EGFR突變對肺腺癌預后及治療意義生物信息分析

朱明雪 閆清 王鵬 王曄 牟曉峰

[摘要] 目的 探討表皮生長因子受體（EGFR）突變對肺腺癌預后及治療的意義。方法 從癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫下載肺腺癌的RNA測序數據、基因表達矩陣及臨床信息，應用基因突變景觀分析了解EGFR在肺腺癌中的突變情況，分析與EGFR突變相關的臨床特征。利用差異分析得到差異表達基因（DEGs），基于DEGs的重疊基因構建LASSO-Cox風險預后模型，依據模型風險評分中位值將樣本分為高、低風險組進行Kaplan-Meier生存分析。應用單因素Cox風險比例回歸分析肺腺癌預后特征基因，并對其與EGFR突變相關性進行分析。分析EGFR突變與免疫細胞浸潤和鐵死亡基因的關系。結果 EGFR在肺腺癌中的突變率為11.64%，EGFR突變與性別（χ²=5.139，P<0.05）和吸煙（χ²=36.822，P<0.01）有關。生存分析顯示，高風險組生存率較低（HR=1.932，95%CI=1.433～2.606，P<0.05）。GLB1L3、TMEM63C、FAM83A基因與肺腺癌的預后相關，其中GLB1L3、TMEM63C與EGFR突變呈正相關（r=0.383 1、0.382 6，P<0.05）。肺腺癌組織中CD8⁺T細胞比例較高，且與EGFR突變狀態相關；在EGFR突變型和野生型肺腺癌中，有10個鐵死亡基因表達差異具有統計學意義（t=1.896～3.765，P<0.05）。結論 EGFR突變與肺腺癌的不良預后相關，且與腫瘤免疫細胞浸潤和鐵死亡存在緊密聯系，這為肺腺癌的治療提供了新思路。

[關鍵詞] 肺腺癌；ErbB受體；突變；預后；治療學；鐵死亡；計算生物學

[中圖分類號] R734.2

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2023）04-0522-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.121

[網絡出版] https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20230920.0931.004;2023-09-21 12：11：42

SIGNIFICANCE OF EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR MUTATION IN THE PROGNOSIS AND TREATMENT OF LUNG ADENOCARCINOMA： A BIOINFORMATICS ANALYSIS ZHU Mingxue， YAN Qing， WANG Peng， WANG Ye， MU Xiaofeng （Medical College of Qingdao University， Qingdao 266071， China）＼; [ABSTRACT] Objective To investigate the significance of epidermal growth factor receptor （EGFR） mutation in the prognosis and treatment of lung adenocarcinoma. Methods RNA sequencing data， gene expression matrix， and clinical information of lung adenocarcinoma were downloaded from the Cancer Genome Atlas database， a gene mutation landscape analysis was used to investigate EGFR mutation in lung adenocarcinoma， and the clinical features associated with EGFR mutation were analyzed. A differential analysis was performed to obtain differentially expressed genes （DEGs）， and a LASSO-Cox risk prognostic model was constructed based on the overlapping genes of DEGs. The samples were divided into high- and low-risk groups based on the median risk score of the model， and then the Kaplan-Meier method was used to perform the survival analysis. A univariate Cox proportio-nal-hazards regression model analysis was used to investigate the characteristic genes associated with the prognosis of lung adenocarcinoma， and their correlation with EGFR mutation was analyzed. The association of EGFR mutation with immune cell infiltration and ferroptosis genes was analyzed. Results The rate of EGFR mutation was 11.64% in lung adenocarcinoma， and EGFR mutation was associated with sex （χ²=5.139，P<0.05） and smoking （χ²=36.822，P<0.01）. The high-risk group had a relatively low survival rate （HR=1.932，95%CI=1.433-2.606，P<0.05）. The GLB1L3， TMEM63C， and FAM83A genes were associa-ted with the prognosis of lung adenocarcinoma， among which GLB1L3 and TMEM63C were positively correlated with EGFR mutation （r=0.383 1，0.382 6，P<0.05）. There was a relatively high proportion of CD8⁺T cells in lung adenocarcinoma tissue， which was correlated with the status of EGFR mutation， and there were significant differences in the expression of 10 ferroptosis genes between EGFR-mutant lung adenocarcinoma and wild-type lung adenocarcinoma （t=1.896-3.765，P<0.05）. ConclusionEGFR mutation is associated with the poor prognosis of lung adenocarcinoma and is closely associated with tumor immune cell infiltration and ferroptosis， which provides new ideas for the treatment of lung adenocarcinoma.

[KEY WORDS] adenocarcinoma of lung; ErbB receptors; mutation; prognosis; therapeutics; ferroptosis; computational bio-logy

肺癌是全球范圍內發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。由于缺乏有效的早期篩查和診斷方法，肺癌總體預后很差^[1-2]。吸煙、職業性接觸致癌物是肺癌發生的常見原因^[3]。遺傳易感性也是肺癌發生重要原因之一，其中主要的方式就是表皮生長因子受體（EGFR）的突變^[4-6]。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）的興起使EGFR突變陽性的肺腺癌病人的病情得到緩解，但仍有20%～30%的病人出現EGFR-TKI耐藥^[7]。研究發現，免疫細胞浸潤和鐵死亡在癌癥發生發展過程中起重要作用^[8-9]。但其與EGFR突變肺腺癌的關系仍未闡明。本研究旨在通過生物信息學分析探討EGFR突變與肺腺癌預后、免疫細胞浸潤和鐵死亡的關系，以期為EGFR突變型肺腺癌的治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 數據獲取

從癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫下載肺腺癌RNA測序數據、基因表達矩陣及臨床信息。共獲得肺腺癌樣本513例、癌旁正常組織樣本59例。將肺腺癌樣本分為EGFR突變組與野生組，比較兩組樣本的臨床特征差異。

1.2 基因突變景觀分析

基因突變景觀分析用于了解EGFR在肺腺癌基因組層面的突變情況。對肺腺癌EGFR突變數據、轉錄組數據和臨床數據進行分析，并利用R軟件包maftools可視化肺腺癌病人的體細胞突變，包括突變物理位置、突變類型的全景瀑布圖及突變亞組的進一步分析。

1.3 肺腺癌差異基因分析

使用R軟件包中的limma包分析肺腺癌RNA測序數據中基因的差異表達。以|log2FC|＞1、P<0.05為篩選條件，篩選EGFR突變型、野生型肺腺癌和癌旁正常組織樣本中兩兩比較的差異表達基因（DEGs）。然后利用Venn圖獲取3組DEGs的重疊基因。

1.4 預后模型構建及評價

基于DEGs的重疊基因構建LASSO-Cox風險預后模型，依據模型風險評分中位值將樣本分為高、低風險組進行Kaplan-Meier（KM）生存分析。R軟件包glmnet用于signature模型的分析，Log rank檢驗用于比較高、低風險組的生存差異，時間依賴的受試者工作特征（ROC）曲線用于分析特征基因和風險評分預測的準確性，單因素Cox風險比例回歸分析用于篩選對肺腺癌有預后意義的基因。采用Spearman相關性分析方法分析EGFR突變與關鍵基因之間的相關性，利用R軟件包pheatmap展示多基因相關性熱圖。

1.5 肺腺癌EGFR突變與免疫細胞關系分析

利用R軟件包immunedeconv對EGFR突變組和野生組肺腺癌樣本進行免疫評分評估，使用Wilcox檢驗比較兩組之間的差異。采用Spearman相關性分析方法分析肺腺癌中EGFR突變與免疫細胞之間的相關性。利用R軟件包pheatmap繪制熱圖。

1.6 肺腺癌EGFR突變與鐵死亡基因關系分析

分析肺腺癌中24個鐵死亡相關基因在EGFR突變型、野生型肺腺癌組織中的差異表達。

1.7 統計學方法

本研究中所有分析均應用R 軟件（3.6.2 版本）完成。正態分布計量數據以±s表示，組間比較采用t檢驗；計數數據組間比較采用卡方檢驗；兩組之間生存差異比較采用Log rank檢驗；相關性檢驗采用Spearman相關性分析。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 EGFR在肺腺癌中的突變率

EGFR在肺腺癌中存在突變，體細胞突變率為11.64%（圖1A）。瀑布圖顯示，81.48%的樣本出現突變（圖1B）。

2.2 EGFR突變與臨床特征的關系

EGFR突變與性別（χ²=5.139，P<0.05）和吸煙（χ²=36.822，P<0.01）有關，而與其他臨床特征無關。見表1。

2.3 肺腺癌差異基因分析

對EGFR突變型、野生型肺腺癌和癌旁正常組織樣本進行兩兩比較，得到3組DEGs。火山圖顯示，EGFR突變型與野生型肺腺癌組織DEGs中有42個上調基因，30個下調基因（圖2A）；EGFR突變型肺腺癌與癌旁正常組織DEGs中有1 809個上調基因，2 143個下調基因（圖2B）；EGFR野生型肺腺癌和癌旁正常組織DEGs中有1 517個上調基因，2 388個下調基因（圖2C）。對這3組DEGs取交集，得到31個重疊基因（圖2D）。

2.4 預后風險模型構建及評價

用LASSO回歸分析從31個重疊基因中篩選出4個（GLB1L3、TMEM63C、FAM83A、GPX2）建立預后模型，基因篩選過程見圖3A、B。模型風險評分的計算公式：風險評分=（-0.002 9）×GLB1L3表達量+（-0.035 2）×TMEM63C表達量+0.145 7×FAM83A表達量+0.004 6×GPX2表達量。計算出每個樣本的風險評分值，依據中位值將樣本分為高風險組和低風險組。KM曲線分析結果顯示，高風險組生存率較低（HR=1.932，95%CI=1.433～2.606，P<0.05）（圖3C）。ROC曲線分析顯示，風險評分預測病人1、3、5年生存率的曲線下面積（AUC）分別為0.700、0.658和0.622（圖3D）。單因素Cox風險比例回歸分析顯示，在31個重疊基因中，GLB1L3、TMEM63C、FAM83A是肺腺癌的預后特征基因（圖3E）。相關性分析結果顯示，EGFR突變與GLB1L3和TMEM63C呈正相關（r=0.383 1、0.382 6，P<0.05），而與FAM83A無顯著相關性（r=0.081 0，P＞0.05）（圖3F）。

2.5 肺腺癌EGFR突變與免疫細胞關系

免疫細胞評分熱圖顯示，有6種免疫細胞在EGFR突變型和野生型肺腺癌中的分布差異具有顯著性（P<0.05），其中CD8⁺T細胞分布差異最大（圖4A）。利用CIBERSORT算法估算22種免疫細胞在肺腺癌樣本中的浸潤豐度，其中CD8⁺T細胞的浸潤豐度最大（圖4B）。分析預后特征基因與免疫細胞的相關性，其中B細胞和CD4⁺T細胞均與GLB1L3、TMEM63C有顯著相關性（P<0.01）（圖4C）。

2.6 肺腺癌EGFR突變與鐵死亡基因關系

在EGFR突變型和野生型肺腺癌中，ATL1、SLC7A11、GLS2等10個鐵死亡基因表達差異具有顯著性（t=1.896～3.765，P<0.05）（圖5）。

3 討論

肺腺癌是肺癌最常見的類型。EGFR基因突變是導致肺腺癌發生的重要因素。EGFR突變型肺腺癌病人預后較差^[10-12]。即使臨床上廣泛應用EGFR-TKI治療EGFR突變型肺腺癌病人，最終也不可避免產生耐藥性，進而影響預后。本研究通過生物信息學分析探討EGFR突變與肺腺癌預后、免疫細胞浸潤和鐵死亡的關系，以期為EGFR突變型肺腺癌的治療提供思路。

本研究生物信息學分析顯示，EGFR在肺腺癌中的體細胞突變率為11.64%。一項口腔腫瘤研究結果表明，吸煙可以上調EGFR信號，并且能夠促進體外和體內口腔腫瘤的發生^[13]。本文研究結果顯示，EGFR突變與肺腺癌病人性別和吸煙有關，進一步印證了EGFR與吸煙的關系。本研究建立了預后風險模型，并且發現GLB1L3、TMEM63C、FAM83A是肺腺癌的預后特征基因，這3個基因或將成為未來預測肺腺癌預后的重要因子。進一步分析發現，EGFR突變與GLB1L3、TMEM63C呈正相關，這2個基因的表達或許促進了EGFR的突變，下一步可以通過細胞和動物實驗進行驗證。

免疫療法具有提高腫瘤緩解率、毒副作用小的特點。然而不同EGFR突變狀態的腫瘤對免疫治療的反應不同。T細胞在腫瘤細胞免疫中起到中心調控作用^[14]。CD8⁺T細胞作為效應細胞，其在免疫微環境中的比例升高通常與病人的良好預后相關^[15]。本研究結果顯示，肺腺癌組織中CD8⁺T細胞比例較高，且與EGFR突變狀態相關，預后特征基因與B細胞和CD4⁺T細胞具有顯著相關性，表明EGFR突變可能通過影響免疫細胞浸潤進而影響免疫治療。鐵死亡是一種鐵依賴性的細胞程序性死亡，它通過改變細胞代謝方式，使細胞大量積累脂質過氧化物和活性氧來誘導細胞程序性死亡^[16]。既往有研究表明，肺癌組織中血清鐵蛋白的表達普遍增高，血清鐵蛋白的高表達在肺癌的遠處轉移中起著重要作用，并導致較差的遠期預后^[17-18]。本研究結果顯示，鐵死亡相關基因CIDS1和ATP5MC3與EGFR突變具有顯著相關性，這或許提示鐵死亡對于肺腺癌的重要作用可細分至EGFR基因的突變狀態。

綜上所述，EGFR突變與肺腺癌的不良預后相關，且與腫瘤免疫細胞浸潤和鐵死亡存在緊密聯系，這為肺腺癌的進一步研究和治療提供了新思路。

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（本文編輯 馬偉平）