學齡前兒童重癥支原體肺炎實驗室檢查和免疫功能分析

周玉林　俞怡雪　范玉潔　駱亞麗　周衛芳　姜艷群

[摘? ?要]? ?目的：分析影響學齡前兒童發生重癥支原體肺炎（severe mycoplasma pneumoniae pneumonia，SMPP）的因素及其預測SMPP效能。方法：行支氣管肺泡灌洗的學齡前支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）患兒101例，分為重癥組53例和普通組48例。采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測支氣管肺泡灌洗液（BALF）中肺炎支原體（MP）載量及社區獲得性呼吸窘迫綜合征毒素（CARDS TX）表達量，酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清炎癥因子（IL-4、IL-6、IL-8、IL-1β及TNF-α）水平。血常規、淋巴細胞亞群、體液免疫檢測由醫院檢驗科完成。結果：兩組支氣管肺泡灌洗液中MP載量和CARDS TX表達量比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。重癥組外周血淋巴細胞計數為（3.09±2.00）×109/L，低于普通組的（4.38±2.93）×109/L，差異有統計學意義（P<0.05）；中性粒細胞計數與淋巴細胞計數比值（NLR）、血小板計數與淋巴細胞計數比值（PLR）、C反應蛋白（CRP）水平分別為3.03±2.61、163.17±103.75和32.30（19.00，38.25）mg/L，高于普通組的1.46±1.00、112.29±60.72和2.55（0.44，10.24）mg/L，差異均有統計學意義（P<0.05）。重癥組BALF中IL-4、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α水平分別為3.20±1.69 ng/L、27.12±17.82 ng/L、69.99±29.46 ng/L、13.83±1.72 ng/L和25.24±1.30 ng/L，高于普通組的1.76±0.83 ng/L、6.12±4.41 ng/L、20.35±10.59 ng/L、10.12±1.02 ng/L和23.26±0.71 ng/L，差異均有統計學意義（P<0.05）。重癥組CD3+CD4+、CD4+/CD8+、CD3-CD19+T細胞計數分別為0.87（0.60，1.42）×109/L、1.10（0.95，1.60）和0.51（0.26，0.98）×109/L，低于普通組的1.26（0.87，1.89）×109/L、1.50（1.30，1.90）和0.81（0.50，1.45）×109/L，差異均有統計學意義（P<0.05）。重癥組IgM、IgA水平高于普通組，差異均有統計學意義（P<0.05）。Logistic回歸分析顯示，NLR、PLR、CRP、IgM、IL-6和IL-8是影響SMPP發生的危險因素。ROC曲線分析顯示，CRP預測SMPP的曲線下面積為0.859，取最佳臨界值8.570 mg/L時，預測SMPP發生的敏感度為75.00%，特異度為90.60%。結論：過度炎癥反應和免疫功能紊亂可能是學齡前SMPP發生的主要病理機制，CRP對SMPP發生的預測價值較高。

[關鍵詞]? ?支原體肺炎；重癥；實驗室檢查；免疫功能

[中圖分類號]? ?R725.6 [文獻標志碼]? ?B [DOI]? ?10.19767/j.cnki.32-1412.2023.04.024

社區獲得性肺炎是兒童時期的常見病、多發病，國內10%～30%兒童社區獲得性肺炎由肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）感染引起[1]，重癥支原體肺炎（severe mycoplasma pneumoniae pneumonia，SMPP）患兒發病率逐年上升[2]。本文選擇2017年1月—2019年12月在我院住院行纖維支氣管鏡支氣管肺泡灌洗的學齡前支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）患兒為研究對象，檢測肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fliuld，BALF）中肺炎支原體載量、社區獲得性呼吸窘迫綜合征毒素（community- acquired respiratory distress syndrome toxin，CARDS TX）表達量以及血常規、細胞因子水平和免疫功能等指標，探究各指標對發生SMPP的預測價值。

1? ?資料與方法

1.1? ?一般資料? ?學齡前支原體肺炎患兒101例，根據病情分為重癥組53例和普通組48例。重癥組中男性25例，女性28例，平均年齡4.81±1.63歲。普通組中男性25例，女性23例，平均年齡4.48±1.25歲。兩組性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。納入標準：（1）年齡3～6歲，符合《諸福棠實用兒科學》肺炎診斷標準[3]；（2）符合支氣管鏡術指征[4]；（3）符合肺炎支原體感染標準：鼻咽吸取物（nasopharyngeal aspirates，NPA）或支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lanage fluid，BALF）中MP-DNA-PCR>1.0×103 copies/mL；單份血清MP-IgM≥1.1 S/CO，雙份血清的第2份IgG和（或）IgM較第1份增高4倍及以上（相隔7～14天）。（4）重癥組符合SMPP診斷標準[5]：在MPP確診基礎上符合以下任意1條：①明顯氣促或心動過速，伴或不伴呼吸困難、動脈血壓下降及發紺；②大環內酯類抗生素治療>7天無效，腋溫持續≥38.5℃；③胸部影像學顯示大面積致密影并累及面積≥2/3肺；④伴隨胸腔積液、肺不張等肺部并發癥；⑤合并低氧血癥、心力衰竭等其他系統嚴重損傷。排除標準：（1）其他病毒、細菌等病原體感染；（2）支氣管肺發育不良、肺結核、支氣管哮喘、先天性心臟病、免疫缺陷病、遺傳代謝疾病；（3）病歷資料不全者。本研究經我院倫理委員會批準，所有患兒家長簽署知情同意書。

1.2? ?方法

1.2.1? ?臨床資料收集：利用醫院病歷系統回顧性收集入選患兒一般臨床資料、入院后24小時內血常規、C反應蛋白（CRP）、淋巴細胞亞群、血清免疫球蛋白檢測結果。血常規、淋巴細胞亞群、體液免疫檢測由醫院檢驗科完成。

1.2.2? ?肺泡灌洗液收集：患兒均于入院3天內完成纖維支氣管鏡支氣管肺泡灌洗術，具體操作嚴格遵循《中國兒科可彎曲支氣管鏡術指南》（2018年版）[4]進行。電子支氣管鏡前端到達病變支氣管，經工作孔道注入37 ℃ 0.9%生理鹽水（每次注入5～10 mL，總量≤10 mL / kg）進行支氣管肺泡灌洗，以13.3～20.0 kPa負壓獲取BALF，保存于滅菌收集器。將1管BALF移入離心管中，4 ℃下1 200 r/min離心5 min，取上清液分裝于不含RNA酶的EP管。剩余沉淀加0.5 mL Trizol，吹打混勻后立即轉入不含RNA酶的EP管，放入-80 ℃冰箱備用。

1.2.3? ?BALF中MP載量測定：將BALF從-80 ℃冰箱取出，復溫后經震蕩、離心、去上清液，加入裂解液提取DNA，再進行PCR 擴增，儀器為美國BIO-RAD公司的iCycler iQ熒光定量PCR儀，引物及探針來自于廣州達安基因股份有限公司，具體操作按照試劑盒（達安基因股份有限公司）說明書進行。

1.2.4? ?BALF中CARDS TX表達量： BALF 標本 4 ℃ 下 12 000 r/min 在低溫高速離心機中離心 5 min，管底沉淀加入 0.5 mL Trizol，提取總 RNA，并逆轉錄合成 cDNA。以pdh A為內參，采用RT-qPCR法檢測CARDS TX，計算各段各基因表達的平均Ct值，采用相對表達量2-△△Ct法比較各基因的表達差異。試劑盒購自北京艾德萊生物，具體操作步驟按說明書。

1.2.5? ?血清炎癥因子測定：取靜脈血2 mL， 3 000 r/min離心10 min，分離收集血清，應用ELISA雙抗體夾心法檢測上清中IL-6、 IL-8和TNF-α水平，試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司。

1.3? ?統計學處理? ?應用SPSS 25.0統計學軟件對數據進行分析處理。符合正態分布的計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。采用Logistic回歸分析影響SMPP發生的危險因素，ROC曲線評價相關指標對SMPP的預測效能。P<0.05為差異有統計學意義。

2? ?結? ? ? 果

2.1? ?兩組肺泡灌洗液中MP載量及CARDS TX表達量比較? ?重癥組和普通組MP載量分別為5.71±1.40、5.29±2.32，CARDS TX表達量分別為1.6（0.5，

2.50）、2.50（1.38，2.50），兩組MP載量和CARDS TX表達量比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。

2.2? ?兩組血常規及CRP水平比較? ?重癥組淋巴細胞計數為（3.09±2.00）×109/L，低于普通組的（4.38±2.93）×109/L，差異有統計學意義（P<0.05）；NLR（中性粒細胞計數/淋巴細胞計數比值）、PLR（血小板計數/淋巴細胞計數比值）、CRP水平分別為3.03±2.61、163.17±103.75和32.30（19.00，38.25）mg/L，高于普通組的1.46±1.00、112.29±60.72和2.55（0.44，

10.24）mg/L，差異均有統計學意義（P<0.05）。兩組白細胞及中性粒細胞計數比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.3? ?兩組免疫指標比較? ?重癥組CD3+CD4+、CD4+/CD8+、CD3-CD19+、CD19+CD23+T細胞計數分別為0.87（0.60～1.42）×109/L、1.10（0.95～1.60）、0.51（0.26～0.98）×109/L、0.23（0.12～0.31）×109/L，低于普通組的1.26（0.87～1.89）×109/L、1.50（1.30～1.90）、0.81（0.50～1.45）×109/L、0.51（0.29～0.84）×109/L，差異均有統計學意義（P<0.05）。重癥組IgM、IgA水平高于普通組，差異均有統計學意義（P<0.05）。兩組CD3+細胞、CD3+CD8+細胞及NK細胞計數比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.4? ?兩組肺泡灌洗液中炎癥因子水平比較? ?重癥組肺泡灌洗液中IL-4、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α水平均高于普通組，差異均有統計學意義（P<0.001）。見表3。

2.5? ?Logistic回歸分析影響SMPP發生的危險因素? ?以發生SMPP為因變量，LYM、NLR、PLR、CRP、IgM、IgA、IL-4、IL-6、IL-8為自變量，行多因素Logistic回歸分析，結果顯示NLR、PLR、CRP、IgM、IL-6、IL-8是影響SMPP發生的危險因素，具有統計學意義（P<0.05）。

2.6? ?相關實驗室指標對SMPP的預測效能? ?ROC曲線分析顯示，CRP曲線下面積（area under the curve，AUC）最大，為0.859（95%CI：0.781～0.937，P<0.001），NLR、PLR、IgM、IL-6、IL-8的AUC均小于0.75。CRP取最佳臨界值8.570 mg/L時，預測SMPP發生的敏感度為75.00%，特異度為90.60%。見圖1。3? ?討? ? ? 論

支原體是介于病毒和細菌之間的一類缺乏細胞壁的小型原核病原微生物，支原體肺炎多發生于學齡前和學齡兒童。MP一方面通過病原體及其毒素直接損傷宿主呼吸道上皮細胞[6]，另一方面通過體液免疫、細胞免疫、細胞因子等間接損傷機體，引起全身炎癥反應[7]。CARDS TX是MP產生的重要毒素，分布于MP細胞質內及細胞膜上。本研究結果顯示，重癥組患兒肺泡灌洗液MP載量及CARDS TX表達量與普通組比較，差異均無統計學意義（P>0.05），可能是患兒經過一段時間的治療，部分病原體被滅活排出，也可能是病原體載量不是重癥肺炎發病的主要原因，病情嚴重程度不完全取決于CARDS TX。

本研究中重癥組淋巴細胞計數低于普通組，淋巴細胞計數降低導致NLR、PLR增高，考慮為MP感染后主要是中性粒細胞反應性增生，在局部發揮殺菌作用，與既往研究一致[8]。免疫功能紊亂是MP感染致病機制之一。重癥組血清IgA、IgM水平高于普通組，持續的高免疫球蛋白血癥對機體免疫損傷更嚴重[9]。既往研究證實MP感染可導致淋巴細胞活化，淋巴細胞亞群的平衡遭到破壞，淋巴細胞亞群變化與MPP進展密切相關，尤其是CD4+Th細胞與MPP的嚴重程度相關[10]。本研究中重癥組CD3+CD4+、CD4+/CD8+、CD3-CD19+、CD19+CD23+T細胞計數低于普通組，差異均有統計學意義（P<0.05）。

MP進入人體呼吸道后，機體為清除MP而產生IL-6、IL-8等促炎因子，同時MP釋放的毒素刺激巨噬細胞釋放促炎因子，導致大量炎癥細胞聚集造成免疫損傷。另一方面，機體通過促進抑炎因子分泌來減輕炎性反應的損害[11]，兩者失衡造成機體內環境穩態失衡，就會引起疾病的發生。IL-4主要由輔助型T細胞2（Th2）分泌，刺激B細胞增殖，促進免疫球蛋白生成。IL-6由淋巴細胞、成纖維細胞及巨噬細胞產生，在機體炎癥反應、自身免疫及抗感染方面具有重要作用[12]。IL-8是由單核細胞產生的一種趨化因子，它募集中性粒細胞、T淋巴細胞在感染組織內浸潤和釋放活性物質引發炎癥反應，造成組織損傷[13]。TNF-α是在各種致炎因素刺激下最早分泌的炎性因子，主要由單核細胞和巨噬細胞產生，可刺激IL-1β等次級炎癥因子的產生，進而促進T細胞傳遞信號啟動炎性反應。有研究發現，MP、CARDS TX可刺激機體產生TNF-α、IL-1β等促炎細胞因子[14]。本研究中重癥組肺泡灌洗液中IL-4、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α水平高于普通組，差異均有統計學意義，提示炎癥因子在SMPP的免疫發病機制中發揮重要作用。

本研究Logistic回歸分析發現，NLR、PLR、CRP、IgM、IL-6、IL-8是影響SMPP發生的危險因素。ROC曲線分析顯示，CRP的AUC最大，為0.859，NLR、PLR、IgM、IL-6、IL-8的AUC均小于0.75。CRP取最佳臨界值8.570 mg/L時，預測SMPP的敏感度為75.00%，特異度為90.60%。CRP是肝臟合成的一種急性時相反應蛋白，是常用的敏感炎癥指標，常于炎癥性疾病發病6～8小時升高，24～48小時達到高峰，升高幅度與感染或炎癥反應嚴重程度正相關。本研究中CRP診斷SMPP的最佳臨界值為8.570 mg/L，低于其他研究中的臨界值[15]，考慮與本研究對象為學齡前兒童，免疫反應不如大齡兒童強，而且患兒入院時大多病程大于48小時有關。NLR、 PLR、IgM、IL-6、IL-8的AUC均小于0.75，提示單一炎癥指標或者免疫指標不能有效評估SMPP，預測SMPP可能需要多個免疫指標綜合評估。

綜上所述，過度炎癥反應和免疫功能紊亂可能是SMPP發生的主要病理機制，然而本次研究病例數較少，未統計患兒入院前病程天數，存在一定的局限性，今后需要擴大病例數進一步研究。

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[收稿日期] 2022-11-30

（本文編輯? ?趙喜）