 NONHSAT 211602.1、 NONHSAT217261.1、 NONHSAT054462.2）的38個共表達(dá)mRNA進(jìn)一步構(gòu)建關(guān)系對網(wǎng)絡(luò)（圖6），與mRNA 關(guān)聯(lián)最多的lncRNA 為NONHSAT097388.2，其在暴露株表達(dá)顯著下調(diào)。共13個DE-mRNA 被預(yù)測為該lncRNA 的靶基因，分別是EMP2、ORAI2、ECE1、ZNF713、 HGSNAT、 CA5B、 ARPIN、 ANKRD9、PGF、MFAP5、PGM2L1、GNE和FUT8，其中FUT8、MFAP5、PGF顯示為上調(diào)基因，與NONHSAT097388.2均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖5 鎘暴露相關(guān)前1 000個lncRNA-mRNA共表達(dá)關(guān)系對

圖6 前10個差異表達(dá)lncRNA的lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

2.5 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)基因的表達(dá)驗證

為進(jìn)一步驗證構(gòu)建的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵lncRNA和mRNA 的表達(dá)情況，選取mRNA 關(guān)聯(lián)最多的lncRNA NONHSAT097388.2 及其負(fù)相關(guān)基因FUT8、PGF、MFAP5和 正 相 關(guān) 前4 位 基 因EMP2、ECE1、ORAI1、ZNF713，qPCR 測定結(jié)果顯示，除FUT8外，其他基因在親本株EC109與暴露株CCT-EC109的表達(dá)差異與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，即MFAP5和PGF在暴露株中表達(dá)升 高（P＜0.05）， 而NONHSAT097388.2、ECE1、EMP2、ORAT1和ZNF713表 達(dá) 均 下 降（P＜0.01），如圖7。

圖7 qPCR驗證鎘暴露相關(guān)lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵基因在EC109和CCT-EC109細(xì)胞中的表達(dá)

3 討 論

鎘致癌機(jī)制復(fù)雜，可引起包括DNA鏈斷裂、染色體畸變和基因突變在內(nèi)的遺傳毒性作用，但表觀遺傳改變被認(rèn)為是比直接DNA損傷更為主要的致癌分子事件[16]。近年來，lncRNA作為新興表觀遺傳調(diào)控分子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用成為研究熱點。lncRNA不僅參與mRNA 穩(wěn)定性、衰變調(diào)控，還參與基因翻譯及翻譯后修飾調(diào)節(jié)等諸多生物學(xué)過程[17]。新近研究證據(jù)揭示了lncRNA 參與鎘的毒性作用，包括多器官損傷、生殖毒性、DNA 損傷修復(fù)異常、惡性轉(zhuǎn)化等過程[15，18]。例如，持續(xù)鎘暴露可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞lncRNA OIP5-AS1 表達(dá)升高，通過miR-128-3p/SLC7A11 軸抑制鐵死亡參與前列腺癌進(jìn)展[19]。lncRNA DUXAP10 通過調(diào)控Hedgehog通路參與鎘暴露誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞干細(xì)胞特性增加[20]。此外，lncRNA MALAT1也被認(rèn)為是鎘毒性的潛在標(biāo)志物，它介導(dǎo)鎘暴露誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞16HBE細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的增強(qiáng)，但具體機(jī)制不明[21]。迄今為止，尚無鎘暴露對食管癌細(xì)胞lncRNA表達(dá)譜影響的研究報道。

通常認(rèn)為，共表達(dá)基因集參與同一通路，或者受到同樣的調(diào)控，具有相似的生物學(xué)功能。因此，lncRNA-mRNA 互相作用關(guān)聯(lián)分析方法常被應(yīng)用于lncRNA在疾病尤其是在腫瘤中的功能和調(diào)控機(jī)制的研究[22]。本研究首先通過功能及通路富集分析發(fā)現(xiàn)，鎘暴露ESCC 細(xì)胞株發(fā)生變化的基因在生物學(xué)功能上主要涉及細(xì)胞代謝、刺激應(yīng)答、免疫系統(tǒng)、細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面，這些也與既往報道闡述的鎘毒性作用及相關(guān)機(jī)制相符[23-24]。盡管關(guān)于鎘免疫毒性對腫瘤演進(jìn)影響的直接研究不多，但大量研究表明，鎘暴露可影響血液或組織中免疫細(xì)胞穩(wěn)態(tài)如Th1/Th2 的失衡和許多免疫相關(guān)分子，如IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α、IL-1β等的表達(dá)發(fā)生變化[25-26]，這些均可能影響腫瘤免疫微環(huán)境。值得一提的是，在鎘影響的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，Hippo 通路最顯著，而該通路被證實參與食管癌的惡性進(jìn)展和化療抵抗機(jī)制[27]。可見，Hippo信號通路可能是慢性鎘暴露促進(jìn)ESCC 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為及放化療抵抗的重要分子機(jī)制。此外，通路富集分析還顯示，病毒致癌作用也是顯著富集項，這與Liang等[28]在鎘暴露乳腺癌細(xì)胞株富集到HPV感染相關(guān)通路的結(jié)果相近，提示鎘可能與病毒具有協(xié)同致癌作用。

對共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系對分析發(fā)現(xiàn)，與mRNA 關(guān)聯(lián)最多的lncRNA NONHSAT097388.2 在暴露細(xì)胞株CCT-EC109中顯示表達(dá)降低，提示鎘暴露可能通過抑制該lncRNA 的表達(dá)調(diào)控相關(guān)基因及相應(yīng)分子事件。NONCODE 網(wǎng)站查詢顯示，NONHSAT097388.2 基因位于4號染色體，長度14 407 bp，包含6個外顯子，目前對NONHSAT097388.2 的功能知之甚少，搜索與其關(guān)聯(lián)的2 個上調(diào)基因MFAP5、PGF相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)盡管MFAP5在食管癌中的作用未見報道，但在頭頸部鱗癌和乳腺癌的研究中，MFAP5被證實分別通過AKT通路和ERK/MMP 通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、增 殖 和 轉(zhuǎn)移[29-31]；阻斷MFAP5 的抗腫瘤免疫治療則可增加卵巢癌和胰腺癌對紫杉醇化療的敏感性[32]。PGF基因即胎盤生長因子（placenta growth factor，PGF/PIGF）基因，是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）家族重要成員之一。新近研究表明，PGF 在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌細(xì)胞和患者血漿中表達(dá)增加，且與疾病進(jìn)展相關(guān)，而阻斷PGF可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和化療抵抗[33]；PGF 還被發(fā)現(xiàn)在惡性程度最高的三陰性乳腺癌組織中的表達(dá)水平高于其他亞型，而且，在乳腺癌、黑色素瘤患者的血液中均能檢測到高豐度的循環(huán)PGF表達(dá)；高度提示PGF是促進(jìn)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要因素之一[34-35]。EMP2基因是與NONHSAT097388.2 共表達(dá)的正相關(guān)基因之一，EMP2 mRNA 被證實在食管癌組織中顯著低表達(dá)，且在淋巴結(jié)陽性和中低分化組中表達(dá)水平更低[36]。上述結(jié)果提示， 鎘暴露可能通過NONHSAT097388.2 介導(dǎo)MFAP5、PGF、EMP2等基因的表達(dá)調(diào)控參與ESCC 的演進(jìn)和放化療抵抗機(jī)制。

綜上所述，慢性低濃度鎘暴露可誘導(dǎo)ESCC 細(xì)胞相關(guān)lncRNA 和mRNA 的表達(dá)譜發(fā)生改變，其可能通過復(fù)雜的lncRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)引起系列生物學(xué)過程、細(xì)胞組分、代謝與免疫、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的變化，從而構(gòu)成鎘促ESCC 發(fā)生發(fā)展和放化療抵抗的復(fù)雜分子機(jī)制。本研究結(jié)果亦充分支持了本課題組前期研究工作揭示的鎘暴露食管癌細(xì)胞株較親本細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲遷移能力、EMT和干細(xì)胞特性以及對放化療的耐受性[13]。此外，本研究鑒定的若干關(guān)鍵lncRNA和mRNA 有望成為鎘暴露ESCC 患者預(yù)后判斷的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點。