DACT3在卵巢癌中的表達(dá)及其意義

徐慧　王璇　韓勇　石宇

[摘? ?要]? ?目的：探究β-環(huán)連蛋白抑制基因3（dishevelled-binding antagonist of beta-catenin 3，DACT3）在卵巢癌中的表達(dá)及其預(yù)后意義。方法：從TCGA及GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中收集卵巢癌組織基因測(cè)序數(shù)據(jù)，分析DACT3表達(dá)與卵巢癌患者總生存期（overall survival，OS）及無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）的相關(guān)性。選擇60例手術(shù)切除的漿液性卵巢癌及正常卵巢組織標(biāo)本，采用免疫組化檢測(cè)組織中DACT3表達(dá)，分析DACT3表達(dá)與患者臨床病理特征及OS的相關(guān)性，采用單因素和多因素COX回歸分析影響卵巢癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素。采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)人卵巢癌腺癌細(xì)胞株SKOV3遷移能力的影響。結(jié)果：TCGA及GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)顯示，DACT3高表達(dá)患者的OS和PFS較短（P<0.05），COX回歸分析顯示，DACT3表達(dá)是影響卵巢癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P=0.00051）。對(duì)60例臨床卵巢癌患者分析顯示，DACT3表達(dá)與腫瘤分化程度及FIGO分期相關(guān)（P<0.05），DACT3高表達(dá)患者OS較短。免疫組化顯示，卵巢癌組織中DACT3高表達(dá)，高級(jí)別卵巢癌組織中DACT3表達(dá)較低級(jí)別更強(qiáng)。干擾DACT3表達(dá)后SKOV3細(xì)胞遷移能力顯著減弱。結(jié)論：DACT3在卵巢癌中高表達(dá)，是影響卵巢癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，有可能作為卵巢癌患者的預(yù)后指標(biāo)和分子治療的靶標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]? ?β-環(huán)連蛋白抑制基因3；卵巢癌；預(yù)后

[中圖分類號(hào)]? ?R737.31 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]? ?A [DOI]? ?10.19767/j.cnki.32-1412.2023.04.003

Expression and significance of DACT3 in ovarian cancer

XU Hui1，2， WANG Xuan2， HAN Yong3，4， SHI Yu3

（1Department of Obsetetrics and Gynecology， Huaian Second Peoples Hospital， Jiangsu 223002; 2Medical College of Nantong University; 3Department of Radiation Oncology， Affiliated Hospital of Nantong University;

4Cancer Center of the First Peoples Hospital affiliated to the Shanghai Jiao Tong University）

[Abstract]? ?Objective： To investigate the expression and prognostic significance of dishevelled-binding antagonist of beta-catenin 3（DACT3） in ovarian cancer. Methods： Ovarian cancer tissue and normal tissue sequencing data were downloaded from the Cancer Genome Atlas （TCGA） and GTEx databases to analyze the correlation of DACT3 with overall survival （OS） and progression-free survival （PFS） in patients with ovarian cancer. Sixty cases of serous ovarian cancer and normal ovarian tissue were selected. Immunohistochemistry was performed to detect DACT3 expression in ovarian cancer tissues. Univariate and multifactorial COX analyses were performed to test the risk factor affecting the prognosis of ovarian cancer. Cell migration ability of SKOV3 was detected by cell scratch assay. Results： TCGA and GTEx database data displayed that OS and PFS were shorter in patients with high DACT3 expression （P<0.05）; COX analyses suggested that DACT3 could be an independent prognostic predictor in ovarian cancer （P=0.00051）. Analysis of 60 ovarian cancer patients showed that DACT3 expression was correlated with tumor differentiation and FIGO stage （P<0.05）， and patients with high DACT3 expression had shorter OS. DACT3 was highly expressed in ovarian plasmacytoma， especially in high-grade types. Inhibition of DACT3 expression significantly inhibited cell migration. Conclusion： DACT3 is highly expressed in ovarian cancer， and is an independent risk factor affecting the prognosis of ovarian cancer. It may be used as a prognostic indicator and molecular therapeutic traget for ovarian cancer patients.

[Key words]? ?dishevelled-binding antagonist of beta-catenin 3; ovarian cancer; prognosis

卵巢癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，致死率高。2020年全球180多個(gè)國(guó)家卵巢癌患者31.4萬(wàn)，死亡病例高達(dá)20.7萬(wàn)[1]。卵巢癌早期缺乏特異癥狀而不易發(fā)現(xiàn)，晚期則無(wú)有效的治療方法，預(yù)后差，5年生存率僅20%～30%[2]。因此，尋找更多的分子靶點(diǎn)，研究候選基因在卵巢癌中的機(jī)制具有重要意義。β-環(huán)連蛋白抑制基因3（dishevelled-binding antagonist of beta-catenin 3，DACT3）既是上皮性卵巢癌中果蠅zeste基因增強(qiáng)子的人類同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）靶基因之一，又是Wnt通路重要調(diào)節(jié)分子，在腫瘤組織中起促癌作用[3]。本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載卵巢癌有關(guān)數(shù)據(jù)，收集60例漿液性卵巢癌患者臨床病理學(xué)資料及隨訪數(shù)據(jù)，采用SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染后進(jìn)行遷移能力實(shí)驗(yàn)，探究DACT3在卵巢癌中的的表達(dá)及其預(yù)后意義。

1? ?資料與方法

1.1? ?生信數(shù)據(jù)收集? ?從TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov/）及GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.gtexportal.org/home/）收集376例卵巢癌組織及180例正常組織基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選閾值： logFoldChange>1.5且P<0.01。RNA-seq數(shù)據(jù)使用R語(yǔ)言進(jìn)行歸一化處理。

1.2? ?臨床資料? ?收集2016年1月—2017年12月南通大學(xué)附屬醫(yī)院60例手術(shù)切除的漿液性卵巢癌及其癌旁正常卵巢組織標(biāo)本，年齡32～74歲，平均55±2.02歲；低級(jí)別33例，高級(jí)別27例；FIGO分期I～I(xiàn)I期33例，III～I(xiàn)V期27例。本研究獲我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.3? ?免疫組化檢測(cè)DACT3表達(dá)? ?將60例手術(shù)切除的漿液性卵巢癌及其癌旁正常卵巢組織標(biāo)本連續(xù)切片，4 μm厚，免疫組化染色采用ElivisionTM Plus法。DACT3表達(dá)水平根據(jù)染色強(qiáng)度和范圍綜合評(píng)估。染色強(qiáng)度：未染色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，淺棕色計(jì)2分，深褐色計(jì)3分。染色范圍：陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞<10%計(jì)1分，11%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。上述兩項(xiàng)得分的乘積為最終分?jǐn)?shù)，≥3分視為高表達(dá)，<3分為低表達(dá)。

1.4? ?細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染? ?人卵巢癌腺癌細(xì)胞株SKOV3（ATCC細(xì)胞庫(kù)）以DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%FBS和1%青霉素-鏈霉素）于5%CO2、37 ℃下培養(yǎng)，當(dāng)鏡下細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)傳代，傳代后細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，采用Lipofectamine 2000試劑（美國(guó)Thermo Fisher）進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。分為DACT3干擾組和陰性對(duì)照組。

1.5? ?Western blot實(shí)驗(yàn)? ?收集轉(zhuǎn)染48 h的SKOV3細(xì)胞，用RIPA裂解液提取蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉。加入一抗稀釋液（DACT3稀釋比例1 ∶ 250，GAPDH稀釋比例1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜，加二抗稀釋液（1 ∶ 3 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜后，使用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。DACT3購(gòu)自Bio-Techne，GAPDH及二抗購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.6? ?細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)? ?收集已轉(zhuǎn)染的SKOV3細(xì)胞分別接種在6孔板上，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)到90%以上時(shí)，采用無(wú)菌槍頭在培養(yǎng)皿中均勻劃痕，PBS洗滌3次，加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在劃痕0 h和24 h后顯微鏡下拍照，通過(guò)Image J圖像處理軟件計(jì)算劃痕愈合率。

1.7? ?統(tǒng)計(jì)學(xué)處理? ?應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法分析患者生存期；單因素及多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析DACT3與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? ?結(jié)? ? ? 果

2.1? ?DACT3基因與卵巢癌預(yù)后相關(guān)? ?基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)卵巢癌組織基因表達(dá)及生存數(shù)據(jù)分析，有40個(gè)基因在卵巢癌組織中差異表達(dá)，并與預(yù)后相關(guān)（圖1A），DACT3表達(dá)與卵巢癌患者總生存期（overall survival，OS）及無(wú)進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）（圖1B）。

2.2? ?DACT3表達(dá)是卵巢癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素? 單因素COX回歸分析顯示，除分期、分級(jí)外，DACT3表達(dá)、年齡、種族因素與卵巢癌預(yù)后相關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），病理學(xué)分期、分級(jí)與卵巢癌預(yù)后無(wú)關(guān)（P>0.05）。多因素COX回歸分析顯示，DACT3表達(dá)是影響卵巢癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P=0.00051）（圖2）。

2.3? ?DACT3在卵巢癌組織中高表達(dá)? ?免疫組化檢測(cè)顯示，正常卵巢組織不表達(dá)DACT3，卵巢癌組織表達(dá)DACT3，高級(jí)別卵巢癌組織中DACT3表達(dá)較低級(jí)別卵巢癌更強(qiáng)。DACT3在癌細(xì)胞核漿中均有表達(dá)，核內(nèi)表達(dá)強(qiáng)于胞漿（圖3）。

2.4? ?DACT3表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征相關(guān)性分析? ?60例卵巢癌中DACT3表達(dá)與腫瘤分化程度及FIGO分期有關(guān)（P<0.05）（表1）。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，DACT3表達(dá)與患者OS顯著負(fù)相關(guān)（P=0.001，圖4）。

2.5? ?DACT3對(duì)SKOV3細(xì)胞遷移能力的影響? ?Western blot驗(yàn)證細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，sh-DACT3組DACT3表達(dá)顯著抑制（圖5A）。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，干擾DACT3表達(dá)后SKOV3細(xì)胞遷移能力顯著減弱（P<0.001，圖5B-C）。

3? ?討? ? ? 論

卵巢癌居?jì)D科腫瘤死亡率首位[4]，發(fā)病機(jī)制目前并不十分明確，有研究表明產(chǎn)次、服用避孕藥和結(jié)扎輸卵管是卵巢癌的保護(hù)因素，年齡、乳腺癌病史及家族史是卵巢癌的危險(xiǎn)因素，環(huán)境因素及生活方式對(duì)患病率無(wú)明顯影響[5]。75%卵巢癌患者初次診斷時(shí)已處第三期或第四期，癌細(xì)胞已擴(kuò)散至盆外，無(wú)法從單純的手術(shù)中獲益[6-7]。隨著治療方案的進(jìn)步，目前卵巢癌5年生存率提升至47%左右，但增長(zhǎng)幅度僅2%～4%[4，8]。因此，研究卵巢癌新的分子標(biāo)志物用以診斷、判定預(yù)后和治療靶點(diǎn)具有重要意義。

DACT3屬于DACT家族，在多種腫瘤中表達(dá)失衡[9]。乳腺癌中乳腺絲氨酸酶抑制劑（mammary serine protease inhibitor，MASPIN）會(huì)引起DACT3的高表達(dá)；食管鱗狀細(xì)胞癌中DACT3的下調(diào)促進(jìn)細(xì)胞自噬和提高腫瘤的惡性程度；此外，DACT3表達(dá)還可能影響甲狀腺乳頭狀癌、結(jié)直腸癌的惡性程度[10-12]。在卵巢癌中EZH2引起DACT3高表達(dá)，其機(jī)制還不十分明確[3]。

本研究從TCGA及GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)下載有關(guān)卵巢癌組織及正常組織基因測(cè)序及患者臨床數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)DACT3高表達(dá)患者的OS和PFS較短（P<0.05）；單因素、多因素COX回歸分析顯示，DACT3表達(dá)可以作為影響卵巢癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P=0.00051）。對(duì)60例臨床卵巢癌患者病理特征及隨訪資料進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DACT3表達(dá)與FIGO分期及腫瘤分化程度相關(guān)，DACT3高表達(dá)患者預(yù)后差，OS較短。免疫組化檢測(cè)顯示，正常卵巢組織中DACT3不表達(dá)，卵巢癌組織中DACT3高表達(dá)，高級(jí)別卵巢癌組織中DACT3表達(dá)較低級(jí)別卵巢癌更強(qiáng)，提示DACT3可能具有促進(jìn)腫瘤惡性程度的潛力。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，干擾DACT3表達(dá)后人卵巢癌腺癌細(xì)胞株SKOV3遷移能力顯著減弱，提示DACT3可能與卵巢癌的侵襲、轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系。

綜上所述，DACT3在卵巢癌中高表達(dá)，是影響卵巢癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，有可能作為卵巢癌患者的預(yù)后指標(biāo)和分子治療的靶標(biāo)。

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[收稿日期] 2023-04-07

（本文編輯? ?王曉蘊(yùn)）