基于指紋圖譜及色度分析的不同基原枳實質量差異性研究

劉金金，劉艷梅 ，鄧亞利 ，陳向東 ，羅文匯 ，孫冬梅

1.華南農業大學材料與能源學院，廣東 廣州 510642；2.廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244

枳實始載于《神農本草經》，2020年版《中華人民共和國藥典》規定其為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種或甜橙Citrus sinensisOsbeck的干燥幼果[1]。枳實藥材資源豐富，分布廣泛，目前在我國長江流域及南方各省柑橘栽培地區資源最為豐富，主產于江西、四川、湖南等地[2]。枳實味苦、辛、酸，性微寒，入胃、脾經，具有破氣散痞、瀉痰消積功效，主治大便秘結、瀉痢后重、積滯內停、痞滿脹痛、結胸等癥[3]。現有針對枳實的質量評價基本集中在不同藥用部位[4]、不同產地[5]、不同炮制方法[6]等定性定量研究，對不同基原的鑒定和質量差異性研究鮮有報道。因此，本研究針對2種基原枳實建立多元質量控制體系，結合聚類分析、主成分分析、偏最小二乘回歸分析法等化學模式識別技術及色度學原理[7]，對31批不同產地、不同基原的枳實藥材進行質量差異性研究，為枳實藥材質量標準完善及資源開發提供依據。

1 儀器與試藥

Waters H-Class型超高效液相色譜（UPLC）儀；Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm），安捷倫有限公司；KQ-500DE型超純水凈化系統，Millipore公司；TS7700型分光測色儀，深圳漢三恩時科技有限公司；ME204E萬分之一天平、XP26百萬分之一天平，梅特勒-托利多公司；Milli-Q Direct超純水系統，默克股份有限公司。

柚皮苷（批號110722-201714，純度≥93.5%）、新橙皮苷（批號111857-201804，純度≥99.4%）、橙皮苷（批號110721-201818，純度≥96.2%）、橘皮素（批號112054-202102，純度≥98.6%）對照品，中國食品藥品檢定研究院；蕓香柚皮苷（批號wkp19041908）、水合橙皮內酯（批號wkp20031904）、川陳皮素（批號wkp20031701）、柚皮素（批號DST200109-100）、異橙皮內酯（批號ST83710105）、異橙黃酮（批號ST20600105）、野漆樹苷（批號111919-201804）對照品，純度≥98.0%，四川省維克奇生物科技有限公司。酸橙對照藥材（批號120936-201606），中國食品藥品檢定研究院；甜橙對照藥材（批號430033-202003），廣州朗歐。乙腈、甲酸，德國Merck公司，色譜純；甲醇，西隴科學股份有限公司，分析純。

2種基原枳實藥材共31批，經廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定，分別為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種或甜橙Citrus sinensisOsbeck的干燥幼果。樣品來源信息見表1。

表1 枳實樣品來源信息

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜及多指標含量測定方法建立

2.1.1 色譜條件

采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）；以乙腈為流動相A，0.2%甲酸水為流動相B，梯度洗脫（0～3 min，10%～15%A；3～6 min，15%～16%A；6～12 min，16%～18%A；12～16 min，18%A；16～18 min，18%～21%A；18～25 min，21%～24%A；25～30 min，24%～40%A；30～45 min，40%～100%A）；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長330 nm；進樣量1 μL。

2.1.2 對照品溶液制備

精密稱取柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、川陳皮素、柚皮素、水合橙皮內酯、異橙黃酮、異橙皮內酯、橘皮素、野漆樹苷、蕓香柚皮苷對照品適量，加甲醇制成含柚皮苷1073.940 μg/mL、新橙皮苷1071.930 μg/mL、橙皮苷400.451 μg/mL、川陳皮素50.078 μg/mL、柚皮素58.310 μg/mL、水合橙皮內酯62.731 μg/mL、異橙黃酮81.340 μg/mL、異橙皮內酯23.912 μg/mL、橘皮素44.067 μg/mL、野漆樹苷37.016 μg/mL、蕓香柚皮苷25.284 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備

取枳實粉末（過4號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，稱定質量，取出，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.1.4 方法學考察

2.1.4.1 精密度試驗

取同一份供試品溶液（SC1），按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定6次，以7號峰橙皮苷為參照峰，測得各成分色譜峰相對保留時間RSD為0.15%～1.90%，相對峰面積RSD為0.07%～2.14%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.2 重復性試驗

取SC1樣品6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，以7號峰橙皮苷為參照峰，測得24個共有峰的相對保留時間RSD為0.25%～1.00%，相對峰面積RSD為0.50%～1.70%，均小于3%，表明該方法重復性良好。

2.1.4.3 穩定性考察

取同一份供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，分別于0、3、6、9、12、15、18、24 h進樣，以7號峰橙皮苷為參照峰，各共有峰的相對保留時間RSD為0.18%～0.90%，相對峰面積RSD為0.39%～2.78%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.5 指紋圖譜建立

取21批酸橙樣品及10批甜橙樣品，分別按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，將所得數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版），分別以酸橙對照藥材（SC0）、甜橙對照藥材（TC0）為參照物，時間窗寬度設為0.2 min，采用中位數法，進行多點校正與全譜峰匹配，分別生成酸橙和甜橙指紋圖譜（見圖1、圖2）。最終確定酸橙共有峰24個，指認出其中11個；甜橙共有峰11個，指認出其中6個。見圖3。以2種基原枳實對照藥材作為參照圖譜進行相應相似度計算，結果見表2。21批酸橙與對照藥材的相似度為0.935～0.999，10批甜橙與對照藥材相似度為0.937～0.998，均大于0.90，表明同一基原的枳實質量相對穩定，同一產地樣品間的化學成分差異較小。

圖1 21批酸橙樣品指紋圖譜疊加圖

圖2 10批甜橙樣品指紋圖譜疊加圖

圖3 酸橙和甜橙對照藥材及有效成UPLC圖

表2 31批枳實樣品指紋圖譜相似度評價

由酸橙和甜橙對照藥材色譜圖可知，不同基原枳實樣品的指紋圖譜共有峰信息和相似度存在顯著差異，表明枳實同屬藥材之間的化學成分存在差異；酸橙整體色譜峰信息相對較多，響應值偏高，與甜橙對照圖譜比較分析，峰1、峰2、峰3、野漆樹苷、新橙皮苷、峰9、峰10、水合橙皮內酯、柚皮素、異橙黃酮、峰21、峰22、峰23及峰24為酸橙特有成分，表明建立的指紋圖譜可實現2種法定基原枳實的有效區分。

2.1.6 聚類分析

將21批酸橙和10批甜橙的共有峰峰面積導入SPSS20.0軟件，以組間聯接聚類法結合歐式平方距離（d）進行系統聚類分析，結果見圖4。當d=25時，31批枳實可聚為2類，一類為甜橙樣品（TC1～TC10），另一類為酸橙樣品（SC1～SC21），表明不同基原枳實可通過聚類分析進行有效區分；當d=5時，同一基原的枳實未能通過產地進行區分，表明同種枳實不同產地之間化學成分無明顯差異。

圖4 31批枳實樣品聚類分析樹狀圖

2.1.7 主成分分析

應用SPSS20.0統計軟件，以31批枳實指紋圖譜的共有峰為變量、以特征值＞1為篩選條件進行主成分分析（PCA），結果見表3。共得到3個主成分因子，其特征值分別為15.455、3.242、2.203，累計方差貢獻率達87.080%，表明模型能較好地進行預測，提取的3個主成分因子可以代表指紋圖譜中24個共有峰的信息，代表枳實不同基原的整體質量特征（見圖5）。PCA可將2種基原枳實明顯區分為2類，樣本點之間無交叉點，且甜橙樣品較為集中，表明同一產地的甜橙質量較為一致，酸橙組內離散程度較大，其中SC12、SC13、SC14與其他樣品差異較大，表明酸橙樣品存在產地質量差異。

圖5 31批枳實樣品PCA得分圖

表3 枳實樣品PCA特征值及方差貢獻率

2.1.8 偏最小二乘判別分析

為更好識別不同基原枳實的差異性，在PCA基礎上，利用SIMCA14.1軟件進行偏最小二乘判別分析（PLS-DA），PLS-DA得分圖見圖6。31批枳實可按基原分為2類，與PCA、聚類分析結果一致；且模型數據矩陣的解釋率參數R2X=0.738，區分參數R2Y=0.974，預測參數Q2=0.967，表明該模型具有良好的預測能力，穩定且可靠。在此基礎上，為進一步研究影響2種基原枳實的差異性物質，利用變量重要性投影（VIP）進行分析，結果見圖7。VIP值越大，表明該變量對模型的影響越大。以VIP＞1為標準，共篩選出11個對辨別酸橙和甜橙有較大影響的共有峰（VIP）：峰3（1.192 25）、野漆樹苷（1.18078）、峰13（1.17157）、川陳皮素（1.16916）、水合橙皮內酯（1.15732）、新橙皮苷（1.12345）、峰23（1.12089）、峰12（1.07205）、峰24（1.05281）、峰20（1.05546）、柚皮苷（1.00520），可作為酸橙和甜橙基原鑒別的潛在質量標志物，用于評價枳實的質量差異。

圖6 31批枳實樣品PLS-DA得分圖

圖7 31批枳實樣品指紋圖譜共有峰VIP圖

2.1.9 含量測定

2.1.9.1 線性關系考察

精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液，分別稀釋成不同濃度的混合對照品溶液。按“2.1.1”項下色譜條件進行檢測，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標進行回歸，結果見表4。相關系數（r）＞0.9990，表明各成分在相應定量范圍內線性關系良好。

表4 11種成分線性關系考察結果

2.1.9.2 精密度考察

取“2.1.2”項下混合對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6次，結果顯示柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、川陳皮素、柚皮素、水合橙皮內酯、異橙黃酮、異橙皮內酯、橘皮素、野漆樹苷、蕓香柚皮苷11個成分峰面積RSD分別為0.27%、0.40%、0.37%、1.83%、0.13%、0.95%、0.43%、1.87%、0.30%、0.53%、0.78%，表明儀器精密度良好。

2.1.9.3 重復性試驗

精密稱取6份枳實藥材粉末（SC1），按“2.1.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件檢測，結果柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、川陳皮素、柚皮素、水合橙皮內酯、異橙黃酮、異橙皮內酯、橘皮素、野漆樹苷、蕓香柚皮苷11個成分峰面積RSD分別為0.90%、0.39%、0.25%、0.48%、0.45%、0.96%、0.77%、1.67%、0.48%、0.91%、0.87%，表明該方法重復性較好。

2.1.9.4 穩定性試驗

取“2.1.3”項下1份供試品溶液，分別于制備后0、3、6、9、12、15、18、24 h，按“2.1.1”項下色譜條件進行檢測，結果柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、川陳皮素、柚皮素、水合橙皮內酯、異橙黃酮、異橙皮內酯、橘皮素、野漆樹苷、蕓香柚皮苷11個成分峰面積RSD分別為0.65%、0.57%、0.63%、0.66%、0.73%、0.75%、0.89%、0.89%、0.90%、1.23%、0.86%，表明供試品溶液在24 h內穩定性較好。

2.1.9.5 加樣回收率試驗

精密稱取已知成分含量的枳實藥材粉末（SC1）9份，每份0.25 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再分別加入與所取供試品中待測成分量比例為1.5∶1、1∶1、0.5∶1的對照品，按“2.1.1”項下色譜條件進行檢測，并計算回收率。柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、川陳皮素、柚皮素、水合橙皮內酯、異橙黃酮、異橙皮內酯、橘皮素、野漆樹苷、蕓香柚皮苷的回收率分別為98%、97%、95%、101%、102%、99%、98%、90%、98%、101%、95%，表明該方法準確性良好。

2.1.9.6 樣品測定

按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件檢測，31批枳實藥材中11個指標成分的含量測定結果見表5。柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、異橙皮內酯、橘皮素、蕓香柚皮苷為酸橙和甜橙共有成分，其中21批酸橙上述6種成分平均質量分數為6.039%、1.108%、0.153%、0.051%、0.128%、0.844%，10批甜橙平均質量分數分別為0.009%、7.577%、0.121%、0.078%、0.055%、1.134%；酸橙中的特有成分新橙皮苷、柚皮素、水合橙皮內酯、異橙黃酮、野漆樹苷平均質量分數為11.454%、0.156%、0.226%、0.129%、0.081%。通過含量測定結果箱線圖（見圖8），能直觀區分酸橙和甜橙中代表性成分，酸橙中柚皮苷、新橙皮苷、川陳皮素、柚皮素、水合橙皮內酯、異橙黃酮、橘皮素、野漆樹苷含量整體高于甜橙，甜橙中橙皮苷、異橙皮內酯、蕓香柚皮苷含量顯著高于酸橙。不同產地酸橙枳實黃酮類成分離散程度較大，甜橙指標成分含量相對集中，無產地差異性。酸橙和甜橙黃酮類成分差異顯著，推測可能與枳實瓤囊面積占比有關，酸橙的瓤囊面積占比較小，即中果皮相對較厚。石敬依等[8]對比研究不同產地枳實肉和瓤指紋圖譜和6個黃酮類成分差異性，枳實肉標定17個共有峰，枳實瓤中標定10個共有峰，推測枳實中黃酮類成分主要存在于中果皮中。即酸橙枳實的總黃酮含量高與其果皮比甜橙較厚有一定相關性。

圖8 酸橙與甜橙樣品中11種成分含量測定箱線圖

表5 31批枳實樣品中11個成分含量測定結果（%）

2.2 不同基原枳實與色度值相關性分析

中藥色度分析借助色度儀將藥材的顏色轉換成具體數值進行藥材顏色和質量之間相關性的研究，通過藥材的色度值評價藥材質量[9]。2020年版《中華人民共和國藥典》規定枳實性狀為黃白色或黃褐色，顏色跨度較大。觀察多批次枳實粉末發現，酸橙與甜橙顏色差異明顯[10]。其顏色變化可能與主要黃酮類成分具有一定相關性。為進一步驗證上述觀點，本研究基于色度學原理將枳實藥材的外在顏色進行色度值量化，結合含量測定和統計學分析工具評價其質量差異性。

2.2.1 色度測量方法建立

2.2.1.1 供試品制備

取31批枳實藥材，粉碎，過4號篩，即得。

2.2.1.2 分光測色儀參數

采用國際照明委員會（CIE）認可光源，以反射光為測色模式，采用L*、a*、b*色空間，其中L*值代表明度，可用于藥材色澤判斷；a*值代表紅（+）綠（-）方向；b*值代表黃（+）藍（-）方向，觀察光源為D65（即色溫度6504K的自然日光），視野角度為10°，以4 mm為視角測定口徑。

2.2.1.3 方法學考察

按上述分光測色儀參數條件，取枳實藥材供試品（編號SC1）進行連續6次的色度測定，記錄L*、a*、b*值，并計算相應的總色度值（E*ab），RSD分別為0.96%、0.88%、1.02%、1.13%，均小于3%，表明儀器精密度較好。

2.2.1.4 供試品色度測定

將分光測色儀進行黑白校正后，分別對31批枳實供試品進行色度測定，每批各測定3次，記錄L*、a*、b*值，計算E*ab，E*ab=（a*2+b*2+L*2）1/2，取平均值，結果見表6。酸橙E*ab為51.48～68.63，甜橙E*ab為73.33～77.85，酸橙總色度值低于甜橙。

表6 31批枳實藥材色度測定結果

2.2.2 樣品色度值與有效成分含量相關性

將31批枳實藥材色度值測定及11個成分含量測定結果導入SPSS20.0統計軟件，進行相關性分析，結果見表7。E*ab與橙皮苷和異橙皮內酯含量呈顯著正相關，與柚皮苷、新橙皮苷、川陳皮素、柚皮素、水合橙皮內酯、異橙黃酮、橘皮素和野漆樹苷含量均呈顯著負相關；L*與橙皮苷的含量呈正相關，與柚皮苷、新橙皮苷、川陳皮素、柚皮素、水合橙皮內酯、異橙黃酮、橘皮素、野漆樹苷含量呈負相關；a*與柚皮苷、新橙皮苷、異橙黃酮、野漆樹苷含量呈顯著正相關，隨橙皮苷、異橙皮內酯含量的升高而降低；b*與柚皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內酯、異橙黃酮、橘皮素及野漆樹苷的含量呈正相關，隨橙皮苷含量增加而降低。綜合考慮，認為柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、異橙黃酮和野漆樹苷的含量可能是導致酸橙和甜橙藥材外在顏色差異性的主要成分。

表7 枳實藥材色度值與有效成分含量相關性（r）

3 討論

本試驗共收集31批來自道地產區江西宜春、江西九江、江西吉安及湖南益陽的2種基原枳實，由于廣東產區枳實年產量較少，批次較少，質量不及道地產區江西、湖南兩地，故未納入[11]。采用UPLC對21批酸橙和10批甜橙建立了指紋圖譜，其中酸橙確認了24個共有峰，指認其中11個成分，甜橙確認了11個共有峰，指認其中6個成分。21批酸橙樣品的指紋圖譜相似度均在0.935以上，10批甜橙樣品的指紋圖譜相似度均大于0.937，表明21批酸橙和10批甜橙的整體質量相對穩定。同時運用化學模式識別方法聚類分析、PCA及PLS-DA對31批枳實的指紋圖譜進行分析，結果顯示，3種分析方法均可將不同基原枳實明顯區分為2類，其中野漆樹苷、川陳皮素、水合橙皮內酯、橙皮苷、新橙皮苷、異橙黃酮、柚皮苷及峰3、峰12、峰13、峰9、峰20、峰23、峰24所代表的成分可能是影響不同基原枳實質量差異性的標志性成分；結合聚類分析、PCA及PLS-DA結果，篩選出11個已指認的指標成分進行定量分析，結果顯示，酸橙中含量最高的成分為柚皮苷和新橙皮苷，柚皮苷質量分數為4.080%～8.401%，新橙皮苷質量分數為4.901%～15.109%，甜橙中的成分則以蕓香柚皮苷、橙皮苷為主，蕓香柚皮苷質量分數為0.888%～1.629%，橙皮苷質量分數為5.242%～10.237%，表明本研究篩選出的中藥特征性標志物方法比較全面、科學。2020年版《中華人民共和國藥典》規定枳實的定量指標為辛弗林，本實驗室對收集的31批枳實辛弗林含量進行測定，酸橙和甜橙中辛弗林含量無顯著區別，且不是含量最高的成分，指標成分單一，從全面質量控制角度考慮，建議將柚皮苷、新橙皮苷引入酸橙質量控制指標，蕓香柚皮苷和橙皮苷納入甜橙質量控制標準。

為進一步區分枳實的不同基原，探究枳實的質量指標與其色度值之間的相關性，本研究對31批枳實藥材粉末進行色度值測定與分析。結果表明，酸橙E*ab為51.48～68.63，甜橙E*ab為73.33～77.85，酸橙E*ab明顯低于甜橙。由此表明，不同基原的枳實存在色度值差異，可能是由酸橙與甜橙藥材中柚皮苷、新橙皮苷及橙皮苷等主要黃酮類成分含量差異導致的。

綜上，本研究從定性和定量兩方面分別對2種基原枳實進行研究，所建立的指紋圖譜和含量測定方法簡單快速、方便穩定、重復性好，與化學模式識別分析相結合，可用于酸橙和甜橙藥材不同基原和不同產地間的質量評價，橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、異橙黃酮、野漆樹苷等11個成分可能是造成二者質量差異的主要成分。將色度分析與統計學分析相結合，可作為快速鑒別酸橙和甜橙的新方法，為枳實不同基原間的鑒別和質量評價提供參考。