甘草酸介導miRNAs對大鼠酒精性肝損傷的保護作用

從美麗,馬依熱·努爾買賣提,周 蓓,陳瑞花,王 忠,朱虎虎,趙效國

酒精性肝損傷(alcoholic liver disease,ALD)又稱酒精性肝病,已成為一個全球性的健康問題[1]。酗酒是引起酒精性肝損傷的主要原因,長期大量飲酒會引起脂肪變性、脂肪性肝炎、肝硬化及終末期肝細胞癌[2]。甘草酸(glycyrrhizic acid,GL)是甘草的主要活性成分,具有保肝、抗氧化、抗炎、抗病毒、免疫調節和抗腫瘤作用,能增強肝臟的解毒功能,減輕肝臟損傷等藥理作用,在預防和治療酒精性肝病中已被應用[3]。然而,甘草酸治療酒精性肝損傷的分子機制及作用靶點仍有待闡明,該研究利用miRNA芯片技術檢測甘草酸在治療大鼠酒精性肝損傷過程中miRNA表達變化,探討其可能的作用機制和潛在的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑健康SPF級雄性SD大鼠45只,體質量180～220 g,新疆醫科大學實驗動物中心提供,合格證號:SCXK(新)2018-0002。在新疆醫科大學屏障環境實驗室中完成,合格證號:SYXK(新)2018-0003。56°牛欄山二鍋頭購于北京順鑫農業股份有限公司(批號:20160430);甘草酸購于上海麥克林生化科技有限公司。miRNeasy Mini Kit(貨號:271004)購于德國QIAGEN公司。miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit(貨號:KR211)購于天根生化科技(北京)有限公司;ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(貨號:Q712-02)購于南京諾唯贊生物技術股份有限公司。

1.2 模型制備將45只SD大鼠隨機分成甘草酸組、模型組和對照組,模型組每只大鼠按10 ml/(kg·d)的劑量白酒灌胃;甘草酸組在灌胃白酒的同時,每只按11.75 mg/(kg·d)的劑量,給予甘草酸灌胃;對照組每天給予同等劑量的蒸餾水灌胃。持續灌胃8周后,所有大鼠禁食12 h,剖取肝臟,放入液氮中保存。

1.3 血清天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)及丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)測定使用獸用全自動生化分析儀(型號:BS-240VET,深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司),測定血清AST和ALT水平。

1.4 肝臟miRNA的提取取30 mg肝臟組織使用miRNeasy Mini Kit提取miRNA,抽提所得miRNA使用NanoDrop ND-2000分光光度計進行miRNA定量,并使用Agilent Bioanalyzer 2100進行miRNA質量檢測。miRNA質控標準為RIN >7且28S/18S >0.7。

1.5 芯片實驗采用Agilent Rat miRNA (8×15 K) V21.0芯片(design ID: 070154)(美國安捷倫公司)檢測甘草酸組和模型組大鼠肝臟中miRNA表達。對樣本中的miRNA分子進行熒光標記,在滾動雜交爐中進行芯片雜交,雜交完成后在洗缸中洗片。

1.6 GO注釋和KEGG通路分析利用基因本體(gene ontology,GO)數據庫(https://www.geneonto logy.org)對差異miRNA靶基因進行GO分類注釋,包括生物學過程、細胞組分、分子功能;利用KEGG Pathway(Kyoto Encyclopedia of genes and genomes)數據庫對差異miRNA靶基因進行信號通路分析。GO注釋及KEGG通路分析均以P<0.05作為顯著性富集標準。

1.7 差異miRNA-mRNA-Pathway調控網絡構建使用miRWalk預測軟件對差異miRNA進行靶基因預測,結合能大于等于28為篩選條件,之后將靶基因導入String數據庫計算蛋白質之間的互作關系,置信度≥0.4,degree大于1為篩選條件;同時聯合KEGG Pathway富集結果及String計算結果導入Cytoscape軟件中進行網絡可視化。

1.8 Real-time PCR實驗以U6為內參對挑選的差異miRNA進行實時熒光定量PCR實驗,根據miRNA序列設計特異性引物,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;使用miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit試劑盒將RNA反轉錄成cDNA;50 μl反應體系中加入上下游引物(10 μmol/L)各2 μl,ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 25 μl,cDNA 5 μl,補水至50 μl。反應條件為:95 ℃、5 min;95 ℃、15 s,60 ℃、1 min,共40個循環。采用ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

1.9 芯片數據分析芯片結果采用Agilent Microarray Scanner進行掃描,用Feature Extraction software 11.5讀取原始數據,質控合格的數據采用R包Quantile算法進行歸一化處理。采用t檢驗分析數據,通過P值和foldchange值對結果進行差異篩選和統計,本研究將P<0.05、foldchange≥1.5設定為顯著差異表達的閾值。

2 結果

2.1 甘草酸對大鼠酒精性肝損傷的影響大鼠連續灌胃乙醇后會導致肝臟損傷、脂肪變性,主要表現為血清AST和ALT水平升高,差異有統計學意義(t=11.366,P<0.05;t=7.784,P<0.05);甘草酸可改善乙醇引起的血清AST和ALT升高,差異有統計學意義(t=7.526,P<0.05;t=6.448,P<0.05)。見圖1。HE染色后,正常組肝臟結構清晰,邊界清楚;模型組有明顯的肝細胞脂肪變性,部分肝細胞腫脹、變性壞死,有少量炎性細胞浸潤,細胞核固縮;甘草酸組病理改變明顯減少,部分損傷細胞得到修復,肝臟組織結構與正常組比較無明顯差異。見圖2。提示本研究造模成功,且甘草酸保護效果明顯,可用于miRNA基因芯片分析。

圖1 甘草酸對大鼠血清AST和ALT水平的影響A:血清AST水平;B:血清ALT水平;與正常組比較:**P<0.01

圖2 各組大鼠肝臟組織形態 HE染色 ×100A:正常組;B:模型組;C:甘草酸組

2.2 差異表達miRNA分析以P<0.05,foldchange≥1.5為差異篩選標準,對甘草酸組和模型組間差異表達miRNA進行篩選,芯片分析結果顯示,甘草酸組顯著差異表達miRNA有13個,其中表達上調的有10個,下調的有3個,上調的miR-295-5p、miR-292-5p、miR-190b-5p和miR-291b,下調的miR-107-3p、miR-181b-1-3p差異較為顯著。見表1。圖3展示了甘草酸組與模型組之間差異表達miRNA聚類圖。

表1 差異表達miRNA信息表

圖3 甘草酸組與模型組差異miRNA的聚類圖M_1、M_2、M_3: 模型組;G_3、G_1、G_2: 甘草酸組

2.3 差異miRNA GO富集分析使用miRWalk對差異miRNA進行靶基因預測,結合能≥28的靶基因共有913個。為更好地了解差異miRNA可能參與的生物學功能,對這些靶基因進行GO富集分析。結果顯示差異表達miRNA主要與細胞黏附、抗氧化活性、代謝過程、生物過程調控、細胞殺傷、免疫系統等功能相關。圖4展示了差異miRNA靶基因參與的GO功能。

圖4 差異miRNA參與的GO條目

2.4 差異miRNA Pathway富集分析為進一步探討甘草酸在治療酒精性肝損傷病變過程中所涉及的信號通路,對差異miRNA靶基因進行了KEGG Pathway富集分析。結果顯示,以P<0.05為顯著標準,共有108個信號通路被顯著富集,主要涉及MAPK信號通路、mTOR信號通路、Ras信號通路、Hippo信號通路、PI3K-Akt信號通路、wnt信號通路、FoxO信號通路、細胞凋亡、癌癥等信號通路。圖5列出了差異miRNA靶基因參與的部分信號通路。

圖5 差異miRNA參與的部分信號通路

2.5 差異miRNA-mRNA-Pathway網絡構建通過String數據庫在線分析差異miRNA靶基因編碼蛋白質間的相互作用關系,同時聯合KEGG Pathway富集分析結果進行關聯分析,結果顯示:有12個miRNA與肝損傷相關通路有關聯,見圖6。從圖中可以看出:miR-615、miR-107-3p、miR-292-5p位于網絡中心樞紐,為甘草酸治療酒精性肝損傷的關鍵miRNA;同時,MAPK信號通路、mTOR信號通路、PI3K-Akt信號通路、Ras信號通路、Hippo信號通路、凋亡信號通路為關鍵信號通路,參與多個miRNA及相關靶基因的調控。

圖6 差異miRNA-mRNA-Pathway調控網絡

2.6 熒光定量PCR分析選取4個miRNA,其中上調miRNA 2個,為miR-295-5p、miR-292-5p;下調miRNA 2個,分別為miR-107-3p、miR-615,以U6為內參,對其進行熒光定量PCR驗證分析。qPCR結果顯示以上4個miRNA在甘草酸組與模型組間表達變化模式與miRNA芯片結果一致(圖7),表明該研究利用miRNA芯片檢測獲得的差異miRNA結果是準確可信的。

圖7 差異miRNA的qRT-PCR結果

3 討論

ALD仍然是全球發病和死亡的主要原因,更是我國嚴重的健康問題。甘草酸具有抗炎、抗氧化、免疫調節、抗病毒和抗腫瘤作用,同時具有心臟包含和神經保護作用,在治療許多疾病方面具有巨大的應用潛力[4];已被應用于肝病、皮膚炎癥性疾病、淋巴樣惡性腫瘤、新冠病毒等疾病治療中[5-7]。盡管甘草酸已被作為預防和治療ALD的替代方案,但具體的分子機制及作用靶點并不是很清楚。本研究通過檢測甘草酸組和模型組肝臟miRNAs變化,探討miRNA在甘草酸治療酒精性肝損傷過程中發揮的作用及調控的通路,了解甘草酸作用的具體分子機制和靶點。

miRNA是一類非編碼單鏈小RNA,可以通過促進靶基因降解或抑制翻譯調控靶基因表達[8]。miRNA幾乎參與了人類所有的生理和病理過程,如細胞分化和增殖、代謝、炎癥、信號轉導、免疫、腫瘤發生等;miRNA越來越被認為是各種疾病發病機制的關鍵分子,并且是疾病診斷或治療的潛在生物標志物[9];但miRNA在甘草酸治療大鼠酒精性肝損傷過程的作用機制并不明確。為進一步明確甘草酸在治療大鼠酒精性肝損傷過程中miRNA的潛在作用機制及作用靶點,通過甘草酸灌胃治療酒精性肝損傷,并使用miRNA芯片對肝組織檢測分析,發現甘草酸組較模型組存在13個差異miRNA,說明miRNA在甘草酸治療大鼠酒精性肝損傷過程中有著重要作用,是甘草酸引起的多個miRNA異常表達或失活的復雜生物學過程。

差異表達miRNA中的miR-107已證實在ALD患者肝臟中miR-107表達增加,但在健康肝臟或病毒性肝炎受試者中卻沒有增加[10];在甘草酸組中miR-107表達下降,提示甘草酸可使miR-107表達恢復,進而保護肝臟損傷。乙醇和LPS可以使let-7表達下調進而激活肝星狀細胞,而肝星狀細胞在肝纖維化發展中起著重要作用,該研究表明甘草酸可以使let-7表達上調。miR-181-3p通過調控通過TLR4-NF-κB途徑的信號傳導,增加脂多糖敏感性,進而調控酒精對小鼠的肝損傷[11]。miR-122也已經被證實與酒精性肝損傷、肝纖維化的進展有著密切聯系[12]。miR-291b可以通過調控靶標Tollip抑制NF-κB信號通路,導致更多的肝臟炎癥[13]。miR-615已被證實在肝癌、惡性膠質瘤、淋巴瘤等多種腫瘤組織找那個異常表達,與腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等存在密切關系[14]。這些miRNA在甘草酸治療酒精性肝損傷過程發生變化,說明他們在甘草酸治療酒精性肝損傷過程中發揮著重要作用。

GO富集分析顯示,差異miRNA主要與細胞黏附、抗氧化活性、代謝過程、生物過程調控、細胞殺傷、免疫系統等功能相關。乙醇可以增加活性氧的產生和脂質過氧化,同時增加肝細胞的氧化應激,并誘導細胞凋亡,在ALD發病和發展中起著重要作用[15];研究提示甘草酸和這些生物功能相關。甘草酸治療酒精性肝損傷的過程涉及復雜的基因調控網絡的改變,本研究使用了蛋白互作網絡結合KEGG信號通路聯合分析甘草酸在治療肝損傷過程中miRNA調控網絡的變化,更加清晰展示miRNA-靶基因-信號通路之間的調控關系及程度。從差異miRNA中篩選出了miR-615、miR-107-3p、miR-292-5p關鍵節點miRNA,以及MAPK信號通路、mTOR信號通路、PI3K-Akt信號通路、Ras關鍵信號通路,提示甘草酸可能是通過這幾個關鍵miRNA和信號通路調控下游目標分子進而減輕肝臟損傷。

該研究探討了甘草酸在治療大鼠酒精性肝損傷過程中miRNA表達譜的變化,以及關鍵miRNA與信號通路的篩選,為ALD的靶向治療提供重要的理論依據。研究提示miR-615、miR-107-3p、miR-292-5p可通過MAPK信號通路、mTOR信號通路、PI3K-Akt信號通路、Ras等信號通路調控下游靶標進而減輕酒精性肝損傷,但具體的調控機制仍需進一步實驗驗證。