桃核承氣湯對慢性腎衰竭大鼠Wnt4/β-catenin信號通路中p-GSK-3β的影響*

朱為坤 張喜奎 林雅銀 陳全文 林艷藍 李靈輝

慢性腎衰竭(Chronic renal failure,CRF)是腎臟及腎臟相關性疾病的最終歸宿,相當于慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)的4～5期。腎纖維化(Renal fibrosis,RIF)包括腎小球硬化和腎間質纖維化,是各種腎臟疾病發展至終末期腎衰的共同病理基礎和必要環節。對于RIF的治療,現代醫學尚無突破性進展,臨床觀察發現中醫藥在改善RIF,延緩CRF方面有一定療效,其機制值得深入研究。桃核承氣湯出自《傷寒雜病論》,具有活血化瘀、通腑泄濁之功,用于治療瘀熱蘊結下焦之證,其病機與RIF相符。本項目以5/6腎切除大鼠CRF模型為載體,通過檢測Wnt4、p-GSK-3β、β-catenin等蛋白含量及光鏡觀察腎組織,研究桃核承氣湯對CRF大鼠Wnt4/β-catenin通路中p-GSK-3β的影響,探討該方改善RIF、延緩CRF的可能機制。

1 材料

1.1 實驗動物清潔級雄性 Wistar大鼠100只(上海斯萊克實驗動物有限責任公司),7周齡,體質量 180～200 g,飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心。

1.2 實驗藥物注射用青霉素鈉,400萬IU/支(華北制藥股份有限公司);水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司),配成10%濃度[桃核承氣湯:福建中醫藥大學附屬第二人民醫院提供中藥飲片,桃仁12 g,生大黃(后下)12 g,桂枝6 g,炙甘草6 g,芒硝(沖)6 g],煎煮并濃縮為42 g/100 ml的溶液。

1.3 主要試劑Wnt4抗體(北京bioss公司,批號20785R);β-catenin 抗體 (美國ABCAM公司,批號32572);p-GSK-3β抗體(北京bioss公司,批號5368R);β-actin 抗體(武漢proteintech公司,批號66009-1-Ig)。

1.4 主要儀器光學顯微鏡(德國Leica公司);APC300電泳儀(美國BIO-RAD公司);Bio-rad Trans-Blot 小型轉印槽轉膜儀(美國BIO-RAD公司);ChemiDocXRS+化學發光成像系統(美國BIO-RAD公司)。

1.5 實驗方法

1.5.1 分組與造模100只Wistar大鼠,適應性飼養l周后,隨機分為正常組、假手術組、模型組、治療組,每組25只。參照王瑞強等[1]建模方法,模型組與治療組均行5/6腎切除手術大鼠麻醉后俯臥位固定在鼠臺上,手術切除2/3的左腎組織,術后注射青霉素,連用3 d。1周后進行第2次手術,切除全右腎,同樣予青霉素注射3 d。假手術組的手術過程同模型組,但不切除腎組織,僅做雙腎被膜剝離。正常組不做任何處理。術后3周,各組大鼠眼底靜脈叢采血,檢測血清肌酐(Scr)。結果顯示,與正常組和假手術組對比,治療組、模型組的Scr水平明顯增高,提示造模成功。

1.5.2 給藥干預術后4周每天上午9時給藥:治療組予桃核承氣湯4.2 g/kg灌胃,正常組、假手術組、模型組分別予等量生理鹽水灌胃,劑量均根據臨床上成人每公斤體質量用量的6倍換算而成,給藥時間共為8周。每周給大鼠稱重1次,并根據最新體質量調整藥量。

1.6 標本采集

1.6.1 血液給藥后第57天上午,大鼠麻醉后采集腹主動脈血液,用于測定血常規中紅細胞(RBC)、血紅蛋白(Hb)和腎功能中Scr、尿素氮(BUN)。

1.6.2 腎組織采血后,取出大鼠左腎(模型組和治療組為左殘余腎),一部分行蘇木精-伊紅(HE)染色,用于光鏡觀察;另一部分用于檢測腎組織Wnt4、p-GSK-3β和β-catenin的蛋白含量。

1.7 檢測方法

1.7.1 Western Blot將腎組織剪切成小塊裝入EP管中加入RIPA裂解液及蛋白酶/磷酸酶抑制劑,研磨組織,收集蛋白上清液,BCA法測定蛋白濃度,100 ℃煮樣5 min使蛋白變性。配制10%SDS-PAGE電泳凝膠,加入各組蛋白樣品,經電泳分離蛋白后,采用半干式電轉儀將目的蛋白轉移至PVDF膜上,TBST清洗,室溫封閉1 h后加入一抗(Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β抗體稀釋濃度比例分別為:1∶1000、1∶5000、1∶1000),4 ℃ 搖床孵育過夜。TBST充分洗膜后,加入相應HRP標記的二抗(1∶3000),搖床室溫孵育1 h。TBST充分洗膜后,暗室中滴加增強型化學發光劑(ECL發光劑)于膜上,曝光、顯影、定影,Quantity One圖像分析系統檢測各目的蛋白光密度值,以β-actin為內參,對比分析各目的蛋白表達水平。

1.7.2 腎組織觀察將大鼠腎組織修剪后脫水,石蠟包埋,而后切成每片厚2 μm的薄片,置于載玻片上,于60 ℃恒溫箱烤片1 h,HE染色,中性樹膠封片,光鏡觀察。

1.8 統計方法采用SPSS 26.0軟件分析實驗數據。計量資料采用均數±標準差表示;各組間比較采用單因素方差分析;如各組間存在差異,則繼續組間兩兩比較,方差齊采用LSD法,方差不齊采用Games-Howell法。從P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況觀察正常組和假手術組:精神狀態良好,反應靈敏,皮毛有光澤,能正常進食、飲水,二便正常。模型組:精神較為萎靡,反應遲鈍,體質量增長緩慢,體毛干枯無光澤且易脫落。治療組大鼠的各項情況介于正常組和模型組之間。

2.2 各組大鼠存活情況比較各組大鼠在實驗過程中,出現不同程度的死亡,模型組死亡數量最多,治療組次之,正常組死亡最少。主要死亡原因可能是手術過程中麻醉過量、大出血或傷口感染,部分可能因灌胃不當或腎衰竭死亡。見表1。

表1 各組大鼠存活情況比較 (只,%)

2.3 各組大鼠血常規結果RBC計數及Hb含量,與正常比較,假手術組差異無統計學意義(P>0.05);模型組、治療組顯著降低(P<0.05)。RBC計數及Hb含量,治療組比模型組顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血常規比較 (只,

2.4 各組大鼠腎功能比較血清Scr、BUN含量,與正常比較,假手術組差異無統計學意義(P>0.05);模型組、治療組顯著升高(P<0.05)。血清Scr、BUN含量,治療組比模型組顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腎功能比較 (只,

2.5 各組大鼠Western Blot法檢測比較Wnt4、p-GSK-3β、β-catenin 蛋白含量,與正常組比較,假手術組差異無統計學意義(P>0.05);模型組、治療組顯著升高(P<0.05)。Wnt4、p-GSK-3β、β-catenin 蛋白含量,治療組比模型組顯著降低(P<0.05)。見圖1,表4。

圖1 各組大鼠Wnt4 p-GSK-3β β-catenin蛋白表達水平

表4 各組大鼠Wnt4 p-GSK-3β β-catenin蛋白含量比較 (只,

2.6 各組大鼠腎組織比較正常組、假手術組:腎組織形態及結構完整,均未見腎小球、腎小管及間質的病理改變。模型組:腎組織結構紊亂,可見大量炎癥細胞浸潤,腎小球結構固縮,基膜增厚,腎小管擴張,腎間質纖維增生嚴重。治療組:部分腎組織形態結構基本正常,部分出現病理改變,程度介于正常組和模型組之間。見圖2。

圖2 腎組織HE染色光鏡圖(400×)

3 討論

桃核承氣湯出自《傷寒雜病論》,其第106條言:“太陽病不解,熱結膀胱,其人如狂,血自下,下者愈。其外不解者,尚未可攻,當先解其外,外解已,但少腹急結者,乃可攻之,宜桃核承氣湯”。該方主治瘀熱結于下焦證,臨床上可見少腹疼痛、脹滿、拘急、煩躁不安、發狂等證候。桃核承氣湯由桃仁、大黃、芒硝、桂枝、炙甘草組成。桃仁苦甘平,活血祛瘀、潤腸通便,《神農本草經》謂其可“去瘀血、血閉、癥瘕、邪氣”,《本草經疏》言其“性善破血,散而不收,瀉而無補”;大黃苦寒,瀉下攻積、清熱瀉火解毒、化瘀止血,《神農本草經》言其可“下瘀血、血閉寒熱,破癥瘕積聚,蕩滌腸胃,推陳致新……安和五臟”,《藥品化義》載:“大黃氣味重濁,直降下行,走而不守,有斬關奪門之力……用此開導陽邪,宣通澀滯,奏功獨勝”,二者合用,氣血通行,使瘀熱從下而走,共為君藥。芒硝咸苦寒,《珍珠囊》言:“其用有三,去實熱……滌腸中宿垢……破堅積熱塊”,可助大黃泄熱通便;桂枝辛甘溫,《本經疏證》言:“其能和營、通陽、利水、下氣、行水、補中”,可助桃仁活血化瘀、通利血脈,又防大黃、芒硝苦寒太過,二者為臣。炙甘草甘平為佐使,既可調和寒溫諸藥之用,又能補中護中,防止偏性之品損傷中氣。《傷寒來蘇集》言:“氣留不行,故君大黃之走而不守者,以行其逆氣;甘草之甘平者,以調和其正氣;血結而不行,故用芒硝之咸以軟之,桂枝之辛以散之,桃仁之苦以泄之”。全方共奏活血化瘀,通腑泄濁之功。

腎位于下焦,RIF屬于中醫“水腫、溺毒”等范疇[2],兩者之間具有正相關性[3]。CRF存在高凝狀態,與凝血因子水平異常,血管內皮細胞、血小板、抗凝系統等功能異常相關。桃核承氣湯中桃仁、大黃、桂枝有活血化瘀、行氣通脈的作用,能夠改善RIF,延緩CRF。CRF與RIF均存在腎小球濾過率(GFR)下降的病理變化,導致Scr、BUN、胺類、酚類等毒素在體內蓄積,影響全身各系統功能。這些毒素屬于中醫“濁毒”范疇。桃核承氣湯中大黃、芒硝、桃仁均能促進排便,使體內的毒素從大便而出,起到降濁祛毒的功效。臨床觀察發現,在西醫基礎治療的前提下,加用核桃承氣湯輔治早中期CRF,比單純的西醫治療,能更好地改善中醫證候積分、腎功能,降低CRP、IL-6、TNF-α、MDA等,升高Ccr、TAC、SOD等,提高臨床療效[4]。桃核承氣湯聯合中藥灌腸,可有效緩解CRF患者臨床癥狀,改善機體營養狀況,降低IL-1、IL-6、hs-CRP、TNF-α等炎性因子水平、改善腎功能[5]。

RIF與Wnt/β-catenin信號通路密切相關。β-catenin蛋白可調節細胞增殖、分化和凋亡[6],促進RIF。Wnt蛋白減少時,降解復合物中的GSK-3β將β-catenin磷酸化,使其含量下降,阻止了信號傳導;Wnt蛋白增多時,激活GBP蛋白,使其與GSK-3β結合,形成無活性的p-GSK-3β,從而抑制β-catenin的降解,使其含量增多,促進信號通路傳導。Wnt4可以激活β-catenin依賴的Wnt信號通路[7],參與RIF進程,且RIF的程度與p-GSK-3β蛋白表達相關[8]。實驗研究發現桃核承氣湯可改善CRF大鼠腎功能,降低血Scr、BUN,降低腎小球硬化指數,改善RIF,從而延緩CRF的進程[9]。另有研究發現,桃核承氣湯對RIF大鼠的保護作用機制可能與抑制腎組織中Wnt/β-catenin和Notch-Hes1信號通路相關[10], 也可能與調節磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶1(PCK1)等蛋白,影響AMPK、Fox O/Wnt、PPAR、HIF-1等信號通路相關[11]。

本團隊圍繞“桃核承氣湯治療CRF的作用機制”開展了系列研究,發現在以5/6腎切除CRF大鼠模型為載體的實驗研究中,桃核承氣湯能改善腎微炎癥狀態,改善RIF,延緩CRF發展進程,其機制可能是上調BMP-7、MMP-2,下調TIMP-2;也可能與調控腎的TGF-β1/Smad信號通路和Wnt/β-catenin信號通路有關[12,13]。但是桃核承氣湯對CRF大鼠Wnt4/β-catenin通路中p-GSK-3β是否有影響,尚不明確。通過本研究發現,桃核承氣湯對CRF大鼠的影響主要有以下幾個方面:①提高RBC計數和Hb含量水平,有效改善貧血;②抑制Scr、BUN的升高,調節腎功能;③抑制Wnt4、p-GSK-3β和β-catenin 蛋白的升高;④腎組織觀察,治療組部分腎組織形態結構基本正常,部分出現病理改變,程度介于正常組和模型組之間,說明在改善RIF,減輕炎癥,延緩CRF等方面,桃核承氣湯具有一定療效。由此可以推測,其機制可能是通過抑制Wnt4、p-GSK-3β、β-catenin蛋白來調節Wnt4/β-catenin信號通路。