假單胞菌屬中新型IncpGRT1質(zhì)粒的遺傳特性及其潛在傳播風(fēng)險(xiǎn)

李昕悅,王 鵬,陳方舟,穆小飛,盧秀慧,賀家琪,鄭亞麗,周冬生,殷 喆

假單胞菌屬(Pseudomonas)屬于假單胞菌科(Pseudomonadaceae)假單胞菌目(Pseudomonadales),包含200多個(gè)亞種[1]。假單胞菌屬菌多為條件致病菌,對(duì)人和動(dòng)物均有致病性,并且有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性。細(xì)菌感染及耐藥率的上升,很大程度上與質(zhì)粒的傳播相關(guān)。質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外能自主復(fù)制的環(huán)狀DNA分子,可通過(guò)接合在細(xì)菌之間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移[2]。目前根據(jù)質(zhì)粒不相容性(plasmid incompatibility)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行分類的方法已經(jīng)非常普遍[3]。已報(bào)道的假單胞菌中的質(zhì)粒Inc群包括IncP-1至IncP-14、IncpRBL16等[4]。如今可以獲得的假單胞菌中的質(zhì)粒全序不斷增多,其中很多質(zhì)粒尚不能歸于現(xiàn)有的Inc群,給假單胞菌中質(zhì)粒的遺傳特性研究造成很大的困難。該研究采用生物信息學(xué)方法,為新的IncpGRT1型別的質(zhì)粒的保守性及多態(tài)性,以及該型別質(zhì)粒之間的演化關(guān)系提供了更深入的見(jiàn)解。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源與鑒定菌株15420352分離自湘雅醫(yī)院呼吸內(nèi)科的50歲肺部感染女性患者的尿液樣本。原始菌種記錄為惡臭假單胞菌。本研究對(duì)其16S rDNA基因擴(kuò)增測(cè)序進(jìn)一步確定菌種。

1.2 藥敏試驗(yàn)使用VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀對(duì)菌株15420352進(jìn)行藥敏MIC檢測(cè),依據(jù)美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)2020標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。

1.3 質(zhì)粒測(cè)序及組裝對(duì)菌株15420352進(jìn)行三代測(cè)序以獲得質(zhì)粒的完整序列,利用德國(guó)Qiagen公司的Ultra Clean? Microbial DNA Isolation kit(CAT.12224-250)試劑盒,提取惡臭假單胞菌15420352的基因組DNA。構(gòu)建均值約15 kb(片段大小10～20 kb)的DNA文庫(kù),通過(guò)PacBio RSII測(cè)序儀進(jìn)行三代測(cè)序。同時(shí),構(gòu)建均值約400 bp左右(片段大小150～600 bp)的雙端測(cè)序(paired-end)文庫(kù),通過(guò)HiSeq測(cè)序儀進(jìn)行二代測(cè)序。利用Proovread軟件通過(guò)短的片段校正PacBio長(zhǎng)的片段,校正過(guò)的PacBio片段通過(guò)HGAPv3.0(基因組覆蓋率100×)進(jìn)行拼接組裝,最終獲得惡臭假單胞菌15420352的完整染色體及質(zhì)粒序列。

1.4 質(zhì)粒的生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)分析獲得質(zhì)粒全序列以后,首先通過(guò)RAST2.0(https://rast.nmpdr.org/)初步預(yù)測(cè)質(zhì)粒的開(kāi)放閱讀框(ppen reading frame, ORF),利用Plasmidfinder2.1(https://cge.food.dtu.dk/services/PlasmidFinder/)確定質(zhì)粒的復(fù)制子基因,在此基礎(chǔ)上,利用Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)、ConservedDomains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)等進(jìn)行每個(gè)基因的功能注釋。利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)ResFinder(https://cge.food.dtu.dk/services/ResFinder/)和CARD(https://card.mcmaster.ca)對(duì)耐藥基因進(jìn)行篩查,ISfinder(https://www-is.biotoul.fr)、INTEGRALL(http://integrall.bio.ua.pt/)和TheTransposonRegistry(https://transposon.lstmed.ac.uk/tn-registry)對(duì)質(zhì)粒的外源插入?yún)^(qū)結(jié)構(gòu)進(jìn)行精細(xì)注釋。注釋列表完成后,利用Inkscape1.0繪制質(zhì)粒整體結(jié)構(gòu)圈圖、質(zhì)粒線性結(jié)構(gòu)比較圖和外源插入?yún)^(qū)線性結(jié)構(gòu)比較圖。

1.5 序列登錄號(hào)進(jìn)行全基因組測(cè)序后,得到質(zhì)粒p420352-strA序列,提交至GenBank,登錄號(hào)為MT074087。

2 結(jié)果

2.1 菌種鑒定及藥敏結(jié)果測(cè)定菌株15420352經(jīng)16S rDNA擴(kuò)增初步確定菌種,后將全基因組DNA序列與惡臭假單胞菌參考菌株KT2440(登錄號(hào):NC_002947.4)進(jìn)行平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ANI)比對(duì)分析(http://www.ezbiocloud.net/tools/ani),一般以95%做為判定是否為同一菌種的閾值,ANI值計(jì)算結(jié)果為96.99%,最終核定該株菌為惡臭假單胞菌。野生株對(duì)β-內(nèi)酰胺類、頭孢類、青霉烯類、喹諾酮類抗生素耐藥,對(duì)阿米卡星及四環(huán)素類抗生素敏感,見(jiàn)表1。

表1 15420352 MIC測(cè)定結(jié)果

2.2 IncpGRT1型質(zhì)粒遺傳特性

2.2.1測(cè)序質(zhì)粒p420352-strA及納入分析的質(zhì)粒概述 質(zhì)粒p420352-strA大小為153.6 kb,平均GC含量為56.67%,共預(yù)測(cè)得到174個(gè)開(kāi)放讀碼框,見(jiàn)圖1。本研究納入分析的質(zhì)粒共5個(gè),見(jiàn)表2,除上述本研究測(cè)序質(zhì)粒,另有截至2022年9月1日從GenBank中檢索到的4個(gè)質(zhì)粒,包括pGRT1、pZDHY414、pPp1290、pBYT5-2。這5個(gè)質(zhì)粒的復(fù)制子(replication)基因與repAIncpGRT1的同源性≥95%。且均包含IncpGRT1型質(zhì)粒的保守骨架結(jié)構(gòu)。由于不能歸于現(xiàn)有的Inc群,均屬于新的Inc型別IncpGRT1。pGRT1在惡臭假單胞菌DOT-T1E中被發(fā)現(xiàn),因?yàn)樵撡|(zhì)粒為最早測(cè)序的該型別質(zhì)粒,本研究將其作為IncpGRT1型質(zhì)粒的參考質(zhì)粒。每個(gè)質(zhì)粒都可分為骨架區(qū)和多個(gè)獨(dú)立的外源插入?yún)^(qū),外源插入?yún)^(qū)分別插入在不同的骨架區(qū)位點(diǎn)。

圖1 p420352-strA全序列示意圖最內(nèi)環(huán)表示GC偏移,向外和向內(nèi)分別表示G和C的相對(duì)含量G>C和G

表2 IncpGRT1型別質(zhì)粒的基本特征

2.2.2IncpGRT1型質(zhì)粒的骨架區(qū)比較分析 IncpGRT1型的5個(gè)質(zhì)粒的骨架區(qū)可進(jìn)一步分為與質(zhì)粒復(fù)制起始相關(guān)的區(qū)域,維持質(zhì)粒穩(wěn)定性相關(guān)的區(qū)域和接合轉(zhuǎn)移區(qū),見(jiàn)圖2。這5個(gè)質(zhì)粒>52%的骨架區(qū)的同源性>80%。此外,這些質(zhì)粒的的復(fù)制起始區(qū)各含有兩個(gè)編碼新型復(fù)制子的基因,除了上述主復(fù)制子repAIncpGRT1,均還含有一個(gè)輔復(fù)制子,為編碼Rep_3家族復(fù)制起始蛋白R(shí)epA的repA。IncpGRT1型質(zhì)粒的保守骨架結(jié)構(gòu)包括:repAIncpGRT1及其iterons(復(fù)制區(qū))、parAB(質(zhì)粒分割區(qū))、dtr2和幾個(gè)tra基因(接合轉(zhuǎn)移區(qū)),以及其他調(diào)控質(zhì)粒穩(wěn)定性相關(guān)的基因umuCD、mobD、dnaG等。其中,pBYT5-2與其他四個(gè)質(zhì)粒的骨架區(qū)差異最大,orf1260-to-orf390區(qū)是其獨(dú)有的骨架區(qū)結(jié)構(gòu),長(zhǎng)4.2 kb,該區(qū)域包括磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(phosphonate transport system,phnCDE)基因座位和脂多糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶(LPS export ABC transporter permease,lptGF)基因座位,是菌體內(nèi)重要的代謝相關(guān)基因。此外,pBYT5-2骨架區(qū)還發(fā)現(xiàn)了mod區(qū),該區(qū)有鉬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(molybdate ABC transporter,modABE)基因,這些基因均參與調(diào)控宿主關(guān)鍵的生理功能。p420352-strA和pZDHY414的同源性最強(qiáng),這兩個(gè)質(zhì)粒的差異只在于p420352-strA的骨架區(qū)存在一個(gè)orf1344-to-orf990區(qū)。

圖2 IncpGRT1質(zhì)粒序列線性比較圖箭頭表示基因,不同顏色代表不同的基因功能分類;陰影部分表示同源區(qū)域(核苷酸相似性>90%)

2.2.3質(zhì)粒外源插入?yún)^(qū) pGRT1的外源插入?yún)^(qū)包括一個(gè)4.7 kb長(zhǎng)的srp區(qū)和一個(gè)ISPa41,見(jiàn)圖3。srp區(qū)的兩端發(fā)現(xiàn)了Tn4653的殘余,Tn4653為Tn3家族轉(zhuǎn)座子。該區(qū)域內(nèi)的溶劑外排RND轉(zhuǎn)運(yùn)體外膜蛋白(solvent efflux RND transporter outer membrane subunit,srpABCS)基因,可以使菌體在高濃度有機(jī)溶劑如甲苯、苯乙烯和二甲苯的環(huán)境中具有高耐受能力,甚至生長(zhǎng)能力。推測(cè)這些與細(xì)菌環(huán)境適應(yīng)性相關(guān)的外排泵基因由移動(dòng)元件攜帶并進(jìn)入菌體中,導(dǎo)致該菌對(duì)甲苯的耐性增強(qiáng)。這一區(qū)域內(nèi)還發(fā)現(xiàn)有汞轉(zhuǎn)運(yùn)(mercuric transcriptional regulator,mer)基因,以及多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(escherichia coli multidrug transporter,emrE)基因。因此,質(zhì)粒攜帶的srp區(qū)在提高細(xì)菌耐藥性方面也發(fā)揮了很大作用。此外該區(qū)域另有插入序列ISPpu12、ISPa73、IS1382以及一個(gè)IS21家族IS殘余的插入。

圖3 pGRT1 srp區(qū)域箭頭指示基因,不同顏色標(biāo)示不同的基因功能分類

p420352-strA和pZDHY414的外源插入?yún)^(qū)主要為msr區(qū)(圖4)和一個(gè)單元轉(zhuǎn)座子Tn7498(圖5)。

圖4 p420352-strA和pZDHY414的msr區(qū)域箭頭表示基因,不同顏色代表不同的基因功能分類;陰影部分表示同源區(qū)域(核苷酸同源性>90%);Tn5393c的登錄號(hào)為AF262622

在這兩個(gè)質(zhì)粒的msr區(qū)中,發(fā)現(xiàn)了不完整的Tn6346成分,Tn6346為Tn3家族單元轉(zhuǎn)座子,由Tn5051的核心轉(zhuǎn)位模塊tnpA(轉(zhuǎn)座酶基因)-tnpR(解離酶基因)-res(重組位點(diǎn))和Tn501的mer區(qū)組成,該轉(zhuǎn)座子在其res位點(diǎn)被打斷為兩部分并發(fā)生了顛轉(zhuǎn),分別為該區(qū)域兩端的Tn6434的5′端片段和3′端片段。Tn5393c被發(fā)現(xiàn)插入到該區(qū)域中,Tn5393c也是Tn3家族的單元轉(zhuǎn)座子,其包含兩個(gè)鏈霉素類耐藥基因strA和strB。該區(qū)域中還發(fā)現(xiàn)了肽甲硫氨酸亞砜還原酶(peptide methionine sulfoxide reductase,msrAB)基因,比對(duì)結(jié)果注釋為毒力因子。其他的移動(dòng)元件ISPst3、ISPa60和ISPa141也在該區(qū)域中被發(fā)現(xiàn)。

Tn7498是本研究新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)Tn5053亞家族的單元轉(zhuǎn)座子,Tn5053為Tn7家族轉(zhuǎn)座子。最初在黃單胞菌屬W17中被發(fā)現(xiàn),其骨架區(qū)核心轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)為tniABQR。Tn7498插入到質(zhì)粒骨架區(qū)基因orf588上游的87 bp處,并產(chǎn)生了5 bp的正向重復(fù)序列(direct repeats, DRs)。Tn7498未發(fā)現(xiàn)其參考元件Tn5053中的mer區(qū)。

3 討論

假單胞菌廣泛分布在世界各地的各種環(huán)境中,并且質(zhì)粒在假單胞菌中普遍存在。質(zhì)粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移不僅在抗生素耐藥基因的傳播中發(fā)揮重要作用,還在微生物降解途徑和毒力因子傳播中發(fā)揮重要作用。為探究假單胞菌屬中新型IncpGRT1質(zhì)粒的遺傳特性,本研究對(duì)5個(gè)IncpGRT1質(zhì)粒進(jìn)行了全面的比較基因組學(xué)分析。揭示了該型別質(zhì)粒介導(dǎo)假單胞菌產(chǎn)生耐藥性和致病性的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

目前該類質(zhì)粒僅被發(fā)現(xiàn)在假單胞菌中傳播(搜索截止日期為2022年9月1日),并且這些宿主菌在臨床和環(huán)境中均有分布。本研究中的5個(gè)質(zhì)粒有3個(gè)來(lái)自惡臭假單胞菌,1個(gè)來(lái)自黃褐假單胞菌,1個(gè)來(lái)假單胞屬菌。其中,菌株1290分離時(shí)間最早,1985年分離自美國(guó)的環(huán)境樣本[5],據(jù)此推測(cè)該類質(zhì)粒最初來(lái)自于環(huán)境。

通過(guò)對(duì)IncpGRT1型質(zhì)粒的比較基因組學(xué)分析,更深層次地了解了該型別質(zhì)粒的保守性以及多樣性。該類質(zhì)粒基因組均發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)復(fù)制子,其中repAIncpGRT1上游發(fā)現(xiàn)了8個(gè)重復(fù)的正向序列iterons,該序列在調(diào)控質(zhì)粒DNA復(fù)制中起重要作用。5個(gè)質(zhì)粒包含至少3種主要的外源插入?yún)^(qū):srp區(qū)域、msr區(qū)域以及Tn7498。外源插入?yún)^(qū)增加了這一類質(zhì)粒序列的多樣性。復(fù)雜的轉(zhuǎn)座機(jī)制是這些外源插入?yún)^(qū)形成的主要原因。

IncpGRT1型質(zhì)粒已經(jīng)成為一些耐藥基因以及毒力基因在假單胞菌屬中積累和傳播的重要載體。在這些質(zhì)粒的外源插入?yún)^(qū)中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了2類已知的抗生素耐藥和汞金屬抗性基因:strAB和mer。在p420352-strA和pZDHY414兩個(gè)質(zhì)粒中,發(fā)現(xiàn)了同源性很高的毒力相關(guān)的msr區(qū),均編碼兩個(gè)毒力基因msrAB,這兩個(gè)基因在細(xì)菌黏附及侵襲作用中發(fā)揮了重要作用[6-7]。一些關(guān)鍵的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也在該型別質(zhì)粒中被發(fā)現(xiàn),pGRT1中包括可以抵抗有機(jī)溶劑的外排泵基因srpABCS,根據(jù)相關(guān)報(bào)道攜帶該質(zhì)粒的惡臭假單胞菌DOT-T1E由于獲得了這類相關(guān)基因,其可以在高濃度的甲苯溶液中生存,且耐有機(jī)溶劑[8]。該質(zhì)粒中還發(fā)現(xiàn)了emrE基因,許多研究[9-10]已發(fā)現(xiàn)在不同攜帶該基因的的菌種中都產(chǎn)生了多種藥物的外排現(xiàn)象。在pBYT5-2的骨架區(qū)發(fā)現(xiàn)了編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的mod、phn、lpt,可以維持宿主的基本生理活動(dòng)[11- 12]。總之,質(zhì)粒中這些關(guān)鍵的抗性基因和調(diào)控基因可以提高宿主在環(huán)境壓力下的生存能力。

該研究表明IncpGRT1型質(zhì)粒在假單胞菌中宿主的廣泛性以及其傳播耐藥及毒力基因的潛力,假單胞菌可以通過(guò)傳播這類質(zhì)粒獲得相關(guān)基因。該類型質(zhì)粒已經(jīng)在臨床中分離出,推測(cè)其在院內(nèi)環(huán)境中有廣泛傳播的潛力,臨床防治過(guò)程中需要給予重視。