應用生物信息學方法結合細胞實驗探究Plakophilin-1（PKP1）在皮膚黑色素瘤中的生物學作用

張崇海 秦倩

【摘 要】目的 探索PKP1在皮膚黑色素瘤（skin cutaneous melanoma，SKCM）中相關生物學功能。方法 通過實時TIME 2.0數據庫分析PKP1在不同的腫瘤以及正常組織中的相對表達量；通過GEPIA以及UALCAN數據庫分析PKP1在皮膚黑色素瘤組織以及正常組織的表達量以及探究PKP1的表達水平和腫瘤病人預后的關系；在SK-MEL-1細胞系中，過表達PKP1探究對于腫瘤細胞的影響。結果 TIME 2.0分析顯示，多種腫瘤組織中PKP1表達水平低于正常組織（P<0.05）；而膽管癌、肝癌以及腎透明細胞癌等腫瘤中PKP1表達水平高于正常組織（P<0.05）；GEPIA數據庫分析顯示，正常組織中PKP1表達水平高于皮膚黑色素瘤組織（P<0.05）；PKP1過表達組PKP1的蛋白水平高于NC組（P<0.05）；PKP1高表達組OS指標優于低表達組（P<0.05）；CCK8實驗顯示，PKP1過表達組與空質粒組細胞OD值比較，統計學意義顯著（P<0.01）。結論 PKP1在皮膚黑色素瘤中低表達，其表達水平下調和預后不良有關，PKP1可以抑制皮膚黑色素瘤細胞的增殖，PKP1有成為靶向治療的關鍵基因的潛力。

【關鍵詞】皮膚黑色素瘤；PKP1；生存時間；細胞增殖；靶向治療

中圖分類號：R739.5 文獻標識碼：A 文章編號：1004-4949（2023）13-0044-04

The Biological Role of Plakophilin-1 （PKP1） in Cutaneous Melanoma Based on Bioinformatics Methods Combined with Cell Experiments

ZHANG Chong-hai， QIN Qian

（Department of Dermatology， Xuecheng District Peoples Hospital， Zaozhuang 277099， Shandong， China）

【Abstract】Objective To explore the biological function of PKP1 in skin cutaneous melanoma （SKCM）. Methods The relative expression of PKP1 in different tumors and normal tissues was analyzed by real-time TIME 2.0 database. The expression of PKP1 in cutaneous melanoma tissues and normal tissues was analyzed by GEPIA and UALCAN databases， and the relationship between the expression level of PKP1 and the prognosis of tumor patients was explored. In SK-MEL-1 cell line， the effect of overexpression of PKP1 on tumor cells was explored. Results TIME 2.0 analysis showed that the expression level of PKP1 in various tumor tissues was lower than that in normal tissues （P<0.05）， while the expression level of PKP1 in cholangiocarcinoma， liver cancer and renal clear cell carcinoma was higher than that in normal tissues （P<0.05）. The GEPIA database showed that the expression level of PKP1 in normal tissues was higher than that in skin melanoma tissues （P<0.05）. The protein level of PKP1 in PKP1 overexpression group was higher than that in NC group （P<0.05）. The OS index of PKP1 high expression group was better than that of low expression group （P<0.05）. CCK8 assay showed that the OD value of PKP1 overexpression group was statistically significant compared with that of empty plasmid group （P<0.01）. Conclusion PKP1 is lowly expressed in cutaneous melanoma， and its down-regulation is related to poor prognosis. Meanwhile， PKP1 can inhibit the proliferation of cutaneous melanoma cells， and has the potential to become a key gene for targeted therapy.

【Key words】Skin cutaneous melanoma； PKP1； Survival time； Cell proliferation； Targeted therapy

皮膚黑色素瘤（skin cutaneous melanoma，SKCM）作為一種常見的皮膚惡性腫瘤，其發生于表皮基底層的黑色素細胞，具有極易侵襲和轉移的生物學特點[1，2]。正是由于癌細胞惡性程度較高，使得癌癥的進程發展迅速，很多患者確診時已經是中晚期，失去了手術治療的最佳時機。因此，針對皮膚黑色素瘤有著較高的發病率以及致死率這些問題，臨床需要去發現一些有價值的腫瘤標志物以及有效的治療靶點用于癌癥的診斷以及治療。Plakophilin-1（PKP1）是armrepeat（armadillo）和plakophilin基因家族的成員，它是橋粒的重要組成部分。從既往的研究發現[3]PKP1的異常表達和許多癌癥的進程有關，比如，在肺癌中，PKP1 發揮了腫瘤抑制因子的角色，其蛋白表達可作為晚期肺癌患者的潛在預后標志物；在乳腺癌中，miR-328a/Pkp1信號通路參與了乳腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲過程[4]；PKP1在食管癌中，其表達水平與癌癥分級呈負相關，它有作為腫瘤標志物的潛力預測病人的預后[5]。但是PKP1在皮膚黑色素瘤中的相關作用并未見明確報道，本研究旨在利用TCGA數據庫對于PKP1在皮膚黑色素瘤的是否涉及相應的生物學作用進行探究。

1 材料與方法

1.1 不同腫瘤中PKP1表達水平的探究 利用TIMER 2.0數據庫在不同的腫瘤組織和正常組織中PKP1的表達水平進行了分析，旨在初步探究PKP1在不同癌種中的表達情況。

1.2 方法

1.2.1皮膚黑色素瘤組織和正常組織中的PKP1的表達差異 首先利用GEPIA數據庫（數據源于TCGA和GTEx數據庫），單獨探究PKP1在皮膚黑色素瘤和正常組織中的表達水平是否具有差異，其中分析時參數|Log2FC|Cutoff值為1，p-value Cutoff值小于0.01；為了更全面探究PKP1在組織中的表達情況，利用UALCAN數據庫（多用于探究目標基因以及確定腫瘤亞群特異性候選生物標志物），探究在原發性癌組織以及轉移性癌組織中PKP1的表達情況，旨在分析對于PKP1在不同病理因素下皮膚黑色素瘤中 PKP1是否具有差異表達。

1.2.2 PKP1的表達水平 對于腫瘤病人預后的影響 利用GEPIA 2數據庫，探究目的基因PKP1的表達水平是否和皮膚黑色素瘤患者的預后產生影響，主要觀察的指標包括總生存時間（Overall Survival）以及無復發生存時間（Recurrence free survival）。

1.2.3細胞的培育和轉染 利用SK-MEL-1細胞（人皮膚黑色素瘤細胞）進行細胞的培養（培養液：MEM+10%FBS+1%P/S；培養條件：37 ℃，5%CO2）；PKP1過表達質粒和陰性對照（NC），質粒的構建由蘇州吉瑪基因公司完成。

1.2.4蛋白表達水平的測定 為了檢測轉染的效率，應用免疫印記實驗進行不同處理組細胞蛋白水平的檢測，待細胞密度生長至 80% 以上，用預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗細胞3次，用蛋白裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白并計算蛋白濃度，調整兩組細胞間總蛋白濃度均等。經聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、抗體免疫反應、化學發光、成像。

1.2.5 CCK8實驗對于SK-MEL-1細胞增殖能力的調控作用 通過CCK8實驗進行檢測，按照CCK8試劑說明書的要求，對照組和過表達組細胞均分別在12、24、36、48、60 h 5個時間點進行檢測，CCK8試劑加樣10微升進入每個檢測空，避光孵育2 h后上樣檢測，在450 nm波長處測 OD值。

1.3 統計學方法 不同組織之目的基因的表達量的差異使用配對t檢驗，數據分析用mean+SD表示，患者的生存差異、生存曲線繪制分別使用log-rank檢驗和K-M法。

2 結果

2.1 PKP1在多種腫瘤組織中異常表達 TIME 2.0分析顯示，在多種腫瘤，如卵巢癌（BRCA），腎嫌色細胞癌（KICH），以及腎乳頭狀細胞癌（KIRP）等腫瘤組織中PKP1的表達水平低于正常組織（P<0.05）；而在膽管癌（CHOL），肝癌（LIHC）以及腎透明細胞癌（KIRC）等腫瘤中PKP1的表達水平高于正常組織（P<0.05），見圖1。

2.2 皮膚黑色素瘤組織中PKP1的表達差異 GEPIA數據庫分析結果顯示，正常組織中，PKP1的表達水平高于皮膚黑色素瘤組織（P<0.05）。

2.3 PKP1高表達的患者總生存時間更長 將黑色素瘤的患者分為PKP1高表達組以及PKP1低表達組，以OS作為觀察的指標，結果顯示PKP1高表達組優于低表達組（P=0.00031），見圖3。

2.4 PKP1過表達后蛋白水平的驗證 過表達PKP1后，通過蛋白水平對于NC組細胞和過表達PKP1組細胞的驗證顯示，PKP1過表達組PKP1蛋白水平高于NC組，見圖4。

2.5 PKP1抑制SK-MEL-1的增殖 CCK8實驗顯示，過表達PKP1后，PKP1過表達組與空質粒組細胞OD值相比，差異顯著（P<0.01），見圖5。

3 討論

皮膚黑色素瘤是皮膚腫瘤中常見的惡性腫瘤之一，目前皮膚黑色素瘤的患病率仍處于明顯的上升趨勢[6，7]。當下對于皮膚黑色素瘤的治療，外科手術仍是使得患者獲得長期生存的最有效治療手段。但是由于皮膚黑色素瘤惡性程度較高，相當一部分患者不再具備手術切除的條件。因此，其他有效的治療方式對于癌癥患者的治療顯得尤為重要。隨著靶向治療的興起，針對特定靶基因，可以達到延緩癌癥的進展甚至有可能達到癌癥治愈的結局[8，9]。而PKP1作為靶向治療研究的目的基因，在其他癌癥中，已經顯示出了巨大的研究潛力。有學者在鱗狀細胞肺癌中研究發現[10]，通過CRISPR-Cas9技術敲除細胞中的PKP1，可以有效地抑制癌細胞的增殖，因此PKP1有作為肺癌中治療的一個靶點進行相關研究的潛力；同時國外的學者研究發現[11]，PKP1在前列腺癌中類似抑癌基因，在癌細胞中敲低PKP1的表達，降低了細胞的凋亡率，從而導致了癌癥的進展；另外有研究發現[12]，在頭頸部鱗狀細胞癌中，PKP1的表達水平在癌癥中高表達，體現出致癌基因的作用；由此說明PKP1在多種癌癥中可發揮著重要的生物學功能，因此其作為一個有效的治療靶點，具有很大的研究潛力。而關于PKP1在皮膚黑色素瘤中的作用并未深入探究，因此本研究主要針對PKP1是否有潛力在皮膚黑色素瘤中作為治療的靶點進行相關的探索。

本研究結果顯示，PKP1不僅在多種癌癥中表達水平異常，而且在皮膚黑色素瘤中，其癌組織中PKP1的表達水平明顯低于正常組織，這些結果說明了高表達的PKP1在皮膚黑色素瘤中，有可能扮演著抑癌基因的角色，從而抑制了癌癥的進展。此外，TCGA數據進行患者的生存分析也印證了這一點，高表達組PKP1的患者其生存時間長于低表達組患者，提示PKP1完全有可能成為一個有效的腫標志物指導皮膚黑色素瘤患者的預后[13-15]。而且通過細胞實驗，進一步證實了PKP1的異常表達和腫瘤的增殖水平密切相關。

綜上所述，PKP1在皮膚黑色素瘤中有作為腫瘤標志物有指導患者預后的可能，且實驗過程體現了PKP1有作為關鍵靶點的研究價值，通過針對PKP1進行靶向治療，對于今后皮膚黑色素瘤的治療提供了研究線索。

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編輯 柴泛宇