基于差異表達基因研究探討冠心病心絞痛模型大鼠穴位痛敏化的發生機制

劉雪瑩 付紅娟 任彥蓉 齊文川 梁繁榮

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease, CHD)是由于冠狀動脈粥樣硬化導致心肌缺血、缺氧而引起以心絞痛、心律失常等為主要臨床表現的疾病[1]。國內外眾多研究證實針刺對缺血心肌具有保護作用[2-4]。臨床治療CHD心絞痛多選用心經、心包經穴位,其中內關穴使用頻率最高。研究團隊在前期臨床試驗中的研究表明CHD心絞痛患者會出現穴位敏化現象。穴位敏化是指機體在疾病狀態下,陰平陽秘被打破,氣血陰陽發生變化,腧穴由“沉寂態”變為“激活態”的過程,這跟機體的生理病理狀態變化有關,能夠實時和動態的反映臟腑的功能狀態[5]。但目前關于穴位敏化的產生機制研究尚顯不夠。近年來差異表達基因研究被越來越多的應用于疾病機制的研究中,這也為穴位敏化發生的生物學機制研究提供了新的思路和平臺[6-9]。本研究以穴位敏化理論為基礎,通過轉錄組測序,篩選出CHD心絞痛模型大鼠敏化穴位組織中差異性表達的mRNA,并進行生物信息學分析,明確其生物學功能,從基因調控的角度研究參與穴位敏化發生過程的mRNA及其調控機制,為進一步研究穴位敏化現象提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康SPF級雄性SD大鼠20只,6～8周齡,體質量(200±10)g,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[生產許可證號:SCXK(湘)2019-0004],飼養于成都中醫藥大學針灸推拿學實驗研究中心節律室,飼養條件為12小時明暗交替,室溫16～28℃,濕度40%～70%。實驗前適應性飼養1周,常規喂食標準飼料和自由飲水。按照隨機數字表法將實驗動物分為空白組(Cc組)、模型組(Tc組),每組10只。實驗方案獲得了成都中醫藥大學醫學和實驗動物倫理委員會的批準。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器:PowerLab多導生理記錄儀(澳大利亞AD Instruments公司),電子測痛儀Electric VonFrey(美國 IITC Life Science Inc公司),轉輪式切片機(徐卡RM2016,德國LEICA公司),高速低溫組織研磨儀(武漢賽維爾生物科技有限公司),干浴器干式恒溫金屬浴(上海達洛科學儀器有限公司),Bio-rad-CFX96、LineGene9600均購于杭州博日科技有限公司,QuantStudio 5 Real-Time PCR System(美國應用生物系統公司)。

主要試劑:Isofluranee(深圳市瑞沃德生命科技有限公司),10%中性甲醛固定液(福晨化學試劑有限公司),二甲苯(成都市科隆化學有限公司),蘇木素染液、伊紅染液均購于珠海貝索生物技術有限公司,中性樹膠(Biosharp生物公司),Animal Total RNA Isolation Kit、2×RT OR-EasyTM Mix、2×Real PCR EasyTM Mix-SYBR均購于成都福際生物技術有限公司。

1.3 模型制備

參考相關文獻[10],采用腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素(isoprenaline hydrochloride,ISO)構建大鼠心絞痛模型;空白組腹腔注射生理鹽水構建對照模型。注射劑量均為2 mg/kg,每24小時注射1次,連續注射14天。

在造模前一天和造模后一天使用PowerLab7多導電生理記錄儀進行心臟電生理參數檢測和斜方肌肌電信號檢測,將大鼠用異氟烷呼吸麻醉后,仰臥于操作臺上,將電極淺刺入大鼠肢體皮下,右前肢近心端接電極負極,右后肢近心端接地線,左后肢近心端接電極正極,記錄大鼠的心率及心電圖變化情況;剔除大鼠頸部及左側背部毛發,暴露左側背斜方肌,同芯電極以約30°角斜插入左側背斜方肌,插入深度約為1.5～1.7 mm,記錄左側背斜方肌的肌電信號[11]。并于造模結束后麻醉大鼠,取心臟組織放入10%中性甲醛固定液中。采用蘇木素—伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)法,對心臟組織進行脫水、包埋、切片、染色、封片后,分別于100倍和400倍下采集圖片,觀察兩組大鼠的心肌組織病理形態變化。

造模成功標準:(1)模型組大鼠心電圖ST段明顯抬高[10,12],見圖1。(2)模型組大鼠左側背斜方肌肌電信號明顯增強,表明注射ISO會引發大鼠心臟產生疼痛反應,見圖2。(3)模型組大鼠心肌組織可見不等量的心肌纖維壞死,壞死區不同程度纖維組織增生,以成纖維細胞和纖維細胞增生為主,壞死區域內或間質內可見炎性細胞浸潤,包括少量單個圓形深染核的淋巴細胞、桿狀核的中性粒細胞和細胞較小,核圓偏于細胞一側的漿細胞,見少量紅細胞溢出,壞死區可見新生毛細血管形成。見圖3。

圖1 造模后大鼠心電圖(Ⅱ導聯)

圖2 造模后大鼠背斜方肌肌電圖

注:A:空白組;B:模型組。藍色箭頭示淋巴細胞,橙色箭頭示成纖維細胞,黃色箭頭示纖維細胞,紅色箭頭示新生毛細血管。

1.4 實驗指標檢測與方法

1.4.1 穴位敏化檢測 (1)穴位選擇與定位:選取大鼠雙側手厥陰心包經上內關穴為特異性經穴,另選擇尺澤穴為他經穴位,大鼠臀大肌隆起處為非經非穴。根據由中國針灸學會實驗針灸委員會制定的實驗動物穴位圖譜,取穴定位如下:內關穴:前肢內側,離腕關節約3 mm左右的尺橈骨縫間。尺澤穴:肘彎橫紋偏外凹陷中。非經非穴:大鼠臀大肌隆起處,距環跳穴(后肢髖關節后上緣)外側5 mm[10]。

(2)穴位機械痛閾檢測:采用Electric VonFrey 測痛儀檢測造模前和造模后空白組和心絞痛模型組大鼠雙側內關穴、尺澤穴、非經非穴的機械痛閾值。于檢測前一天剃除大鼠待檢測穴位皮膚毛發。檢測當天校正儀器,將大鼠固定在自制鼠臺上,將探針頭對準檢測穴位,垂直、緩慢下壓,用力均勻,待大鼠出現嘶叫、甩尾、伸足、縮足等躲避反應時移開探針,讀取此時顯示屏上數值。每個穴位檢測3次,每次檢測間隔3分鐘以上,取3次數值的平均值,若3次檢測數值相差5以上,則重新檢測。

(3)穴位敏化判定:參考相關文獻[12],以造模前后穴位痛閾值變化率為標準,判斷穴位是否發生敏化。痛閾值變化率=(造模后痛閾值-造模前痛閾值)/造模前痛閾值。比較空白組和模型組痛閾值變化率,找出敏化穴位。

1.4.2 轉錄組測序 選取心絞痛模型組敏化穴位及空白組對應穴位皮膚及皮下組織3 mm×3 mm×3 mm,生理鹽水沖洗干凈,置于凍存管中迅速投入液氮,干冰送至南京派森諾基因科技有限公司檢測。使用TRIZOL試劑提取總RNA,采用Agilent 2100 Bioanalyzer進行總RNA的檢測,檢測后純化mRNA。

用Oligo(dT)珠富集帶有polyA結構的mRNA,采用離子打斷方式,將RNA長度打斷成大小為300 bp左右的片段。用6堿基隨機引物和逆轉錄酶,以RNA為模板合成cDNA第一鏈,再以第一鏈cDNA為模板,合成cDNA第二鏈。構建文庫,并對文庫進行質檢。在Illumina測序平臺用第二代測序技術,進行文庫的雙末端測序。利用DESeq對基因表達差異進行分析,篩選出表達差異倍數|log2FoldChange|>1、顯著性P<0.05的差異表達基因,并對其進行GO和KEGG富集分析。

1.4.3 RT-qPCR驗證 參考相關文獻[15-23],挑選出9個與炎癥、疼痛、肥大細胞有關的差異表達基因進行RT-qPCR驗證,這9個基因分別是Nqo2、Adam11、Gpr65、Ghrhr、Angptl4、Krt16、Mmp11、Chrna1、Hmgcs2,內參基因為Gapdh,引物序列見表1。使用動物組織總RNA提取試劑盒(帶gDNA清除柱)提取總RNA,用10 μL RNA溶液和10 μL 2×RT OR-EasyTMMix進行逆轉錄反應,并于42℃金屬浴中反應30分鐘,72℃金屬浴中反應10分鐘。將最終得到的溶液稀釋10倍后進行RT-qPCR反應,反應體系為:10 μL 2×Real PCR EasyTMMix-SYBR、10 μL樣本和上下游引物各0.3 μL。將10 μL基因特異性qPCR反應液和10 μL樣品加入96孔板中,置于實時定量PCR儀中運行,程序如下:95℃,20 s;(95℃,20 s;60℃,20 s)40 cycles;添加溶解曲線。

表1 引物序列

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 穴位敏化檢測結果

Shapiro-Wilk test檢驗提示,雙側內關穴、尺澤穴和非經非穴符合正態分布,使用獨立樣本t檢驗。

與空白組相比,模型組雙側內關穴痛閾值顯著降低,差異具有統計學意義(P<0.05),表明模型組大鼠左、右內關穴均發生了痛敏化現象。雙側尺澤穴、雙側非經非穴痛閾值變化率組間比較差異不具有統計學意義(P>0.05),沒有發生痛敏現象。見表2。

表2 造模前后大鼠痛閾值變化率組間比較鼠只=9)

2.2 差異表達基因篩選結果

通過對空白組和模型組mRNA表達進行分析比較,發現敏化穴位(內關穴)局部的差異表達mRNA共45個,其中上調16個,下調29個,見表3、圖4。

表3 兩組大鼠差異表達mRNA篩選

注:圖中兩條豎虛線為2倍表達差異閾值,橫虛線為P值=0.05閾值;紅點表示該組上調基因,藍點表示該組下調基因,灰點表示非顯著差異表達基因;C為空白組,T為模型組。

2.3 差異表達基因GO富集分析和KEGG通路分析

通過GO富集結果、Rich factor值、FDR值和富集到該GO Term的基因數來衡量富集程度。其中,富集因子(Rich factor)為GO Term中富集到的差異基因數與注釋的基因數之比。富集程度越高,Rich factor值越高。FDR取值范圍0～1,富集越顯著時,FDR值越接近于0。挑選出FDR值最小的前20個GO Term條目,即富集最顯著的進行展示,結果表明差異表達基因參與的生物過程包括表皮細胞分化、蛋白變性等;細胞組分包括HAUS復合物、超分子聚合物等;分子功能包括煙酰胺核糖苷還原酶活性、羥甲基戊二酰輔酶a裂合酶活性等,見圖5～6。

圖5 GO富集分析柱狀圖

圖6 GO富集分析氣泡圖

通過KEGG富集結果、Rich factor值、FDR 值和富集到該通路的基因數量來衡量富集程度。其中,Rich factor為該通路中富集的差異基因數與注釋基因數之比。富集程度越高,Rich factor值越高。選取FDR值最小,即富集最顯著的前20條KEGG通路進行展示,結果表明差異表達基因參與的信號通路包括PPAR信號通路、雌激素信號通路等,見圖7～8。

圖7 KEGG富集分析柱狀圖

圖8 KEGG富集分析氣泡圖

2.4 RT-qPCR驗證結果

對9個差異表達的mRNA進行RT-qPCR驗證,通過溶解曲線分析得出,除內參外,其余基因均為單一峰,表明PCR擴增特異性較好。RT-qPCR 結果如表4所示,模型組與空白組比較,Adam11表達上調,差異有統計學意義(P<0.05),與轉錄組測序結果一致;Gpr65、Nqo2表達上調,差異無統計學意義(P>0.05),與轉錄組測序結果不一致;Angptl4、Chrna1、Hmgcs2、Krt16表達下調,差異無統計學意義(P>0.05),與轉錄組測序結果不一致;Ghrhr、Mmp11表達下調,與轉錄組測序結果一致,但差異無統計學意義(P>0.05)。

表4 RT-qPCR驗證結果組間比較鼠只=6)

3 討論

CHD屬于中醫“胸痹”“心悸”“真心痛”等范疇,針灸作為中醫傳統療法已被證實在治療CHD心絞痛方面取得了確切的療效[24]。針灸治療CHD多選用內關穴,內關穴是手厥陰心包經的絡穴,“循經以上,系于心包,絡心系”,有著理氣寬胸、活血祛瘀的作用[25]。同時內關穴也是八脈交會穴,通于陰維脈,“陰維為病,苦心痛”。在大量的數據挖掘研究中發現,CHD患者會出現穴位敏化現象,主要表現為:(1)穴位熱敏現象,穴位溫度改變。(2)穴位力敏現象,按壓穴位時出現酸、麻、脹、痛等感覺的改變。(3)穴位光敏現象,CHD患者相關穴位紅外輻射強度在與健康人之間存在差異。(4)穴位形敏現象,穴位皮膚發生色澤、形態改變。(5)穴位電敏現象,CHD患者相關穴位皮膚電阻顯著升高,左右電阻失衡。(6)穴位痛敏現象,CHD患者相關穴位痛閾值降低。在所有發生敏化的穴位當中,內關穴敏化頻次最高,且CHD目前所涉及到的所有敏化形式都在內關穴被檢測到,是CHD穴位敏化現象運用于臨床診治的代表性穴位[5]。穴位敏化是指機體疾病狀態下,腧穴由“沉寂態”轉化為“激活態”的過程,能夠幫助診斷和治療疾病,指導針灸臨床選穴。本實驗采用Electric Vonfrey 測痛儀檢測造模前后CHD心絞痛模型大鼠和空白組大鼠穴位機械痛閾值,比較兩組大鼠痛閾值變化率,結果顯示模型組大鼠雙側內關穴機械痛閾值明顯降低,說明內關穴發生痛敏化現象。該結果也與團隊臨床檢測結果一致。但本研究僅采用穴位機械痛閾值變化率來判斷穴位是否發生敏化,評判標準較為單一,還應將其它穴位敏化檢測指標一并納入檢測,如穴位溫度、穴位電阻、感覺神經定位檢測等,多角度評估穴位敏化。

差異表達基因研究是近年來的研究熱點,被越來越多的應用于疾病機制的研究中。翟雪芹等[8]探索研究了冠狀動脈粥樣硬化性心臟病穢濁痰阻證患者差異表達基因及相關信號通路,發現穢濁痰阻證與CHD非穢濁痰阻證患者存在顯著的差異表達基因,這些差異表達基因顯著富集在與CHD相關的多條功能通路中,從分子水平闡明了其穢濁痰阻證的生物學特點。樊小農等[9]利用基因芯片技術對老年癡呆進行相關基因表達譜研究,探討差異表達基因在老年癡呆病理機制中的作用。差異表達基因的研究也為穴位敏化發生的分子生物學機制研究提供了新的思路和平臺,通過對敏化穴位相關差異性表達基因的研究,探索穴位敏化發生的機制。在有關穴位敏化發生機制的研究中,前人有從神經生物學方面進行探究,崔翔[26]研究發現穴位敏化的發生可能與交感神經有關,胡瑞斌等[27]在后續的研究中發現交感神經興奮會激活背根節中型神經元表達CGRP來介導穴位敏化的發生。但從差異表達基因方面入手探索穴位敏化產生機制的研究還略顯不足。本實驗在此方向進行探索研究,通過對大鼠敏化穴位(內關穴)皮膚及皮下組織進行轉錄組學分析,發現差異表達mRNA共45個,并對這些差異表達的mRNA進行生物學分析,發現了差異表達基因參與的生物過程和信號通路,如PPAR信號通路、雌激素信號通路等。參考相關文獻[28-30],這些信號通路可能與穴位痛敏化發生機制有關,有待進一步研究。

在得出的差異表達基因中,進一步通過搜索文獻找到與炎癥、疼痛、肥大細胞有關的差異表達mRNA共9個[15-23],并對這些差異表達基因進行實時熒光定量PCR驗證,在得出的結果中發現了一條表達顯著上調且與轉錄組測序結果一致的基因——Adam11。有研究表明,Adam11在疼痛傳遞和引起痛閾值變化的炎癥調節機制中發揮作用,由此推測Adam11這條差異表達mRNA可能參與穴位痛敏化發生的調控機制,可做進一步研究[15]。在RT-qPCR驗證結果中有的差異基因表達趨勢與有參轉錄組測序結果一致,但無統計學意義;有的差異基因表達趨勢與有參轉錄組測序結果不一致。這可能與檢測樣本量較小,基因多態性等有關,需增加樣本含量進一步驗證。

綜上所述,本研究從動物實驗角度驗證了疾病狀態下穴位敏化現象發生的客觀性,用機械痛閾值檢測方法證實了CHD心絞痛模型大鼠內關穴出現了痛敏化現象;從分子生物學水平探索了穴位敏化產生的機制,發現一條差異表達基因Adam11可能參與調控穴位痛敏化的發生,但其具體調控機制還有待進一步深入研究。