hUC-MSCs對大鼠膝骨軟骨缺損的修復作用

程 剛,張 峰,吳玉嬌,袁曉陽,徐 靚,王 康,魏 偉,嚴尚學

關節軟骨受損作為骨關節炎最常見的危險因素之一,通常是由于磨損或損傷而導致[1]。關節軟骨作為一種高度分化的組織,自我修復能力有限[2]。軟骨缺損大多是無癥狀的,如果不能及時發現并治療通常會逐漸加重為骨關節炎[3]。傳統的治療方法包括微骨折、自體軟骨細胞移植等。雖然取得了一些成功,但存在一定的局限性阻礙其臨床應用[4]。

間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)療法在許多研究和臨床試驗中顯示出良好的治療效果[5-6]。MSCs因其多系分化潛能和免疫調節能力而成為軟骨再生的可替代細胞來源。MSCs可以從各種組織中分離出來,包括人的臍帶[7]等。人臍血源性間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)具有細胞采集無創、免疫原性低的優點,提供足夠的細胞作為細胞治療的異體來源[8]。盡管MSCs及其在基于細胞的再生醫學中的應用的信息越來越多,但MSCs在軟骨修復中的作用和機制仍不清楚[9]。該實驗以膝骨軟骨缺損大鼠模型為對象,觀察關節腔移植hUC-MSCs對軟骨修復的作用,為臨床治療關節軟骨缺損提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性SPF級10周齡SD大鼠,體質量約280～320 g,購自斯貝福(北京)生物科技有限公司,合格證號:SCXK(京)2019-0100,用于制備關節軟骨缺損模型。雄性SPF級SD大鼠,體質量約120 g,安徽省實驗動物中心提供,合格證號:SCXK(皖)2017-001,用于制備關節軟骨細胞。本實驗已通過安徽醫科大學臨床藥理研究所動物實驗倫理審查委員會批準(編號:PZ-2020-044)。

1.2 細胞與試劑hUC-MSCs(批號:NCM1912P3)由安徽中盛溯源生物科技有限公司提供,實驗前均進行表型鑒定、計數和活力檢查。兔抗Ⅰ型膠原(CollagenⅠ, Col Ⅰ)抗體購自美國Affinity公司;兔抗Ⅱ型膠原(Collagen Ⅱ, Col Ⅱ)抗體、兔抗性別決定區域Y相關的高遷移率族框9抗體(SRY-box transcription factor 9, SOX9)購自美國Abcam公司,;兔抗增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)抗體購自美國CST公司;Ⅱ型膠原酶購自美國Sigma公司。

1.3 主要儀器激光共聚焦成像顯微鏡(型號:Leica TCS SP8;德國Leica公司);玻片掃描儀(型號:Pannoramic MIDI;匈牙利3D公司);高內涵細胞成像系統(型號:ImageXpress Micro 4;美國Molecular Devices公司 )。

1.4 實驗方法

1.4.1SD大鼠膝骨軟骨缺損模型建立 舒泰(50 mg/kg)麻醉后,大鼠取仰臥位,以膝關節為中心備皮及局部消毒。手術布蓋住手術部位,沿髕骨內側作縱向切口,鈍性分離避免出血。向外側擠壓髕骨,將髕骨外側脫位,暴露膝關節面后,用電鉆在股骨表面軟骨的滑車槽中造成一個直徑2 mm,深度2 mm的缺損。生理鹽水沖洗殘渣。髕骨復位后閉合關節腔,縫合股內側肌和皮膚。假手術組大鼠僅打開關節腔即縫合。術后每日青霉素20萬單位肌注以防感染,持續3 d。

1.4.2分組及給藥 造模后1周將模型大鼠隨機分為模型組和hUC-MSCs移植組,每組8只,hUC-MSCs移植組大鼠經麻醉后手術側關節腔注射2×106個hUC-MSCs/50 μl;假手術組另取8只大鼠行假手術,假手術組及模型組注射50 μl生理鹽水作為對照。給藥后10周處死大鼠觀察組織修復情況。

1.4.3軟骨細胞的分離培養 超凈臺內手術刀片輕削大鼠膝關節軟骨,使用無菌眼科剪將關節軟骨剪碎成約為1 mm3的碎片,加入0.2%ColⅡ于6.5 cm2小皿中,置于37 ℃培養箱中過夜消化,結束后加入新鮮完全培養基終止消化并吹散混勻,40 μm濾器濾除未消化殘渣后離心,加入完全培養基重懸后接種于培養瓶中,48 h后首次換液。待細胞長滿后進行傳代處理,實驗選用第二代軟骨細胞進行后續實驗。

1.4.4軟骨細胞的鑒定 甲苯胺藍染色和ColⅡ免疫細胞化學染色鑒定軟骨細胞。細胞接種于爬片,待細胞貼壁后取出爬片,4%多聚甲醛固定20 min,3%過氧化氫室溫下孵育10 min,5%山羊血清封閉10 min,滴加ColⅡ一抗4 ℃過夜孵育。復溫后滴加生物素標記的二抗室溫孵育30 min。DAB顯色,蘇木精復染,梯度乙醇脫水,中性樹脂封片。倒置相差顯微鏡觀察拍照。軟骨細胞固定后用甲苯胺藍染色5 min,梯度乙醇脫水后中性樹脂封片。

1.4.5hUC-MSCs對大鼠軟骨細胞的增殖和遷移作用 Transwell小室共培養檢測hUC-MSCs對軟骨細胞的增殖和遷移作用。增殖實驗:將消化后的軟骨細胞接種于24孔板,每孔5×104個細胞,Transwell小室插入孔板中,等量hUC-MSCs接種于小室內;分別共培養24、48、72 h后取出,4%多聚甲醛固定20 min,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)避光孵育5 min后,使用高內涵細胞成像系統觀察計數。遷移實驗:下室接種5×104個hUC-MSCs,上室接種等量大鼠軟骨細胞,上下室均為10%FBS完全培養基環境;共培養20 h后取出小室,加入0.1%結晶紫溶液,染色15 min,PBS清洗,顯微鏡下觀察拍照。

1.4.6大鼠軟骨缺損大體形態學觀察 關節腔注射藥物10周后,麻醉處死大鼠,取缺損側股骨滑車,去除周圍軟組織,進行大體形態學觀察。采用國際軟骨修復協會(the International Cartilage Repair Society, ICRS)的大體評估標準進行評分[10],比較hUC-MSCs關節腔注射對膝關節軟骨缺損的修復效果。

1.4.7病理學檢查 軟骨組織經10%甲醛室溫固定后,脫鈣、石蠟縱向包埋、切片后分別進行HE染色、番紅O-固綠染色和Masson染色,鏡下觀察組織病理學變化。

1.4.8免疫組織化學檢測ColⅠ、ColⅡ、PCNA在軟骨組織中的表達水平 切片經烘烤、二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后,分別用Triton X-100通透、枸櫞酸熱修復抗原、3%過氧化氫內源性阻斷和5%山羊血清封閉后,一抗4 ℃孵育過夜,次日復溫后加二抗室溫孵育30 min,DAB顯色和蘇木精復染后梯度乙醇脫水,中性樹脂封片,波掃儀掃描玻片。

1.4.9免疫熒光檢查軟骨組織中SOX9表達 切片脫蠟水化后分別Triton X-100通透、枸櫞酸熱修復抗原、3%過氧化氫內源性阻斷、5%山羊血清封閉,一抗4 ℃過夜孵育。次日復溫后滴加熒光二抗室溫避光孵育2 h,DAPI孵育10 min,PBS清洗后倒置于滴加抗熒光淬滅劑的載玻片上,指甲油固定,激光共聚焦成像顯微鏡下觀察軟骨組織中SOX9的表達。

2 結果

2.1 大體觀察假手術組動物關節滑車表面整齊,色澤鮮亮;模型組動物存在明顯凹陷,低于正常軟骨組織高度,邊界融合度差,軟骨表面修復處存在明顯裂紋,軟骨透明度較差。hUC-MSCs移植組缺陷處高度與周圍正常軟骨厚度相近,邊界融合度較好,修復的軟骨表面較光滑,多已被半透明或白色的修復組織填充(圖1)。對修復組織通過ICRS評分標準進行評估,模型組的ICRS評分低于假手術組[(6.25±1.17)vs(12.00±0.00),F=6.05,P<0.01]。hUC-MSCs移植組的ICRS評分為(9.75±1.59),高于模型組的(6.25±1.17)(F=52.24,P<0.01)。

圖1 軟骨缺損組織再生大體觀察(n=8) A:假手術組;B:模型組;C:hUC-MSCs移植組

2.2 hUC-MSCs移植對軟骨缺損組織病理的影響對大鼠軟骨缺損組織切片進行病理學檢查,觀察各組大鼠缺損組織的病理改變。HE結果顯示,hUC-MSCs移植組關節軟骨高度接近周圍正常軟骨水平,修復組織的整體輪廓與正常軟骨相似,細胞形態和排列與周圍正常軟骨相似。而模型組細胞形態和排列與周圍正常軟骨不同,缺損部位填充較差(圖2 A1～A3)。番紅O-固綠染色結果顯示,在假手術組中組織染色程度高,紅色軟骨組織明顯。hUC-MSCs移植組與模型組相比顯示出番紅O的強陽性染色,表明hUC-MSCs移植組修復組織含有更多的蛋白多糖沉積,軟骨修復效果較于模型組更完整(圖2 B1～B3)。Masson染色結果顯示,hUC-MSCs移植組相較于模型組,修復組織中藍染更明顯,膠原纖維含量更豐富,接近于假手術組(圖2 C1～C3)。

圖2 hUC-MSCs移植對軟骨缺損組織病理的影響 ×50A:HE染色;B:番紅O-固綠染色;C:Masson染色;1:假手術組;2:模型組;3:hUC-MSCs移植組

2.3 hUC-MSCs對軟骨缺損組織ColⅠ、Col Ⅱ和PCNA表達的影響進行免疫組織化學染色以進一步表征軟骨缺損中的修復組織。免疫組化結果顯示,各組組織中Col Ⅰ、Col Ⅱ的表達水平差異有統計學意義(F=79.25,F=65.03,P<0.01)。與假手術組相比,模型組Col Ⅱ蛋白表達水平降低(P<0.01),而ColⅠ蛋白表達水平升高(P<0.01)。與模型組比較,hUC-MSCs移植可升高Col Ⅱ的表達(P<0.01),降低ColⅠ的表達水平(P<0.01),但與假手術組的天然軟骨相比仍有差距(P<0.01)(如圖3A1～B3)。免疫組化結果顯示,各組組織中PCNA的表達水平差異有統計學意義(F=57.60,P<0.01)。與假手術組相比,模型組中PCNA陽性細胞數量增加(P<0.05)。與模型組比較,hUC-MSCs移植組中PCNA陽性細胞顯著增多(P<0.01),見圖3 C1～C3。

圖3 hUC-MSCs對缺損組織Col Ⅰ、Col Ⅱ和PCNA表達的影響 ×400A:Col Ⅰ染色;B:Col Ⅱ染色;C:PCNA染色;D:免疫組化陽性細胞表達率統計圖;1:假手術組;2:模型組;3:hUC-MSCs移植組;與假手術組比較:*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較:##P<0.01

2.4 hUC-MSCs對軟骨缺損組織中SOX9表達的影響免疫熒光檢查結果顯示,各組組織中SOX9表達水平差異有統計學意義(F=71.27,P<0.01)。假手術組中SOX9主要在細胞核內表達,模型組中SOX9則主要分散在核周圍,表達水平低于假手術組,而hUC-MSCs移植組SOX9表達水平高于模型組(P<0.01),表明hUC-MSCs移植可促進SOX9入核增加。見圖4。

圖4 hUC-MSCs對軟骨缺損組織中SOX9表達的影響 ×400A:假手術組;B:模型組;C:hUC-MSCs移植組;D:SOX9表達統計圖;1:DAPI染色;2:SOX9染色;3:染色合并圖;與假手術組比較:**P<0.01;與模型組比較:##P<0.01

2.5 軟骨細胞形態學觀察及鑒定經膠原酶消化分離得到的原代軟骨細胞形態貼壁后成卵圓形或多角形,細胞可見成簇狀。軟骨細胞經甲苯胺藍染色后可見細胞內藍色顆粒,Col Ⅱ染色后,細胞胞質呈褐色陽染,陽性細胞率約為97%,見圖5。

圖5 大鼠軟骨細胞形態及鑒定 ×100A:大鼠軟骨細胞形態;B:Col Ⅱ染色;C:甲苯胺藍染色

2.6 hUC-MSCs體外共培養對軟骨細胞增殖的影響體外以hUC-MSCs和軟骨細胞分別為1 ∶1、1 ∶5、1 ∶10的比例進行共培養,結果顯示,1 ∶1共培養可顯著促進軟骨細胞增殖且增殖效果最好(t=16.37,P<0.01),后續選用1 ∶1進行實驗(圖6 D)。以1 ∶1的比例進行共培養以檢測24、48、72 h不同時間hUC-MSCs對軟骨細胞增殖能力的影響,DAPI染色結果顯示,共培養條件下hUC-MSCs在不同時間對軟骨細胞的增殖作用都有所增強,且72 h下增殖效果最明顯(t=8.11,P<0.01)(圖6 E)。

圖6 hUC-MSCs體外共培養對軟骨細胞增殖的影響(n=3) ×10A:24 h組;B:48 h組;C:72 h組;D:不同共培養比例對軟骨細胞增殖能力影響統計圖;E:不同共培養時間對軟骨細胞增殖能力影響統計圖;1:對照組;2:共培養(1 ∶1)組;a:對照組;b:共培養(1 ∶1)組;c:共培養(1 ∶5)組;d:共培養(1 ∶10)組;與對照組比較:*P<0.05,**P<0.01

2.7 hUC-MSCs體外共培養對軟骨細胞遷移的影響Transwell小室檢測hUC-MSCs對軟骨細胞遷移的影響,結晶紫染色后顯微鏡下觀察可見,與對照組相比,軟骨細胞遷移明顯增多,通過對遷移細胞計數,統計作圖分析可得hUC-MSCs共培養后軟骨細胞的遷移能力增強,差異有統計學意義(t=11.37,P<0.01)。見圖7。

圖7 hUC-MSCs體外共培養對軟骨細胞遷移的影響(n=3) ×200A:對照組;B:共培養組;C:細胞遷移統計圖;與對照組比較:**P<0.01

3 討論

正常情況下關節軟骨細胞處于相對靜息狀態,當軟骨發生損傷時,軟骨細胞大量丟失,軟骨基質發生降解[10]。關節軟骨損傷進一步加重發生退行性變化,特征表現為蛋白多糖含量減少和膠原基質降解[11]。目前,臨床上對軟骨缺損治療尚無有效的手段,再生醫學的最新進展啟發人們可以利用宿主的先天再生潛力來進行自我修復[12]。近年來,外源性植入MSCs,可通過旁分泌作用調節局部微環境以刺激宿主的先天再生活動,取得了一定的治療效果,但是其作用和相關機制仍不明確。在本研究中,hUC-MSCs膝關節腔注射10周可較完整地修復軟骨缺損部位,且缺損部位關節面較模型組光滑透明,無明顯裂紋,細胞形態和排列與周圍正常關節軟骨組織相似,番紅染色顯示的軟骨(紅色)厚度明顯增加,軟骨基質(藍色)填充明顯增多,ICRS評分顯著升高,提示hUC-MSCs移植對大鼠膝關節軟骨缺損具有明顯的修復作用。

ColⅠ和Col Ⅱ分別作為纖維軟骨和透明軟骨的主要標志物,可反應軟骨修復的程度和類型。免疫組化結果顯示,hUC-MSCs移植后ColⅠ表達降低,Col Ⅱ表達上升,提示hUC-MSCs移植修復的是透明軟骨而非纖維軟骨。由于軟骨無血管的特殊結構,以及軟骨細胞周圍致密的細胞外基質阻礙軟骨細胞運動,因此促進軟骨細胞的增殖和體內軟骨細胞的遷移對軟骨修復十分必要[13]。本研究中免疫組化結果顯示,hUC-MSCs移植組修復組織中PCNA陽性細胞數明顯增加,且hUC-MSCs體外共培養可促進軟骨細胞增殖與遷移,表明hUC-MSCs在體內外均可增加軟骨細胞遷移和增殖,這可能與hUC-MSCs通過旁分泌的方式促進靶細胞的增殖、增強募集從而增加軟骨細胞的數量有關[14]。有研究[15]表明,SOX9是激活軟骨細胞的特異性因子,作為軟骨形成的主要調節因子是軟骨形成所必需的,表達于正常軟骨細胞中。在本研究中免疫熒光結果顯示,hUC-MSCs移植后修復組織中SOX9的表達可顯著提高,且SOX9入核增加,表明hUC-MSCs可促進軟骨細胞SOX9的表達及入核,加速軟骨再生。

綜上所述,關節腔移植hUC-MSCs對大鼠膝關節軟骨缺損具有明顯的修復作用,其修復機制可能與保護軟骨基質和促進軟骨細胞增殖遷移有關。hUC-MSCs移植或可作為軟骨缺損再生的新途徑。