杜仲腰痛丸對脊髓損傷后NLRP3炎癥小體表達的影響

元寶華 李興勇 方鵬飛 藺海生 劉曉婷

摘要：目的 觀察杜仲腰痛丸對大鼠脊髓損傷后NLRP3炎癥小體表達的影響，探討該藥對脊髓損傷后炎癥反應的作用和其作用原理

方法 將50只SD大鼠隨機分成5組，每組10只。分別是A組（低劑量組）、B組（中劑量組）、C組（高劑量組）、D組（模型組）、E組（假手術(shù)組）。A組、B組、C組與D組進行脊髓損傷造模，E組行椎板切除術(shù)。A組、B組、C組分別按照濃度梯度給予杜仲腰痛丸干預，D組和E組則給予同等量的生理鹽水干預，實驗的前后每組分別采用 Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）運動能力評定量表評估大鼠后肢的聯(lián)合運動功能，實驗第7天取材檢測NLRP3蛋白的相對表達，并分析其結(jié)果。

結(jié)果 術(shù)后A組、B組、C組的BBB評分均優(yōu)于D組（P<0.05），治療效果有時間依賴性；免疫組化法D組同E組相比較，D組NLRP3炎癥體表達相對比較高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；A組、B組、C組與D組相比較，A組、B組、C組NLRP3表達相對減少，C組的表達相對最少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

結(jié)論 證實杜仲腰痛丸可以抑制脊髓損傷部位NLRP3的表達，減緩炎癥反應。

關鍵詞：杜仲腰痛丸；脊髓損傷；NLRP3；炎癥反應

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：B

文章編號：1007-2349（2023）07-0001-03

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是脊柱節(jié)段控制系統(tǒng)和自主神經(jīng)系統(tǒng)被破壞，導致痙攣性麻痹、疼痛感覺遲鈍、交感神經(jīng)遲鈍和副交感神經(jīng)興奮，產(chǎn)生心律失常、全身性低血壓、支氣管收縮、呼吸道產(chǎn)生大量分泌物、腸道、膀胱和性功能障礙等癥狀，具有比較高的發(fā)病率以及致殘率［1-4］。由于血脊髓屏障的破壞，損傷部位組織缺血，循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)炎癥細胞趨化因子誘導損傷組織周圍發(fā)生炎癥反應，致使炎癥反應介導周圍組織壞死和凋亡。而在SCI后眾多病理反應中，炎癥反應對機體產(chǎn)生影響最大。杜仲腰痛丸（由杜仲、川芎、赤芍、川牛膝、土鱉蟲等組成）常用于治療脊柱源性疾病，研究證實杜仲腰痛丸可以抑制炎癥反應，起到緩解疼痛的作用［5-6］。但杜仲腰痛丸能否抑制SCI后NLRP3炎性小體介導的炎性反應，尚未有這方面的實驗研究。本研究將杜仲腰痛丸應用于脊髓損傷動物模型，觀察其對SCI后NLRP3炎癥體表達的影響，并探討其中機理。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級SD雌性大鼠50只，6-8周齡，體重（210±9.70）g，于中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心購得，許可證號碼：SCXK（甘）2020-0002，所有大鼠按照動物實驗管理與操作實用指南進行照料和處理，每籠5只，在相同條件下飼養(yǎng)，適應性喂養(yǎng)為期1周，若此期間實驗動物沒有出現(xiàn)不良反應，繼而開展相關實驗。

1.1.2 實驗材料 杜仲腰痛丸，組成包括杜仲、川芎、赤芍、川牛膝、土鱉蟲等十七味中藥，每瓶220丸，每粒含生藥0.18 g，由甘肅省中醫(yī)院制劑中心生產(chǎn)，產(chǎn)品批號：210653。配制成每毫升含生藥0.05 g的藥液，無菌條件下裝入試劑瓶冰箱低溫冷藏保存?zhèn)溆谩嶒炛杏玫降脑噭和每故驨LRP3抗體（Proteintech）；免疫組化試劑盒（博士德）。

1.2 實驗方法 50只SD大鼠被隨機分成5組，每組10只。分別是A組（低劑量組）、B組（中劑量組）、C組（高劑量組）、D組（模型組）、E組（假手術(shù)組）。所有大鼠均用1％戊巴比妥鈉（60 mg/Kg）腹腔注射麻醉。8％Na2S背部脫毛，常規(guī)消毒后鋪無菌洞巾，定位棘突后以T10棘突為中心，用手術(shù)刀切開皮膚形成一道長約3cm的切口，鈍性剝離周圍軟組織后顯露T10、T9、T11的棘突，并用蚊式咬骨鉗咬除T10及部分T9、T11棘突和椎板，形成大小約4×8 mm的骨窗，暴露脊髓背側(cè)硬膜，用止血鉗輕夾脊髓，出現(xiàn)后肢伸展和甩尾反射則標志著建模成功，形成中度及重度脊髓損傷模型。E組（假手術(shù)組）只進行椎板切除，脊髓沒有受到壓迫。局部使用適量青霉素，預防施術(shù)部位發(fā)生感染，逐層縫合關閉切口，術(shù)中所有操作必須在無菌條件下進行。為防止術(shù)后感染，給予青霉素腹腔注射3 d，4萬單位／N／只。觀察大鼠皮膚有無損傷或感染，必要時繼續(xù)注射青霉素。保持室溫20～25℃，相對濕度在50%～65%，提供（12 h光照/12 h黑暗）穩(wěn)定的晝夜光照變化，保持24 h通風換氣，大鼠在整個實驗期間可自由獲取食物和水。為防止大鼠聚集舔舐背部傷口，所有大鼠均在清潔環(huán)境下單籠飼養(yǎng)。食物為商用大鼠顆粒飼料，飲水瓶為無毒耐高壓塑料材料制成，飲水和飲水瓶經(jīng)過高溫滅菌消毒后使用，每日定時投食更換飲水，確保大鼠有充足的營養(yǎng)供給。每天進行兩次人工排尿，并清除大鼠尿道附近污漬并消毒，以防止尿路感染，一直持續(xù)到大鼠恢復自主排尿功能。造模成功之后，A組給予杜仲腰痛丸湯劑灌胃，給藥劑量為0.42 g/（kg·ｄ），每日2次；B組給予杜仲腰痛丸湯劑灌胃，給藥劑量為0.84 g/（kg·ｄ），每日2次；C組給予杜仲腰痛丸湯劑灌胃，給藥劑量為1.68 g/（kg·ｄ），每日2次；D組和E組分別給予等量的生理鹽水，每日2次。連續(xù)干預7 d。所有動物均在實驗期間存活，無不良反應，并納入數(shù)據(jù)分析。

1.3 觀察指標 每組大鼠分別在術(shù)前及術(shù)后第1 d、第3 d、第5 d、第7 d用 BBB肢體運動功能評分（范圍為0～21分）；術(shù)后第7 d取材，運用免疫組化法檢測NLRP3炎癥體表達。

1.4 統(tǒng)計學方法 運用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)收集用（x±s）表示，符合正態(tài)分布用ｔ檢驗或單因素方差分析，非正態(tài)分布資料用秩和檢驗，P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

我們發(fā)現(xiàn)A組、B組、C組和D組的大鼠在SCI后立即失去后肢活動功能，治療結(jié)果顯示杜仲腰痛丸能促進神經(jīng)元功能恢復，并且有時間依賴性。我們的BBB評分（表1）顯示，A組的功能恢復明顯高于D組，表明杜仲腰痛丸可以改善SCI后的運動功能恢復。我們使用免疫組化技術(shù)評估了每組NLRP3炎癥體的表達變化。

2.1 BBB評分 用BBB運動評定量表評定大鼠后肢的運動功能。于術(shù)前及術(shù)后第1 d、第3 d、第5 d、第7 d，將各組大鼠置于開闊場地內(nèi)自由活動，記錄員（雙人、雙盲）負責對每只大鼠的后肢運動能力評分。每只大鼠的運動評分最終結(jié)果取平均值，得出結(jié)果值并進行統(tǒng)計學分析（表1）。

與E組相比較，A組、B組、C組和D組的BBB肢體運動功能評分顯著下降，但是隨著治療時間的延長，A組、B組、C組和D組的BBB肢體運動功能評分逐漸升高，到手術(shù)后第3天開始，A組、B組、C組BBB肢體運動功能評分優(yōu)于D組同時期的結(jié)果（P<0.01）（見圖1）。這表明杜仲腰痛丸可以改善SCI后的運動功能，促進神經(jīng)元的恢復。

2.2 免疫組化學法檢測NLRP3炎癥體的變化 運用免疫組化學法檢測，NLRP3炎癥小體陽性表達呈深灰褐色，表達的位置主要在細胞漿之中（見圖2）。E組只能觀察到少量的NLRP3炎癥小體表達，D組中NLRP3炎癥小體在細胞漿中大量表達（見表2），A組的NLRP3炎癥體表達量明顯少于D組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（見圖3）。

3 討論

本實驗研究顯示，運用免疫組化學法檢測，NLRP3炎癥小體陽性表達呈深灰褐色，表達的位置主要在細胞漿之中。E組只能觀察到少量的NLRP3炎癥小體表達，D組中NLRP3炎癥小體在細胞漿中大量表達，A組、B組、C組的NLRP3炎癥體表達量明顯少于D組，說明杜仲腰痛丸可以抑制NLRP3的活化，減輕脊髓損傷后繼發(fā)的炎癥反應，從而起到保護神經(jīng)細胞的作用。

炎癥反應是造成脊髓繼發(fā)性損傷的主要原因，脊髓損傷后使小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞、中性粒細胞以及淋巴細胞被激活，這些細胞會分泌大量的炎性細胞因子和趨化因子，致使炎癥區(qū)域擴大，形成纖維蛋白凝塊和膠質(zhì)瘢痕，并釋放大量抑制神經(jīng)和突觸修復的細胞因子（如 IL-1、TNF-α和 IL-6），炎癥反應進一步加重，從而讓中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生和修復變的更加艱難［7-9］。

NLRP3炎性小體是免疫系統(tǒng)實現(xiàn)免疫功能重要的一個組成部分，作為caspase-1的激活平臺，它可以控制細胞炎癥因子和細胞因子的處理和釋放［10-11］。NLRP3在特定的條件下被激活后，使caspase-1發(fā)生活化，活性的caspase-1則會促進IL-1β和IL-18的活化［12-13］，IL-1β和IL-18都促進活性氧（ROS）的積累，而ROS又充當損傷相關的分子模式（DAMPs），使NLRP3炎性體被激活和caspase-1發(fā)生活化，進一步產(chǎn)生IL-18和凋亡激活，從而引起反饋環(huán)，使炎癥反應進行性加重［10，14］。NLRP3激活的確切機制和它調(diào)節(jié)炎癥反應的機理，尚未研究透徹，但可能有多種調(diào)節(jié)機制和分子對NLRP3炎癥反應起積極或消極的調(diào)節(jié)作用。SCI使NLRP3激活產(chǎn)生促炎細胞因子會產(chǎn)生炎癥環(huán)境，從而加劇SCI的炎癥反應，從而惡化疾病的預后。

大量研究表明，中醫(yī)藥在治療SCI上有其獨特的經(jīng)驗和優(yōu)勢［15］。杜仲腰痛丸由杜仲、川芎、赤芍、川牛膝、土鱉蟲等組成，具有補益肝腎，通督脈、止痛消腫的功效。文獻研究表明服用杜仲腰痛丸后患者臨床癥狀明顯改善，血清IL-1、TNF-α的水平降低，IL-10水平升高，這表明杜仲腰痛丸有抗炎、緩解疼痛的作用［6］。

綜上所述，根據(jù)本實驗研究的結(jié)果，說明杜仲腰痛丸可以抑制NLRP3的活化，從而減輕脊髓損傷后繼發(fā)的炎癥反應，起到保護神經(jīng)細胞的作用。但是具體的作用過程還未可知，是直接結(jié)合NLRP3炎性體從而抑制炎性反應，或者是通過其他途徑來影響NLRP3炎性小體的激活，其中原理還需要在以后的實驗研究中去探究證實。

參考文獻：

［1］Anjum A，Yaxid M D，F(xiàn)auzi DAUD M，et al.Spinal Cord Injury：Pathophy·siology，Multimolecular Interactions，and Underlying Recovery Mechanisms［J］.Int J Mol Sci，2020，21（20）：10-12.

［2］馮世慶.脊髓損傷基礎研究的現(xiàn)狀和展望［J］.中華實驗外科雜志，2021，38（7）：1193-1198.

［3］施玉博，余鈴，郭衛(wèi)春.急性脊髓損傷的治療進展［J］.中國醫(yī)藥導報，2021，18（1）：36-39.

［4］Gao K，Shen Z，Yuan Y，et al.Simvastatin inhibits neural cell apoptosis and promotes locomotor recovery via activation of Wnt/beta-catenin signaling pathway after spinal cord injury［J］.J Neurochem，2016，138（1）：139-149.

［5］張?zhí)忑垼w繼榮，陳祁青，等.杜仲腰痛丸對LDH慢性下肢痛模型大鼠疼痛行為學的影響［J］.遼寧中醫(yī)藥大學學報，2022，24（2）：20-24.

［6］方鵬飛，劉宗瑋，溫劍濤.杜仲腰痛丸治療腰椎間盤突出癥的療效及對炎性因子的影響［J］.國醫(yī)論壇，2022，37（3）：38-40.

［7］馮婧，劉建成，張安仁.丁酸鹽與β-羥基丁酸鹽在脊髓損傷中的抗炎作用［J］.中國生物化學與分子生物學報，2022，38（9）：1149-1155.

［8］Zhang Y，AL Mamun A，Yuan Y，et al.Acute spinal cord injury：Pathophysiology and pharmacological intervention（Review）［J］.Mol Med Rep，2021，23（6）：15-18.

［9］李建平，何留民，吳武田.脊髓損傷的病理改變及修復策略［J］.中國科學：生命科學，2022，52（10）：1472-1483.

［10］Irrera N，Russo M，Pallio G，et al.The Role of NLRP3 Inflammasome in the Pathogenesis of Traumatic Brain Injury［J］.Int J Mol Sci，2020，21（17）.

［11］Meyers A K，Zhu X.The NLRP3 Inflammasome：Metabolic Regulation and Contribution to Inflammaging［J］.Cells，2020，9（8）：20-22.

［12］Swanson K V，Deng M，Ting J P.The NLRP3 inflammasome：molecular activation and regulation to therapeutics［J］.Nat Rev Immunol，2019，19（8）：477-489.

［13］Seoane P I，Lee B，Hoyle C，et al.The NLRP3-inflammasome as a sensor of organelle dysfunction［J］.J Cell Biol，2020，219（12）：5-10.

［14］朱正桓，鄒紅軍，宋志文，等.脊髓損傷后神經(jīng)修復過程中的細胞微環(huán)境［J］.中國組織工程研究，2023，27（1）：114-120.

［15］王雅欣，林一璨，郭伊諾，等.中醫(yī)藥調(diào)控細胞自噬治療脊髓損傷的方法、技術(shù)及未來［J］.中國組織工程研究，2023，27（13）：2116-2123.

（收稿日期：2022-70-18）