開放實(shí)驗(yàn)教學(xué)探索*
——以硫酸軟骨素的提取和分析鑒定為例

湯佳立 童玥

1 中國藥科大學(xué)生物制藥實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心 南京 211198 2 中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 南京 211198

0 引言

郭沫若說過：“教學(xué)的目的是培養(yǎng)學(xué)生自己學(xué)習(xí)，自己研究，用自己的頭腦來想，用自己的眼睛去看，用自己的手來做這種精神。”培養(yǎng)具有獨(dú)立實(shí)踐能力、學(xué)習(xí)主動性和創(chuàng)新能力的技術(shù)型人才是黨和人民賦予高校的歷史使命，具有創(chuàng)新意識的實(shí)驗(yàn)室是培養(yǎng)大學(xué)生創(chuàng)新意識和創(chuàng)新能力的重要平臺。只有努力創(chuàng)造條件，給學(xué)生更多進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的機(jī)會，才能激發(fā)學(xué)生在實(shí)踐中參與創(chuàng)新的積極性，從而充分發(fā)揮實(shí)驗(yàn)教學(xué)在本科生素質(zhì)教育和創(chuàng)新能力培養(yǎng)中的作用。為此，圍繞培養(yǎng)和提高大學(xué)生創(chuàng)新意識和能力，各地高校從實(shí)驗(yàn)室資源建設(shè)和運(yùn)行機(jī)制等方面進(jìn)行了大量有益的探索和實(shí)踐，并取得了一些經(jīng)驗(yàn)[1-2]。

從2006 年開始，筆者所在高校嘗試建立符合本校實(shí)際情況的開放式實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式，采取實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目開放、實(shí)驗(yàn)室開放等多種形式[3]。開放實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目一般是在每個學(xué)期初由教師申報(bào)課題，學(xué)生和教師雙向選擇，學(xué)生主要利用課余時間完成指定的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，實(shí)驗(yàn)開展期間指導(dǎo)教師需在實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備和維護(hù)實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備，進(jìn)行現(xiàn)場管理指導(dǎo)，項(xiàng)目持續(xù)至該學(xué)期結(jié)束，最后由指導(dǎo)教師對學(xué)生實(shí)驗(yàn)完成情況作出評價。經(jīng)過十多年的實(shí)踐，整體效果較好，不僅調(diào)動了廣大學(xué)生參與實(shí)驗(yàn)的積極性和主動性，而且還激發(fā)了學(xué)生敢于探索、勇于創(chuàng)新的想象力和創(chuàng)造力。但從學(xué)生和教師的反饋來看在實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和開放方式等方面還可以進(jìn)一步完善。

近20 多年來，現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展迅速。60%以上的生物技術(shù)成果應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，生物制藥產(chǎn)業(yè)也在崛起。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)得到了改進(jìn)，特色新藥得到了開發(fā)[4]。與此同時，對生物制藥專業(yè)人才的需求也在逐年增加。這就對高校培養(yǎng)具有獨(dú)立思考和解決問題能力、實(shí)踐和創(chuàng)新能力的生物制藥人才提出了更高的要求。

筆者負(fù)責(zé)生物制藥實(shí)驗(yàn)中心的實(shí)驗(yàn)教學(xué)輔助工作。實(shí)驗(yàn)室面向生物制藥專業(yè)、生物技術(shù)專業(yè)等開設(shè)生物制藥綜合、生物制藥工藝學(xué)、生物技術(shù)等實(shí)驗(yàn)課程。在平時與學(xué)生的交流過程中發(fā)現(xiàn)，學(xué)生對于開放實(shí)驗(yàn)有較高的熱情，希望在選題方面有更多的選擇、有更多的參與自主設(shè)計(jì)的機(jī)會。為此筆者和教研室教師一起設(shè)計(jì)了“硫酸軟骨素的提取和分析鑒定”的綜合性實(shí)驗(yàn)作為開放實(shí)驗(yàn)，并添加了翻轉(zhuǎn)課堂的理念。該實(shí)驗(yàn)綜合了多糖的制備、含量測定、瓊脂糖電泳鑒定等生物制藥行業(yè)的基礎(chǔ)操作技能，適合本科生完成，融入翻轉(zhuǎn)課堂的形式后學(xué)生自主參與度更高，有利于培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新思維，提高學(xué)生自主學(xué)習(xí)和科研創(chuàng)新能力[5]。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)背景及意義

硫酸軟骨素（Chondroitin Sulfate，CS）是以蛋白聚糖的形式廣泛分布于動物的軟骨、肌腱、韌帶和血管壁等組織中的一種酸性粘多糖[6-7]。硫酸軟骨素作為一種天然產(chǎn)物，具有增強(qiáng)免疫力、抗關(guān)節(jié)炎、調(diào)節(jié)血管生成、降血脂、抗病毒、抗凝、抗腫瘤等多種生物活性[8-10]，還具有保水性、保膠性和高黏性[11]，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、功能性食品、化妝品添加劑等領(lǐng)域，具有良好的市場前景。硫酸軟骨素的提取方法主要有：濃堿提取、稀堿濃鹽提取、酶提取法及超聲波法等。不同的原料，適用的提取方法也會有所差異。

2 將翻轉(zhuǎn)課堂融入開放實(shí)驗(yàn)教學(xué)

近年來，翻轉(zhuǎn)課堂在理論課教學(xué)中逐漸成為一種熱門的教學(xué)方式，很好地突出了以學(xué)生為中心的理念。傳統(tǒng)的教學(xué)模式是由教師的課堂講解為主，學(xué)生被動接受，而翻轉(zhuǎn)課堂則是學(xué)生課前自主學(xué)習(xí)，課堂上師生深度互動，從而提高學(xué)生的學(xué)習(xí)效率[12]。

將翻轉(zhuǎn)課堂的形式融入開放實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，可以更好地發(fā)揮學(xué)生的主觀能動性。具體實(shí)施方案是：教師先擬定課題，課題不宜太復(fù)雜，選擇兩位以上不同專業(yè)或不同年級的學(xué)生，以便學(xué)生之間協(xié)調(diào)時間，保證實(shí)驗(yàn)持續(xù)進(jìn)行。建立開放實(shí)驗(yàn)的QQ 討論群或者微信群，讓學(xué)生查找實(shí)驗(yàn)相關(guān)文獻(xiàn)資料、視頻或者多媒體資源等共享在群內(nèi)，學(xué)生通過該預(yù)習(xí)過程可以對將要開展的實(shí)驗(yàn)有所了解。然后由學(xué)生根據(jù)實(shí)際的實(shí)驗(yàn)材料和本實(shí)驗(yàn)室情況擬定實(shí)驗(yàn)方案。隨后組織學(xué)生現(xiàn)場討論，教師進(jìn)行必要的講解和答疑，最終形成較為完善的實(shí)驗(yàn)方案，并安排實(shí)驗(yàn)日程，對于某些不清楚的操作細(xì)節(jié)可以由教師針對性地回答與補(bǔ)充，不會操作的儀器設(shè)備由教師現(xiàn)場指導(dǎo)。

3 開放實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)

3.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

實(shí)驗(yàn)材料：新鮮牛軟骨，胰蛋白酶，D-葡萄糖醛酸，四硼酸鈉，咔唑，巴比妥鈉，甲苯胺藍(lán)，瓊脂糖，NaOH，鹽酸，濃硫酸，無水乙醇，溴酚藍(lán)。

儀器：電子天平，離心機(jī)，組織搗碎機(jī)，紫外分光光度計(jì)，水浴鍋，電熱鼓風(fēng)干燥箱，電泳儀，電泳槽。

3.2 實(shí)驗(yàn)實(shí)施過程

3.2.1 硫酸軟骨素的提取

取新鮮牛軟骨，在80 ℃熱水中洗滌，用刀刮除骨表面的結(jié)締組織等雜質(zhì)，清洗干凈，用組織搗碎機(jī)打碎，稱取10 g，加入30 mL（三倍骨重量）的1 mol/L NaOH，40 ℃堿提2 小時，隨后用4 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH 至7.0，雙層濾布過濾，收集濾液，用4 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 至8.5 ～9.0，加入1‰濾液量的胰蛋白酶，40 ℃水解2 h（水解過程中應(yīng)不斷調(diào)節(jié)溶液pH 至8.5 ～9.0），水解液80 ℃加熱30 min，4 mol/L 鹽酸調(diào)pH 至3.0，靜置2 h，4 000 rpm，5 min 離心收集上清，用4 mol/L NaOH調(diào)pH 至6.5，緩慢攪拌加入兩倍體積無水乙醇，靜置2 h，4 000 rpm，5 min 離心收集沉淀，無水乙醇脫水，再次4 000 rpm，5 min 離心，去除上清，刮取沉淀于干燥器中常溫干燥，得到硫酸軟骨素粗品0.13 g。

3.2.2 含量測定及得率計(jì)算

1）試劑配制。

D-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.0200 g D-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品用去離子水定容至100 mL。

硼砂—硫酸試劑：四硼酸鈉4.7671 g 用濃硫酸定容至500 mL。

咔唑試劑：0.125 g 咔唑用無水乙醇定容至100 mL，低溫保存。

2）實(shí)驗(yàn)步驟。

稱取硫酸軟骨素粗品0.1 g，用1.0 mL 去離子水溶解，再分別稀釋200 倍和300 倍后，采用硫酸咔唑法，于530 nm 波長處測其吸光值。

分別取D-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL 用去離子水定容至10 mL，得到濃度分別為20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、120 μg/mL 的 D-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。將各裝有5 mL 硼砂—硫酸試劑的7 支試管，在冰浴條件下分別加入1.0 mL不同濃度的D-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用去離子水做空白對照，注意避免出現(xiàn)沸騰。沸水浴10 min 后迅速冷卻至室溫，分別加入咔唑試劑0.2 mL，沸水浴15 min 后冷卻至室溫。530 nm 測定吸收值。根據(jù)吸光值（A）和 D-葡萄糖醛酸濃度（C）繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（A 為吸光值，C 為葡萄糖醛酸含量，檢測范圍為0 ～120 μg/mL），計(jì)算提取物中葡萄糖醛酸含量:

葡萄糖醛酸含量（%）=（m1/0.1）×100

式中，m1為0.10 g提取物中葡萄糖醛酸含量（g）。已知硫酸軟骨素中氨基己糖的含量為37.00%（w/w），而氨基己糖與葡萄糖醛酸的質(zhì)量比為0.82 ∶1（w/w），因此硫酸軟骨素中葡萄糖醛酸含量為45.12%（w/w），據(jù)此可以計(jì)算出提取物中硫酸軟骨素的得率：

硫酸軟骨素得率（%）=（m1/45.12%/m2）×100

式中m1為提取物中葡萄糖醛酸含量（g），m2為牛軟骨質(zhì)量（g）。

3.2.3 瓊脂糖電泳鑒定

1）試劑配制。

電極緩沖液（0.06 mol/L 巴比妥鈉溶液）：取巴比妥鈉12.4 g 溶于800 ml 水中，用2 mol/L HCl調(diào)pH 值至8.2，加水定容至1 000 ml。

甲苯胺藍(lán)染色液：取甲苯胺藍(lán)0.2 g，加入少量乙醇，于60 ℃水浴加熱，待顆粒全部溶解后加水定容至200 ml，濾紙過濾備用。

2）瓊脂糖電泳。精確稱取8.0 mg 標(biāo)準(zhǔn)品，用1 ml 雙蒸水溶解，配制成8 mg/ml 的溶液。各吸取50 μl 分別與溴酚藍(lán)溶液1 ∶1 混合均勻，放入4 ℃的冰箱待用。

將測定含量用0.1 g/mL 的樣品溶液用雙蒸水稀釋1 倍，配成0.05 g/mL 的溶液。各吸取50 μl分別與溴酚藍(lán)溶液1 ∶1 混合均勻，放入4 ℃的冰箱待用。

稱取瓊脂糖0.5 g，加熱溶于50 ml 電極緩沖液中，冷卻至60 ℃左右。制成厚度約為3 mm 的膠板（7 cm×9 cm）。設(shè)0.05 g/mL、0.1 g/mL 兩個樣品濃度，5 μl、10 μl 兩種上樣量進(jìn)行比較，于負(fù)極端點(diǎn)樣后置電泳槽中；加入電極緩沖液，在100 V電壓下進(jìn)行電泳。觀察指示劑的移動情況，待指示劑行至距凝膠前沿約2 cm 處，停止電泳。剝?nèi)∧z，用甲苯銨藍(lán)染色液染色10 min，用水脫色過夜，觀察結(jié)果。

4 結(jié)果與討論

4.1 含量測定及得率計(jì)算結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示。

圖1 葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

樣品測定結(jié)果如表1 所示。

表1 葡萄糖醛酸含量

選取樣品稀釋300 倍后的測定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算：

葡萄糖醛酸含量（%）=（m1/0.1）×100

式中m1為0.10 g提取物中葡萄糖醛酸含量（g）。

葡萄糖醛=84.33×300/106/0.1×100=25.30%

硫酸軟骨素得率（%）=（m1/45.12%/m2）×100

式中m1為提取物中葡萄糖醛酸含量（g），m2為牛鼻軟骨質(zhì)量（g）。

得率（%）=（0.13g×25.30%/45.12%/10）×100=0.73%

4.2 瓊脂糖電泳結(jié)果

設(shè)置0.05 g/mL、0.1 g/mL 兩個樣品濃度5 μl、10 μl兩種上樣量進(jìn)行瓊脂糖電泳結(jié)果如圖2所示。

圖2 瓊脂糖電泳結(jié)果

1）0.05 g/mL 上樣10 μl；2）0.05 g/mL 上樣5 μl；3）0.1 g/mL 上樣10 μl；4）0.1 g/mL 上樣5 μl；5）標(biāo)準(zhǔn)品上樣5 μl 與標(biāo)準(zhǔn)品比對，電泳條帶位置完全一致，且濃度較高，在以后的實(shí)驗(yàn)中樣品可以選用0.05 g/mL 的濃度，5 μl 上樣量進(jìn)行電泳。

5 結(jié)束語

本次開放實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，引入了翻轉(zhuǎn)課堂的形式，充分體現(xiàn)了以學(xué)生為主體的教學(xué)理念，增強(qiáng)了學(xué)生參與實(shí)驗(yàn)的主動性和積極性，通過實(shí)驗(yàn)學(xué)生很好地掌握了硫酸軟骨素的提取、含量測定、得率計(jì)算、瓊脂糖電泳鑒定等實(shí)驗(yàn)及分析方法。在實(shí)驗(yàn)開展前，學(xué)生通過獨(dú)立查閱大量的文獻(xiàn)，學(xué)習(xí)視頻資料、多媒體材料，對硫酸軟骨素研究背景和目前的研究進(jìn)展有了初步的了解，初步制定了實(shí)驗(yàn)流程，經(jīng)過師生的討論，最終形成完善的方案，該過程能夠讓學(xué)生體會到實(shí)驗(yàn)的完整性和嚴(yán)肅性；在整個實(shí)驗(yàn)過程中，學(xué)生之間、師生之間在遇到問題時能通過多種途徑進(jìn)行積極的討論，活躍了學(xué)生的思維，訓(xùn)練了他們獨(dú)立分析問題和解決問題的能力；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每位學(xué)生都要撰寫實(shí)驗(yàn)論文，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。整個流程下來，培養(yǎng)了學(xué)生查閱資料、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、團(tuán)隊(duì)合作、論文寫作等多方面的能力，訓(xùn)練了學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)思維，激發(fā)了學(xué)生參與創(chuàng)新的熱情，也為學(xué)生后期的就業(yè)、深造奠定了基礎(chǔ)。