淺析生活飲用水中水質微生物檢測能力驗證的結果與質量控制

徐新龍 楊杰 李玉龍 李蘭 莫善明 劉佳麗

摘 要：生活飲用水中的微生物指標是判定水質安全合格與否的重要指標之一，提升實驗室生活飲用水中水質微生物項目的檢測能力，可為海關執法和政策制定提供科學依據。本文依據GB/T 5750.12—2006中微生物指標檢驗方法和本次能力驗證計劃的參試作業指導書要求，采用平皿計數法對樣品1#、2#中菌落總數進行檢測，采用多管發酵法對樣品3#、4#中的總大腸菌群、耐熱大腸菌群和大腸埃希氏菌進行檢測。結果顯示，4項檢驗項目的|Z|≤2，獲得“滿意”結果。通過參加該能力驗證計劃項目，分析與總結了能力驗證檢測過程中的注意事項與質量控制要求，有效評價了實驗室操作人員的檢測能力水平。

關鍵詞：生活飲用水；菌落總數；大腸菌群；能力驗證；質量控制

Abstract： The microbial index of domestic drinking water is one of the important indicators to determine whether the water quality is safe or not. Improving the detection ability of the laboratory’s microbial project of domestic drinking water quality can provide a scientific basis for customs law enforcement and policy formulation. In accordance with the requirements of GB/T 5750.12—2006 microbial index test method and the operation instruction for participation in this capacity verification plan， this paper uses the plate counting method to detect the total number of colonies in sample 1# and 2#， and uses the multi tube fermentation method to detect the total coliform， heat resistant coliform and Escherichia coli in sample 3# and 4#. The results showed that |Z|≤2 of the 4 inspection items obtained a “satisfactory” result. By participating in the proficiency testing program， the precautions and quality control requirements during the proficiency testing process were analyzed and summarized， and the testing ability level of laboratory operators was effectively evaluated.

Keywords： drinking water; total number of colonies; total coliform; proficiency testing; quality control

水是不可或缺的寶貴自然資源，自然界中的水往往含有各類雜質及多種微生物，如果直接飲用，將會導致機體遭受不同程度的破壞，從而引發各種類型的疾病，嚴重時可危及生命[1]。微生物群是水是否被污染的重要指示物，可將生活飲用水和水源水中的微生物，如大腸菌群等檢驗結果作為判斷水質合格與否，以及水傳染病流行的預警信息[2]。菌落總數、大腸菌群、銅綠假單胞菌等是生活飲用水中的主要微生物指標，可根據《生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標》（GB/T 5750.12—2006）規定的檢測方法及其他標準開展檢驗[3]。

能力驗證是指利用實驗室間比對，并按照預先制定的準則評價參加者的能力[4]。它是判斷和監控實驗室能力、并使實驗室質量管理體系有效性與效率得到持續改進與不斷提高的重要途徑，經常被應用于實驗室的外部質量控制活動中，其結果可用于新建方法的證實、人員數據分析能力的培養、人員檢測能力考核、設備操作及管理等[5]。阿拉山口海關技術中心動植食品紡織實驗室嚴格按《能力驗證領域和頻次表》（CNAS—AL 07：2015）規定[6]，每年都積極參加國內外食品微生物領域能力驗證活動，穩步提升了該實驗室的微生物檢測能力與水平。

1 材料與方法

1.1 測試樣品及標準菌株

待檢測樣品為4份西林瓶真空包裝的白色塊狀凍干粉末，菌落總數樣品檢測標識1#、2#，總大腸菌群、耐熱大腸菌群及大腸埃希菌樣品檢測標識3#、4#：中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心；大腸埃希氏菌（ATCC 25922），上海寶錄科技有限公司。

1.2 試劑及培養基

營養瓊脂（Nutrient Agar，NA）；乳糖蛋白胨；伊紅美藍瓊脂（Eosin Methylene Blue Agar，EMB）；革蘭氏染色液；EC培養基；EC-MUG培養基，北京陸橋公司。

1.3 儀器與設備

SPX-160生化培養箱（寧波江南儀器廠）；CL-40M高壓滅菌器（日本ALP公司）；NU-404-400E生物安全柜（美國NUAIRE公司）；HH.S21-4電熱恒溫水浴鍋（上海博迅）；Eclipse Ci-L顯微鏡（日本尼康公司）。

1.4 檢驗方法

按照參試能力驗證作業指導書與實驗室獲認可方法《生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標》（GB/T 5750.12—2006）進行檢測。

1.4.1 樣品再水化

依據指導書用220 mL無菌水對參試樣品進行再水化。取出4 ℃低溫冷藏樣品，待其溫度與室溫達到平衡后，在生物安全柜內開啟裝有樣品1#、2#的西林瓶，先加入無菌水10 mL，待凍干粉完全溶解后，將其吸出并移至另一無菌瓶中，加無菌水反復潤洗西林瓶的內表面，回收清洗液至無菌瓶內，最后充分混勻，此溶液即等同于220 mL的待測生活飲用水樣品原液。樣品3#、4#處理方法同前述，但需將再水化加入無菌水體積改為20 mL。

1.4.2 菌落總數檢測方法

將樣品1#、2#用MS3渦旋混勻器充分混勻，再用一次性無菌移液管吸取該原液各1 mL，分別注入直徑9 cm的一次性無菌培養皿中，將121 ℃高壓滅菌后的營養瓊脂冷卻至45 ℃左右，傾注至培養皿的低刻度線處，即約15 mL，旋緊搖勻，保證二者充分混勻，同法接種平行樣品培養皿。無菌吸取1 mL待測水樣置于9 mL滅菌生理鹽水管中，充分混勻制成1∶10（V∶V）稀釋液，吸取1 mL 1∶10（V∶V）稀釋液注入9 mL滅菌生理鹽水管中，混勻即得1∶100（V∶V）稀釋液，同上連續梯度稀釋制成1∶1 000（V∶V）稀釋液，接種方法同上，另取空白培養皿加入營養瓊脂作為空白對照。待所有平皿凝固后，將其倒置于生化培養箱內36 ℃培養48 h后計數菌落數。

1.4.3 總大腸菌群乳糖發酵試驗

多管發酵法：取10.0 mL樣品3#、4# 分別接種含10 mL雙料乳糖蛋白胨溶液的試管5支；取1 mL樣品3#、4#分別接種含10 mL單料乳糖蛋白胨溶液的試管5支；取1.0 mL樣品3#、4#加至含9 mL滅菌生理鹽水的管中，吸取混勻后的液體1.0 mL（即0.1 mL），分別接種含10 mL單料乳糖蛋白胨溶液的試管5支，所有試管內均置有小倒置管。接種完畢后置于36 ℃生化培養箱培養24 h。將發酵后產酸產氣的陽性管分別在伊紅美藍平板上做連續劃線法接種，36 ℃培養24 h培養后，觀察其菌落形態，革蘭氏染色與鏡檢后進行進一步復發酵證實實驗。

1.4.4 耐熱大腸菌群檢測

采用多管發酵法檢測水中耐熱大腸菌群。總大腸菌群產酸產氣陽性者，用接種環挑取一環管中液體，接種EC培養基管，置于恒溫水浴槽中44.5 ℃培養24 h，同時接種伊紅美藍瓊脂平板，于44.5 ℃培養24 h，具有典型菌落形態的樣品則證實為陽性。

1.4.5 多管發酵法檢測水中大腸埃希氏菌檢測

采用多管發酵法檢測水中大腸埃希氏菌。用接種環挑取經證實為總大腸菌群陽性試管中的液體，接種到EC-MUG管中，置于恒溫水浴槽中44.5 ℃培養24 h，將培養完畢后的EC-MUG管放在暗處用紫外燈照射（波長336 nm，功率6 W）觀察，有藍色熒光的樣品則為陽性。

2 結果與分析

2.1 菌落總數結果

菌落總數計數結果與被檢樣品的稀釋度倍數成反比，且同一樣品稀釋度的兩個平行樣之間差異越小，表明實驗結果相對準確；空白對照無菌落生長，則表明實驗過程無污染，實驗條件成立，結果有效[7]。在實驗過程中為確保有適宜的稀釋度在可計數范圍內，實驗選取了原液、10-1、10-2、10-3 4個稀釋度，參試樣品的平行樣一和平行樣二分別計數菌落總數，選二者平均值作為最終報告數，結果見表1。最終報告1#樣品的菌落總數為119 CFU·mL-1，2#樣品的菌落總數為120 CFU·mL-1。

2.2 總大腸菌群檢測結果

總大腸菌群多管發酵法檢測結果見表2。從表2可以看出，樣品3#、4#經初發酵實驗后，部分試管變黃變混濁，內置倒置管中出現氣泡，或出現絮狀沉淀，均帶有糞臭味。用伊紅美藍瓊脂平板將初發酵陽性管劃線培養后，呈深紫黑色、圓形的典型菌落，略微帶有金屬光澤，染色及鏡檢為革蘭氏陰性（G-）、兩端鈍圓、無芽孢桿菌。經查表最終報告為3#樣品的總大腸菌群數為540 MPN/100 mL，4#樣品的總大腸菌群數為1 600 MPN/100 mL。

2.3 耐熱大腸菌群及大腸埃希氏菌計數結果

耐熱大腸菌群及大腸埃希氏菌多管發酵法檢測結果見表3。由表3可以看出，將經總大腸菌群證實實驗確定的陽性管轉種EC發酵管后均產酸產氣，轉種EMB平板后均出現典型菌落生長；將上述陽性管再接種EC-MUG管后也均產生藍色熒光。經查表最終報告為3#樣品的耐熱大腸菌群和大腸埃希氏菌計數結果為540 MPN/100 mL，4#的耐熱大腸菌群和大腸埃希氏菌計數結果為1 600 MPN/100 mL。

2.4 能力驗證結果與分析

依據此次能力驗證提供者反饋的|Z|值對結果進行評價，|Z|值≤2.0為滿意結果，2.0＜|Z|值＜3.0為可疑結果，|Z|值≥3.0為離群結果[8]。如表4所示，實驗室此次上報能力驗證結果的|Z|值均＜2.0，并且|Z|值相對都較小，評價結果均為結果滿意。

3 結論與討論

綜上所述，實驗室參加本次CNAS能力驗證提供者組織的生活飲用水中菌落總數，以及總大腸菌群、耐熱大腸菌群、大腸埃希氏菌能力驗證計劃，4項參數的|Z|值均≤2.0，取得滿意結果。此次能力驗證項目均屬定量檢驗，需報送具體參數，相較于定性檢驗來說，具有一定難度。近年來，微生物檢測領域檢測能力驗證項目的難度不斷增大，檢測周期安排也更為緊湊，除前期準備及結果報告的時間，基本僅留有完成一次完整檢測周期的時間，不容復測。這就需要操作人員認真對待每一次能力驗證，提前做好各項準備，合理優化檢驗流程，并對檢測過程中的各類影響因素進行必要的質量控制。

能力驗證是評價實驗室檢測技術能力的重要依據，通過參加能力驗證有助于發現實驗室存在的各類問題并加以改進。例如，方瑩等[9]通過參加生活飲用水微生物檢測項目的能力驗證，依據組織方反饋的Z值總結了總大腸菌群多管發酵法和膜過濾法兩種方法之間的優劣，分析了再水化時間、加樣量、培養條件等檢驗過程中可能存在的問題，有效評價了3名參試檢驗員的業務能力水平。而實際工作中影響生活飲用水中微生物檢測結果的因素較多，為保證檢測結果的準確性和可靠性，需要做好前期準備工作，并從檢測環境、儀器、過程、人員及誤差等方面進行質量控制[10]。結合上述能力驗證結果，本文重點對此次能力驗證檢測過程中的注意事項和各環節的質量控制要求進行了討論。

（1）能力驗證樣品送達后，操作人員應檢查樣品包裝是否存在破損、內容物是否齊全和完好等。并嚴格按照參試指導書中規定方法操作，操作過程中盡量安排兩名以上檢驗員進行獨立操作。操作人員要提前熟悉每個操作步驟及細節，并注意生物安全，避免樣品液污染。檢測相關儀器設備均需檢定或校準，并符合檢測結果的量值溯源要求[11-12]。

（2）實驗室培養基質量的判斷對于保證檢驗結果的準確、科學與公正至關重要。實驗室應當選擇適宜的制備方法、滅菌和儲存方式，并按規定對其進行質量控制，以保證最終檢驗結果的準確性[13]。例如，本次能力驗證過程中使用到的乳糖蛋白胨培養液需注意單雙料稱樣量的變化，營養瓊脂、EC培養基、伊紅美藍培養基需121 ℃滅菌15 min，乳糖蛋白胨培養液、EC-MUG培養基則因成分不同需115 ℃滅菌20 min，經過高壓滅菌的培養基還應關注其pH值的變化，避免因培養基質量問題而影響檢測結果。

（3）檢樣稀釋度選擇恰當與否直接關系到檢測結果的可靠性[14]。實驗室應根據參試指導書或生活飲用水衛生標準中的限量要求，在預先判斷樣品受污染程度高低的基礎上選擇適宜的稀釋度。針對能力驗證分發的盲樣，在樣品前處理時采用漩渦混勻器混勻，提升樣液的均勻度[15]。本次實驗過程中選擇了4個適宜的樣品稀釋度，每個稀釋度均設置另一平行樣，以防止因平板蔓延或其他原因不能讀數。此外，在應用多管發酵法對小于1 mL樣品液進行接種處理時，應通過逐級遞增稀釋的方法完成稀釋處理，以保證結果準確性[16]。

（4）在菌落總數讀數方面，可在平板培養過程中分時段多次觀察，詳細觀察菌落在平板上的生長情況，按時做好記錄，防止出現菌落蔓延生長的情況。最終讀數時，盡量安排多人同讀，避免漏讀甚至讀錯。對于總大腸菌群等多管發酵計數，應帶有標準陽性菌株對待檢樣品的陰、陽性進行判斷，發酵過程中可適當延遲培養時間，防止漏讀一些發酵較慢的菌，對于初發酵單個產酸或產氣的可疑管均需要進行復發酵和確證實驗，觀察EC-MUG熒光時，也應多人一起判讀，保證結果的可靠性[15]。在報告結果時，除了按照參試指導書中限定或規定的標準要求外，還應該按照隨附的能力驗證結果報告單中規定要求報告結果。結果報告單應由檢驗員、復核人員及授權簽字人進行三級校核，避免出現不必要的錯誤，并經由授權簽字人最終審核無誤后簽發報告[17]。

（5）實驗室質量負責人需要對能力驗證提供者反饋的Z值結果認真地進行分析總結，并且對檢測過程中的某些突出問題進行針對性糾正和預防，促進實驗室檢測能力的不斷提升，確保實驗室質量管理體系得到持續有效運行，并獲得不斷改進，從而增強實驗室在海關系統及檢測市場中的競爭力與影響力。近年來，得益于參加各類微生物檢測能力驗證計劃活動，阿拉山口海關技術中心實驗室的質量管理體系不斷規范，檢測人員業務能力水平進一步提高，實驗室微生物檢測能力得到了穩步提升。

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