混合譜系白血病基因在惡性血液病中的研究進展

劉警安, 黃 容, 朱奕霖, 李田田, 彭 婕, 施小鳳

(1. 江蘇大學附屬醫院 血液科, 江蘇 鎮江, 212000; 2. 南京醫科大學第二附屬醫院 血液科, 江蘇 南京, 210003)

表觀遺傳學指基因表達的遺傳改變, 這種改變并不是由DNA序列變化引起的,其中組蛋白甲基化是主要的表觀遺傳修飾之一。混合譜系白血病(MLL)基因是果蠅組蛋白賴氨酸N-甲基轉移酶2(KMT2)基因的哺乳動物同源物,也稱KMT2s, 編碼一種特異性針對組蛋白H3第4位賴氨酸(H3K4)的甲基轉移酶,通過組蛋白甲基化修飾調控表觀遺傳。該基因家族因其首個成員MLL1最初發現于MLL中而被命名[1], 現共有6個成員,即MLL1(KMT2A)、MLL2(KMT2B)、MLL3(KMT2C)、MLL4(KMT2D)、SETD1A(KMT2F)、SETD1B(KMT2G)[2]。MLL基因家族成員在多種惡性血液病中存在重排或突變,其與惡性血液病的發生發展密切相關,現將MLL的結構與功能、對惡性血液病的作用及靶向藥物的研究進展綜述如下。

1 野生型MLL的結構和功能

1.1 MLL蛋白的結構域

MLL1、MLL2、MLL3、MLL4、SETD1A、SETD1B分別位于染色體11q23、19q13、7q36、12q13、16p11、12q24, 其編碼的MLL蛋白由1707～5537個數量不等的氨基酸組成。基于序列保守性, MLL家族蛋白可分為3組,即MLL1/MLL2、MLL3/MLL4和SETD1A/SETD1B,每組中的2個MLL蛋白結構高度相似[3]。MLL家族成員均包含1個具有KMT2活性的SET結構域,負責H3K4甲基化,且在進化上保守[3]。各組成員還存在特異性結構域,例如MLL1-4包含苯丙氨酸和酪氨酸富集區N端/C端(FYRN/FYRC)和不同數量的植物同源域(PHD), MLL1/MLL2包含AT鉤和CXXC域, MLL3/MLL4包含高遷移率組框(HMG), SETD1A/SETD1B包含RNA識別基序(RRM)[4-5]。FYRN和鄰近SET域的FYRC結構域之間存在蘇氨酸天冬氨酸蛋白酶(Taspase1)切割位點,MLL蛋白被切斷后產生MLL-N(N端)和MLL-C(C端)這2個多肽,兩者通過FYRN與FYTC相互結合而形成穩定的功能性異二聚體復合物[6]。PHD與低甲基化組蛋白H3的N末端相互作用[7], AT鉤與富含AT序列的DNA區域結合, CXXC與未甲基化的DNA(CpG島)結合[8], HMG也是一個獨特的DNA結合基序[5], 這些結構域可促進MLL識別其靶基因,對調控下游基因轉錄至關重要[9]。

1.2 MLL復合物

MLL家族蛋白的SET催化結構域內在酶活性較弱, MLL與核心復合物WRAD相結合后,其組蛋白甲基轉移酶(HMTs)活性明顯增強。WRAD由WDR5、RBBP5、ASH2L和DPY30亞基組成[10]。在WRAD存在的情況下, MLL家族成員甲基轉移酶活性各具特異性, MLL1/MLL2表現出單甲基化(H3K4me1)和二甲基化(H3K4me2)活性以及較低的三甲基化(H3K4me3)活性, MLL3/MLL4主要表現出單甲基化(H3K4me1)活性,而SETD1A/SETD1B可以催化甲基化的所有狀態[6]。LI Y J等[11]提出一種兩步激活MLL-SET活性的機制: 首先,與RBBP5-ASH2L異二聚體的相互作用降低了MLL-SET的靈活性,有助于將MLL-SET穩定在能夠進行輔因子結合和底物識別的構象中; 然后, H3底物結合誘導MLL-SET的局部構象變化,以實現甲基轉移酶的完全活性構象。由此表明, RBBP5-ASH2L異二聚體是與MLL家族蛋白(MLL1除外)相互作用并激活其甲基轉移酶的最小結構單元,而MLL1的完全激活需要WDR5的直接參與,其可以同時與MLL1和RBBP5-ASH2L相互作用促進MLL1復合物的形成[11]。除了WRAD核心亞基外, 3組MLL復合物中均有其特異性成分, MLL1/MLL2復合物招募Menin、LEDGF和HCF1/2亞基并與其相互作用, PTIP、PA1、NCOA6和UTX與MLL3/MLL4復合物相互作用, CFP1、WDR82、HCF1是SETD1A/SETD1B復合物的相關亞基[10]。

1.3 MLL的生物學功能

MLL催化組蛋白H3K4的甲基化,在胚胎發育和造血過程中維持同源盒(HOX)基因片段特異性表達,HOX基因在造血干細胞(HSC)和未成熟祖細胞中高度表達,在譜系定型和終末分化的細胞群中表達下調,對HSC的自我更新及其向髓樣和淋巴樣等祖細胞分化起著至關重要的作用[12-13]。除組蛋白甲基化活性以外, MLL家族成員在DNA損傷應答、細胞分裂與代謝活性和非組蛋白甲基化相關功能方面同樣具有關鍵作用[10]。

2 MLL對惡性血液病的作用

2.1 MLL1基因重排(MLL1-r)與白血病

MLL1-r與部分急性白血病的發生密切相關,特別是在嬰幼兒中。據統計, 70%～75%的嬰兒、5%～6%的兒童、10%～15%的成年急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)患者中可發現MLL1-r, 且預后較差[14]。MLL1-r急性髓系白血病(AML)患者的30 d病死率和60 d病死率(分別為10%和15%)顯著高于正常核型AML患者(4%和7%)[15]。急性白血病患者中共鑒定出135種不同的MLL1-r, 其中ALL患者常見的MLL1-r有MLL1-AF4(約57%)、MLL1-ENL(約18%)、MLL1-AF9(約13%)、MLL1-AF10(約4%)和MLL1-AF6(約2%)這5種, AML患者常見的MLL1-r有MLL1-AF9(約30%)、MLL1-AF10(約16%)、MLL1-ELL(約11%)、MLL1-PTDs(約12%)、MLL1-AF6(約8%)和MLL1-ENL(約4%)這6種[16]。MLL1基因重排后, MLL1蛋白的C端SET域丟失,而N端識別和結合相關組蛋白甲基化標記的能力保留,同時獲得伴侶蛋白的功能,產生與野生型MLL1活性不同的MLL1融合蛋白(MLL1-FPs)。

MLL1-FPs致白血病發生的機制一直是研究熱點,人們期望從中尋找更有效的治療MLL1-r白血病的靶點。絕大多數MLL1-r白血病是由細胞核類蛋白AF4、AF9、ENL、ELL與MLL1融合引起的[16]。相關研究[17]純化幾種常見MLL1-FPs鑒定出一種超延伸復合物(SEC), 由AF4家族(AF4和AFF4等)、ENL家族(ENL和AF9)、ELL家族(ELL1、ELL2和 ELL3)和正性轉錄延伸因子(P-TEFb)組成。AF4是SEC形成的支架,其N端無序結合域與SEC其他亞基相互作用,共同組成SEC, P-TEFb和ELL分別通過RNA聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)磷酸化、減少延伸期間PolⅡ停滯時間,直接刺激轉錄延伸,總體而言SEC表現出促進MLL1靶基因如HOXA9表達的生物功能[8]。MLL1-FPs致白血病功能的另一個關鍵參與者是DOT1L, 這是一種催化組蛋白3賴氨酸79(H3K79)甲基化的甲基轉移酶, AF9和ENL等幾種 MLL1融合伴侶可以直接與DOT1L結合,其他伴侶也可以在不同的延伸復合物中間接與DOT1L相互作用, MLL1-FPs與 DOT1L的相互作用可以將 DOT1L募集到靶向基因中,并促進這些基因的H3K79甲基化,從而增強這些基因如HOXA9的表達[18]。HOXA9過度表達導致HSC的持續自我更新并永生化,阻礙造血過程中的細胞分化,最終導致白血病的發生[19-20]。

MLL1二聚化是細胞質類融合蛋白主要的致病機制。AF6是最常見的細胞質類MLL融合伴侶,已有研究[21]表明MLL1-AF6通過其Ras關聯結構域(RA1)介導的二聚化作用轉化造血祖細胞。SMITH M J等[22]應用生物信息學方法評估36種細胞質類MLL1融合蛋白,其中34種具有卷曲螺旋結構域或其他具有二聚化潛力的結構域,說明此類MLL1-FPs極有可能發生二聚化。SMITH M J等[22]還發現, MLL1二聚體可以結合SEC和DOT1L, 表明MLL1的二聚化賦予其與基因表達的關鍵介質相互作用的能力,使MLL1下游基因異常激活,促進白血病發生。此外, MLL1部分串聯重復(PTD)突變體不與伴侶蛋白融合, CXXC域及其相鄰區域的部分在框內復制,與二聚化中的MLL1部分重復類似, MLL1-PTD蛋白可能通過類似二聚化的機制激活靶基因表達[20]。

信號轉導途徑的激活也是MLL1-r白血病的發病機制之一。研究[23]報道,MLL1-AF10通過直接招募JAK1激活JAK/STAT介導的炎癥信號級聯反應,促進腫瘤發生,而敲除JAK1或藥物抑制JAK/STAT信號,可在小鼠和人MLL1-AF10白血病模型中產生明顯的抗癌作用。

2.2 MLL4與淋巴瘤

MLL4(KMT2D)是非霍奇金淋巴瘤中突變率最高的基因,在濾泡細胞淋巴瘤和彌漫性大B細胞淋巴瘤中突變率為35%～85%[24]。MLL4的突變類型主要是SET和PHD結構域中的無義和移碼突變,導致蛋白質產物截短[25]。MLL4靶基因包括一些經常突變的腫瘤抑制基因,如TNFAIP3、SOCS3和TNFRSF14,MLL4突變可擾亂這些基因的表達,從而促進腫瘤的生長[26]。ORTEGA-MOLINA A等[26]發現,在Bcl-2表達失調的小鼠B細胞中,MLL4基因敲除顯著促進淋巴瘤的發生,而無Bcl-2表達失調時,MLL4完全敲除也能導致58%小鼠發生B細胞淋巴瘤。ZHANG J Y等[27]發現,在無Bcl-2表達失調的情況下,MLL4純合缺失、雜合缺失的小鼠與野生型小鼠相比無顯著差異。值得注意的是, SANTOS M A等[28]發現在MLL-AF9融合基因誘導的AML小鼠中,MLL4促進白血病細胞生長,而MLL4缺失導致髓系分化增強,從而保護小鼠免于AML相關死亡。這些看似矛盾的結果很可能與不同的細胞環境和細胞類型有關。

2.3 MLL2、MLL3、SETD1A、SETD1B在惡性血液病中的作用

MLL2在血液病中的作用尚不清楚,迄今為止,僅有少量證據顯示其與白血病的關聯性。HUANG L等[29]通過靶向測序發現,侵襲性自然殺傷細胞白血病中頻繁突變的基因包括MLL2(21%)。CHEN Y F等[30]研究顯示,MLL2缺失降低了MLL-AF9融合基因誘導的白血病細胞的存活率,并且MLL1和MLL2共同缺失所致存活率、增殖能力和基因表達的降低比單個基因缺失更嚴重,表明MLL2可能具有抑制腫瘤作用。

MLL3具有腫瘤抑制作用, AML患者中經常可發現MLL3缺失,但單獨MLL3缺失不足以導致白血病發生,而是需與p53缺失協同作用才能抑制HSC分化,導致骨髓增生異常綜合征。對MLL3缺失的AML患者體細胞突變數據進行分析發現, Ras通路突變頻率增高,推斷MLL3缺失可能與AML發生中過度活躍的Ras信號傳導有關[31]。

SETD1A對白血病細胞存活和白血病進展有促進作用,將SETD1A敲減的MLL-AF9融合基因陽性的白血病細胞移植到受體小鼠,小鼠外周血中白血病細胞減少,小鼠存活時間延長,骨髓中白血病細胞的生長也受到明顯抑制[32]。進一步研究表明,SETD1A的SET結構域及甲基轉移酶活性對于白血病的生長不是必需的,相反SETD1A上FLOS結構域至關重要,其通過與細胞周期蛋白K相互作用,調節參與DNA損傷反應基因的表達,保護白血病細胞染色體的完整性,并減少細胞凋亡,促進白血病細胞的生存[32]。

SETD1B相關研究目前尚較少見, BRANFORD S等[33]通過全外顯子組和RNA測序,在3名慢性粒細胞白血病患者中發現了SETD1B基因中的移碼或無義突變,這種HMTs在癌癥體細胞突變目錄(COSMIC)癌癥基因普查中被歸類為腫瘤抑制基因,但相較于其他癌癥基因尚缺乏廣泛的證據。

3 MLL相關血液病的靶向藥物研究

MLL家族蛋白通過與其他亞基(如WDR5、DPY30、Menin等)形成多聚體復合物而發揮作用, MLL1-FPs同樣招募其他轉錄輔因子(如DOT1L)促進MLL1-r白血病發生,如此復雜的蛋白質-蛋白質相互作用網絡為開發靶向藥物提供了思路,目前已有多種針對MLL酶活性及其相關亞基的小分子抑制劑進入臨床試驗并表現出可觀的療效。

3.1 DOT1L-MLL相關抑制劑

DOT1L甲基轉移酶活性在MLL1-r介導的白血病發生中起重要作用,近年來DOT1L已成為MLL1-r白血病治療的熱門靶點。研究者已設計并開發出一系列小分子DOT1L抑制劑,大多數是通過與甲基供體S-腺苷甲硫氨酸(SAM)競爭結合DOT1L而抑制DOT1L的酶活性,其中EPZ-5676(Epizyme/Pinometostat)能有效地抑制H3K79甲基化,阻止MLL1-r白血病細胞生長,在MLL1-r白血病大鼠移植模型中顯示出有效的抗腫瘤效果,目前已進入Ⅱ期臨床試驗[34]。另外, YUAN Y N等[18]設計合成了一系列DOT1L肽模擬物,其中最有效的模擬物12表現出與EPZ-5676相當的抗癌細胞活性,機制研究表明其不直接抑制DOT1L的酶活性,而是通過阻斷DOT1L與MLL1-FPs的蛋白質-蛋白質相互作用來抑制MLL1-FPs靶基因上H3K79的甲基化。一項已完成的臨床試驗[34]結果顯示, EPZ-5676有一定的臨床活性,但長期服用可能導致抗藥性,因此,作為靶向DOT1L的替代方案, DOT1L降解劑也被提出用于MLL1-r白血病。

3.2 Menin-MLL相關抑制劑

Menin作為一種由多發性內分泌腺瘤1基因(MEN1)編碼的蛋白,與MLL的N端CXXC區結合參與形成MLL1/MLL2復合物。研究[19]表明, Menin與MLL1-FPs的相互作用促進了MLL融合蛋白誘導的白血病的發生,在MLL1-FPs介導的白血病細胞模型中, Menin蛋白缺失最終導致HOX基因下調,消除了MLL1-r白血病細胞的分化停滯和致癌性。因此,靶向Menin和MLL1-FPs的蛋白質-蛋白質相互作用是MLL1-r白血病的一種潛在治療策略。許多不同結構類型的小分子Menin-MLL抑制劑已被開發出來,其中4種抑制劑(KO-539、SNDX-5613、JNJ-75276617、BMF-219)已進入白血病Ⅰ期或Ⅱ期臨床試驗,特別是BMF-219的臨床適應證還包括彌漫性大B細胞淋巴瘤和骨髓瘤[35]。一項已完成的Ⅰ期臨床試驗[36]結果表明, SNDX-5613和KO-539在具有MLL1-r的復發難治性AML首次人體研究中,總有效率分別為53%和16.7%, 且16%～27%的患者伴有不同程度分化綜合征或長QT間期等不良反應。這些藥物在人體內具有靶向活性,但治療效果不佳,為了進一步提高療效,靶向藥物聯用或許是可行的治療方向。AUBREY B J等[37]在體內外驗證了轉錄調節因子IKAROS和Menin的聯合靶向治療具有協同抗白血病作用。

3.3 其他MLL復合物相關抑制劑

野生型MLL1是MLL1-FPs介導的體內白血病發生所必需的,即使在MLL1-FPs存在的情況下,野生型MLL1等位基因的缺失也會導致MLL1-AF9細胞白血病轉化能力的喪失[38]。WDR5-MLL1相互作用對于野生MLL1復合物具有重要作用,迄今已有多種WDR5-MLL1拮抗劑被發現,包括肽模擬物(如MM-401、MM-589)和小分子抑制劑(OICR-9429、DDO-2117、DDO-2213等),研究[39]表明DDO-2213不僅在體外選擇性抑制 MLL1甲基轉移酶活性,有效降低MLL-FPs依賴性基因表達,抑制攜帶MLL-FPs的白血病細胞增殖,而且在小鼠體內模型中表現出對MLL-FPs白血病的治療潛力。近期研究[38]結果顯示,WDR5敲除和WDR5抑制劑具有相同的抑制MLL-FPs白血病效果, WDR5降解劑可能也是治療MLL-FPs白血病的有效策略。DPY30作為 ASH2L特異性穩定劑,在MLL甲基化功能和惡性血液病中發揮重要作用[40]。已有研究[41]證明, DPY30抑制肽對體外MLL1-r白血病細胞有一定程度的抑制作用。

CXXC結構域是DNA甲基化的讀取器,優先與未甲基化的CpG DNA序列結合。KALMODE H P等[42]發現, CXXC結構域點突變破壞了其與DNA的結合能力,導致HOXA9基因表達降低,并且消除了MLL-AF9引發小鼠白血病的能力,其合成的競爭性抑制MLL1 CXXC結構域活性的化合物可以在體外抑制MLL1-r白血病細胞系的生長。雙硫侖也是CXXC結構域的特異性抑制劑,可阻止 MLL-FPs與靶基因結合,已被證明可在體外和體內抑制MLL1-r白血病細胞生長,且顯著延長小鼠的生存時間[43]。

3.4 信號轉導通路相關抑制劑

JAK/STAT信號通路中的JAK1被MLL1-AF10招募,促進腫瘤發生,通過藥物抑制JAK/STAT信號,可在MLL1-AF10白血病模型中產生明顯的抗癌作用[23]。UCKUN F M等[44]發現,MLL1-r白血病患者中, JAK等酪氨酸激酶的基因表達水平升高,提示酪氨酸激酶抑制劑具有治療MLL1-r白血病的臨床潛力,其中許多抑制劑已經被美國食品藥品監督管理局(FDA)/歐洲藥品管理局(EMA)批準用于其他適應證。

4 總結與展望

MLL家族蛋白(MLL1、MLL2、MLL3、MLL4、SETD1A、SETD1B)包含具有HMTs活性的SET結構域,可特異性甲基化H3K4, 與轉錄活躍狀態密切相關,是表觀遺傳調控因子之一,在胚胎發育和造血中具有重要的作用。MLL發揮其甲基化功能通常需要結合1個核心復合物WRAD(由WDR5、RBBP5、ASH2L和DPY30組成)。MLL突變經常在惡性血液病中被發現,其中MLL1在急性白血病中的易位最為常見。近年來靶向藥物在腫瘤領域中的應用越來越廣泛,靶向治療MLL相關癌癥的策略也相繼出現,目前DOT1L抑制劑和Menin抑制劑已進入白血病治療的臨床試驗階段,其他如WDR5、DPY30、CXXC的小分子抑制劑也在開發研究中。隨著未來對惡性血液病中MLL家族的深入研究,研究者將提出新的更具優勢的靶向治療甚至雙靶向治療方案,這在惡性血液病治療方面具有巨大的潛力。