轉化生長因子β活化激酶1在骨性關節炎中的表達及作用

崔道然 金胡日查 楊健 崔志明

[摘? ?要]? ?目的：研究轉化生長因子β活化激酶1（transforming growth factor-β activated kinase 1，TAK1）在骨性關節炎中的表達及其作用。方法：收集20例全膝關節置換或截肢術患者手術標本，分為正常組8例和退變組12例。對標本切片進行病理觀察和OARSI關節軟骨退變評分，免疫組化法檢測軟骨細胞中TAK1的表達。建立TNF-α（20 ng/mL）誘導的軟骨細胞凋亡模型，采用TUNEL檢測軟骨細胞凋亡，Western Blot檢測TNF-α誘導不同時間TAK1和活化Caspase-3的表達水平，免疫熒光染色顯示TAK1和活化Caspase-3在軟骨細胞中的定位，觀察轉染siRNA抑制TAK1表達對活化Caspase-3表達的影響。結果：手術標本切片顯示，退變組軟骨表面出現較深裂隙，細胞體積縮小，大量軟骨細胞壞死。退變組OARSI評分3.50±1.00分，明顯高于正常組的0.50±0.54分，差異有統計學意義（P<0.05）。免疫組化顯示，退變組TAK1陽性細胞77.28%，高于正常組的15.35%，差異有統計學意義（P<0.05）。Western Blot檢測顯示，軟骨細胞在TNF-α誘導0 h TAK1低表達，誘導后12 h TAK1表達開始上調，36 h達到峰值，誘導后12 h、24 h、36 h、48 h TAK1表達水平高于0 h，差異均有統計學意義（P<0.05）。活化Caspase-3表達在誘導12 h開始上調，24 h達到峰值，差異均有統計學意義（P<0.05）。TNF-α誘導后TUNEL陽性細胞數明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05）。免疫熒光染色顯示，TAK1和活化Caspase-3在TNF-α誘導的軟骨細胞中共定位。siRNA轉染沉默TAK1后活化Caspase-3表達增加，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：TAK1在骨性關節炎中表達上調，可能通過抑制Caspase-3的表達而發揮抑制軟骨細胞凋亡的作用，在骨性關節炎進展過程中具有重要意義。

[關鍵詞]? ?轉化生長因子β活化激酶1；Caspase-3；骨性關節炎；軟骨細胞；凋亡

[中圖分類號]? ?R684.3 [文獻標志碼]? ?A [DOI]? ?10.19767/j.cnki.32-1412.2023.04.001

Expression and function of transforming growth

factor-β activated kinase 1 in osteoarthritis

CUI Daoran， JIN HU Richa， YANG Jian， CUI Zhiming

（Department of Orthopedics， Second Affiliated Hospital of Nantong University/the First Hospital of Nantong， Jiangsu 226001）

[Abstract]? ?Objective：To investigate the expression and role of transforming growth factor-β activated kinase 1 （TAK1） in osteoarthritis. Methods：Twenty knee joint samples from patients undergoing total knee arthroplasty or amputation were collected and divided into the normal group （8 cases） and the degenerative group （12 cases）. Pathological examination and OARSI score were performed under microscope. The expression of TAK1 in chondrocytes was detected by immunohistochemistry. A TNF-α （20 ng/mL） -induced chondrocyte apoptosis model was established， and the apoptosis of chondrocytes was detected by TUNEL. The expression levels of TAK1 and activated Caspase-3 at different time points after TNF-α treatment were detected by Western Blot. Immunofluorescence staining was used to detect the localization of TAK1 and activated Caspase-3 in chondrocytes. The effect of inhibiting the expression of TAK1 by siRNA on the expression of activated Caspase-3 was observed. Results： The sections of surgical specimens showed that there were deep cracks on the cartilage surface in the degenerative group， the cell volume was reduced， and a large number of chondrocytes were necrotic. The OARSI score of the degenerative group （3.50±1.00） was significantly higher than that of the normal group （0.50±0.54）， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Immunohistochemistry showed that the percentage of TAK1 positive cells in the degenerative group （77.28%） was significantly higher than that in the normal group（15.35%）， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Western Blot showed that TAK1 expression was low at 0 hour after TNF-α induction， increased at 12 hours after induction， and reached the peak at 36 hours （P<0.05）. The expression of activated Caspase-3 was upregulated at 12 h and peaked at 24 h. The number of TUNEL positive cells increased significantly after TNF-α induction （P<0.05）. Immunofluorescence staining showed that TAK1 and activated Caspase-3 were co-localized in chondrocytes induced by TNF-α. The expression of activated Caspase-3 increased after silencing TAK1 by siRNA transfection （P<0.05）. Conclusion：The expression of TAK1 is up-regulated in osteoarthritis， which may play a role in inhibiting chondrocyte apoptosis by inhibiting the expression of Caspase-3. TAK1 plays an important role in the progression of osteoarthritis.

[Key words]? ?transforming growth factor-beta activated kinase 1 （TAK1）; Caspase-3; osteoarthritis; chondrocyte; apoptosis

骨性關節炎（osteoarthritis，OA）是人類關節最常見的退行性疾病，表現為骨贅形成、軟骨下骨增厚、軟骨侵蝕和關節間隙狹窄[1]。有研究認為，OA為特異性免疫反應[2]，病理上具有細胞基質損傷和組織細胞丟失特點。在OA病理進展過程中，軟骨細胞凋亡增多，促炎細胞因子產生增加以及基質退化[3-4]。促炎細胞因子的產生主要由異常激活的核因子-κB（NF-κB）途徑和有絲分裂原活化的蛋白激酶（MAPKs）途徑介導[5]。轉化生長因子β激活激酶1（transforming growth factor-beta activated kinase 1，TAK1）是MAPK激酶（MAP3K）家族成員，通過激活下游效應物（包括MAPKs和NF-κB）調節血管發育和激活細胞凋亡[6]。對基因工程小鼠的研究發現，TAK1在維持器官組織穩態方面起著不可或缺的作用[7]。另有研究發現，在一定條件下軟骨中缺失TAK1小鼠表現出嚴重的軟骨不典型增生和關節異常，表明TAK1在軟骨形態的發生和維護中具有重要作用[8]。本研究收集我院2021年1月—7月行全膝關節置換或截肢術20例患者的膝關節手術標本，建立TNF-α誘導的軟骨細胞凋亡模型，研究TAK1對凋亡相關蛋白Caspase-3的影響，探討TAK1在OA進展中的作用。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料和試劑? ?抗TAK1抗體（Abcam公司），抗cleaved-caspase-3抗體（Cell Signaling公司），抗GAPDH抗體（Sigma-Aldrich公司），Cy3-Goat anti-Mouse IgG、Alexa Fluor 488-conjugated Donkey anti-Rabbit IgG（Proper Tech公司），免疫組化工作液試劑盒（中杉金橋公司），TNF-α（Pepro Tech公司）。

1.2? ?關節軟骨組織切片H-E染色及OARSI關節軟骨退變評分? ?全膝關節置換術及截肢患者20例，根據影像學評估膝關節標本退變程度，分為正常組8例和退變組12例。取膝關節手術組織標本切片，置于60 ℃恒溫箱烘烤1 h，在二甲苯中浸泡15 min，更換二甲苯后再浸泡15 min，隨后分別在無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中浸泡。蘇木精染色，1%鹽酸酒精分色，1%氨水返藍，酒精伊紅染色。于不同梯度乙醇中脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。由3位病理醫生分別在光學顯微鏡下觀察關節軟骨組織結構和細胞形態，進行OARSI關節軟骨退變評分[9]，取平均值。OARSI關節軟骨退變評分標準見表1。

1.3? ?免疫組織化學染色? ?組織切片經烘烤、二甲苯及不同濃度乙醇中浸泡后，置于枸櫞酸鈉緩沖液中浸泡，然后沸水煮10 min。切片上滴加3%過氧化氫（試劑A）去除內源性過氧化物酶，37 ℃孵育10 min，PBS洗3次。滴加封閉液，室溫孵育15 min；滴加一抗，室溫下孵育1 h，PBS洗3次。滴加適量反應增強液（試劑B），室溫孵育20 min，PBS洗3次；滴加增強酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物（試劑C），室溫孵育20 min，PBS洗3次。然后顯色、脫水透明、封片，顯微鏡下攝片。

1.4? ?軟骨細胞培養? ?永生化人軟骨細胞SV40（上海生物化學與細胞生物學研究所）加入含10%胎牛血清的Leibovitzs L-15培養液中，于37 ℃、5%CO2飽和濕度下培養，每隔3～4天傳代1次。取SV40細胞加以TNF-α誘導，建立軟骨細胞凋亡模型，進行相關實驗。

1.5? ?TUNEL染色檢測細胞凋亡? ?在24孔板各孔內放置1片小圓玻片，按5×103個/mL密度將SV40細胞接種至板中，每孔100 μL。加入20 ng/mL TNF-α誘導36 h，另設對照組不予TNF-α處理。采用TUNEL染色檢測細胞凋亡，固定：使用預冷PBS清洗各孔，加入現配制的4%甲醛500 μL，室溫固定15 min。棄去甲醛，PBS清洗2次。破膜：各孔加入含0.3%TritonX-100的PBST 500 μL，室溫靜置5 min。棄去PBST，PBS清洗。平衡：各孔再次加入200 μL平衡緩沖液，室溫平衡處理8 min。配制反應體系：在平衡處理細胞同時，冰上將核苷混合物和rTdT酶解凍，按照配比配制反應體系。染液配制及之后實驗均需避光進行。反應：平衡結束棄平衡液，取出玻片，小心滴加所配反應體系51 μL，置于避光濕盒，37 ℃孵育1 h，使之發生加尾反應。封片：棄去反應體系，PBS清洗2遍，取潔凈載玻片，滴加熒光染料4′，6-二脒基-2苯基吲哚（DAPI）封片。顯色：熒光顯微鏡拍攝，或將玻片避光保存于4 ℃待檢，可放置1周左右，避免熒光淬滅。

1.6? ?Western Blot? ?TNF-α（20 ng/mL）誘導軟骨細胞0、12、24、36和48 h，分別提取各組細胞蛋白樣品50 μg，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF膜（Millipore公司）轉膜，250 mA，120 min，然后放入5%封閉緩沖液中，室溫搖床封閉2 h。加入一抗，孵育過夜，再用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育，電化學發光試劑發光、顯影、定影，進行圖像分析。

1.7? ?軟骨細胞siRNA轉染? ?按siRNA說明書配制轉染混合試劑，依次向RNase-free管內加入Opti-MEM、siRNA以及siRNA轉染用RNAiMAX，輕輕混勻后于室溫靜置15 min。使用預溫的PBS清洗軟骨細胞后消化，稀釋細胞濃度為25～30萬個/mL。轉染混合試劑按說明書比例加入孔板中，每孔加入1 mL細胞懸液，混勻，置于細胞培養箱培養。為規避轉染試劑毒性，16 h后將培養基換成含雙抗的完全培養基。

1.8? ?統計學處理? ?應用GraphPad Prism 6、ImageJ和SPSS 17.0統計學軟件分析數據。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析及t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2? ?結? ? ? 果

2.1? ?關節軟骨病理改變及OARSI評分? ?H-E染色切片顯示，正常組關節軟骨表面完整，軟骨細胞排列有序，而退變組軟骨表面出現較深裂隙，細胞體積縮小，大量軟骨細胞壞死。退變組OARSI評分3.50±1.00分，高于正常組的0.50±0.54分，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1。

2.2? ?退變關節軟骨中TAK1表達? ?免疫組化結果顯示，退變組軟骨細胞TAK1陽性細胞百分率77.28%，高于正常組的15.35%，差異有統計學意義（P<0.05），提示TAK1表達可能影響軟骨細胞生長發育，進而影響OA的發病。見圖2。

2.3? ?TAK1與Caspase-3在軟骨細胞凋亡模型中的表達及共定位? ?Western Blot檢測顯示，在TNF-α（20 ng/mL）誘導0 h TAK1表達低水平，誘導后12 h TAK1表達開始上調，36 h達到峰值，誘導后12 h、24 h、36 h、48 h TAK1表達水平高于0 h，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）（圖3A、B）。活化Caspase-3表達在誘導12 h開始上調，24 h達到峰值，差異均有統計學意義（P<0.001）（圖3C）。TUNEL檢測發現，TNF-α誘導36 h后TUNEL陽性細胞數明顯增加［0 h陽性細胞率（21.2±1.8）%、36 h的陽性細胞率（42±5.3）%］，差異有統計學意義（P<0.05）（圖3D）。免疫熒光染色顯示，TAK1和活化Caspase-3在TNF-α誘導的軟骨細胞中共定位（圖3E）。表明Caspase凋亡途徑可能在OA進展中起重要作用，TAK1可能在調控軟骨細胞凋亡過程中發揮影響。

2.4? ?siRNA轉染抑制TAK1表達對Caspase-3表達的影響? ?為了進一步確定TAK1與軟骨細胞凋亡的相關性，采用siRNA轉染方法抑制TAK1表達。我們設計3種siRNA片段，并通過Western Blot確定siRNA片段3具有最佳敲除效率（圖4A、B）。TAK1沉默后人軟骨細胞凋亡模型中活化Caspase-3蛋白表達增加（圖4C、D），差異有統計學意義（P<0.05），表明TAK1可能通過抑制Caspase-3的表達而發揮抑制軟骨細胞凋亡的作用。

3? ?討? ? ? 論

骨關節炎為慢性關節退行性疾病[2]，目前尚無有效的保守治療方法，進一步了解OA發病機理，發現潛在的治療靶點十分必要。本研究免疫組織化學顯示，退變組關節軟骨細胞中TAK1表達明顯增強。Western Blot檢測結果顯示，人軟骨細胞經TNF-α處理后TAK1表達明顯增加，凋亡蛋白Caspase-3表達也上調。免疫熒光顯示，TAK1與活化Caspase-3共定位表達。siRNA沉默TAK1后，活化Caspase-3表達明顯上調。上述結果說明TAK1可能在抑制OA軟骨細胞凋亡過程中起著重要作用。

有證據表明，細胞因子、趨化因子、粘附分子和基質降解酶等炎癥因子在OA發病中具有重要作用[10]。炎癥因子表達主要受NF-κB和MAPK途徑控制，過度機械壓力刺激、細胞外基質降解產物和促炎性細胞因子的釋放均會導致炎癥因子表達增高[11]。TAK1可被多種信號分子激活，其中包括TNF-α和IL-1等細胞因子[12]。活化的TAK1激活MAPK，同時NF-kB和MAPK誘導炎性細胞因子和下游抗凋亡蛋白的表達，從而導致凋亡蛋白Caspase-3活化。

在無TAK1情況下，細胞對凋亡十分敏感。TAK1調節TNF-α誘導的細胞死亡，形成誘導死亡的信號復合物，包括TRADD、FAS相關蛋白和死亡結構域FADD，RIPK1和Caspase-8[13]。在這些復合物中，Caspase-8被二聚化，進行自我切割并被激活，可進一步激活下游執行者Caspase-3，從而導致細胞凋亡[14]。TAK1通常對TNF-α激活的Caspase-8/-3產生影響，抑制Caspase激活級聯反應，以阻止細胞凋亡性死亡[15]。TAK1抑制Caspase激活有兩條主要途徑，其一是TAK1-NF-kB途徑：TAK1是NF-kB通路上游的激酶[16]，NF-kB轉錄過程中會產生相應的細胞因子激活抗凋亡蛋白，如c-FLIP和IAP家族蛋白。IAP家族包括cIAP1、cIAP2和XIAP，它們抑制Caspase激活。c-FLIP結構與Caspases-8類似，但不具有蛋白酶活性，能與Caspase-8形成異二聚體，從而抑制高活性Caspase形成。TAK1通過激活NF-kB從而抑制Caspase激活。TAK1抑制Caspase激活的另一個途徑是TAK1-ROS-cIAP途徑：先前有研究表明，TNF家族配體誘導的外源性激活途徑通常不依賴RIPK1，并且RIPK1激酶活性不是激活Caspase所必需的。只有當cIAP被合成的IAP拮抗劑發揮拮抗作用，開始代謝或具有遺傳毒性時，TNF-α才可以誘導有代謝活性的RIPK1，促進Caspase-8激活。另外，有研究發現，抑制TAK1會降低TNF-α刺激后cIAP蛋白含量。TAK1缺乏會影響TNF-α刺激、積聚活性氧（ROS）及ROS清除劑，從而誘導ROS降解cIAP[17]。實際上，ROS清除劑可以修復TAK1缺陷細胞，因為在與去除TAK1相同的實驗條件下，NF-kB的消耗僅會稍微增加ROS，所以TAK1-ROS-cIAP途徑可能獨立于TAK1-NF-kB途徑。這些途徑的激活以及細胞氧化還原系統的調節都是抑制細胞凋亡的關鍵。未來研究需要確定TAK1調節細胞氧化還原狀態的分子途徑。

綜上所述，TAK1在骨性關節炎中表達上調，可能通過抑制Caspase-3的表達而發揮抑制軟骨細胞凋亡的作用，在骨性關節炎進展過程中具有重要意義。

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[收稿日期] 2022-09-20

（本文編輯? ?繆宏建）