白附子對大鼠腦缺血再灌注的保護作用研究

曹 明 丁 峰 涂玉婷 謝文天

腦卒中已逐漸成為全球第二大致死病因，缺血性腦卒中具有復發率高、死亡率高等特點，其根本病因是血管內血栓形成，進而導致腦組織壞死和局灶性神經元缺損[1-2]。白附子作為天南星科植物獨角蓮的干燥塊莖，具有祛風痰、通經絡和解毒鎮痛等功效。相關研究表明，含白附子的湯劑能改善腦神經功能[3-5]，然而白附子對于腦缺血再灌注的作用機制鮮有報道。本研究從行為學評分、腦梗死率及氧化應激等相關方面來探討白附子對大鼠腦缺血再灌注的保護作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年健康SD 雄性大鼠32 只，體質量250～300 g，飼養于杭州醫學院實驗動物中心，溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，12 h 晝夜交替，自由飲食，適應性喂養1 周。動物合格證號：SCXK（浙）2019-0002。本研究經醫學倫理委員會審核通過，倫理審批號：ZJCLA-IACUC-20040087。

1.2 藥物與試劑 白附子，購自河南省禹州市，經浙江省天臺縣人民醫院藥劑科主管中藥師徐世余鑒定為天南星科植物獨角蓮的干燥塊莖。稱取2 kg 白附子，置純凈水中浸泡過夜，至自動煎藥機中煎煮2次，過濾濃縮后制成生藥量為1 g/mL 的藥液；尼莫地平片（規格：20 mg/片，批號2004009），購自正大青春寶藥業有限公司；超氧化物歧化酶酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（superoxide dismutase，SOD），購自南京建成生物工程研究所（批號20210409）；丙二醛ELISA 試劑盒（malonaldehyde，MDA），購自碧云天生物技術有限公司（產品編號S0131S）。

1.3 實驗儀器 BZY150A 型三延煎藥機（天津三延精密機械有限公司，中國）、SpectraMAX M2 多功能酶標儀（Molecular Devices，美國）、動物保護溫臺（Kent scientific，美國）、FinePix S602 Zoom 數碼相機（FinePix，日本）、Wayne Rasband ImageJ 1.37c 圖像分析軟件（National Institutes of Health，美國）（用于完成圖像采集和分析）。

1.4 分組及給藥 將實驗動物按隨機數字表法分為四組，分別是假手術組（未造模處理的對照組）、模型組（僅造模處理的對照組）、白附子組（10 g/kg）、尼莫地平組（10 mg/kg），每組8 只實驗大鼠，白附子組和尼莫地平組于每日同一時間進行相應劑量灌胃給藥，假手術組和模型組分別給予相同體積的生理鹽水，持續8 d，白附子組和尼莫地平組在給藥結束后造模。

1.5 大鼠大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型制備 參考彭慧淵等[6]建立的MCAO 模型，以線栓法阻塞大腦動脈來誘導大鼠腦缺血。將水合氯醛麻醉過的大鼠固定在保溫臺上，進行頸正中心切口，結扎頸外動脈和近心端的頸總動脈，夾緊頸總動脈的遠心端。在頸總動脈遠端和近端中間切口并插入尼龍線，約距頸總動脈分叉1.8～2.0 cm處遇阻力停。假手術組只插入尼龍線0.5 cm 左右。缺血60 min 后抽出尼龍線縫合創面，再灌注24 h 后觀察各項指標。提尾懸空時，右前肢屈曲，走路時旋轉到右側即為造模成功。

1.6 神經功能學評分 造模24 h 后按照Longa 評分[6-7]的分級法進行評分。0 分：各項行動正常進行；1分：右前肢提尾時不能完全伸展（神經功能輕度缺損；2 分：走路時向右側打圈（神經功能中度缺損）；3分：自主運動時向右側傾斜（神經功能缺損嚴重）；4分：不能自發性行走（意識障礙）。實驗數據中剔除MCAO 術后行動正常的動物。

1.7 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2、3、5-Triphenytetrazoliumchloride，TTC）染色 造模24 h 后，每組取6只大鼠，麻醉后斷頭取腦，冰箱速凍后切腦片，腦片置于37 ℃的0.5%TTC 溶液中避光振蕩孵育20 min，使染色均勻。染色后在4%多聚甲醛中固定，然后拍照。進行影像分析計算腦梗死率，腦梗死率（%）=腦梗死體積/全腦體積×100%。

1.8 腦組織病理學改變觀察 取大鼠腦組織灌流固定后，脫水和透明，浸蠟和包埋，切片制作，脫蠟至水，加入蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）試劑盒染色，在顯微鏡下觀察腦組織形態變化。

1.9 大鼠血清SOD 和MDA 測定 造模24 h 后，每組大鼠麻醉后快速打開腹腔，經腹主動脈采血，分離血清，SOD 和MDA 水平嚴格按照試劑盒說明書操作檢測。

1.10 統計學方法 應用SPSS 21.0 統計軟件進行統計分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差進行分析；組間兩兩比較，若方差齊，則采用t 檢驗，若方差不齊，則采用Kruskal-Wallis H 檢驗，P＜0.05 認為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠神經功能學評分比較 腦缺血再灌注損傷后，模型組、白附子組和尼莫地平組神經功能缺失評分均有所升高（P＜0.05）；術前給予白附子和尼莫地平治療后，兩組神經功能評分均大幅降低（P＜0.05）；白附子組與尼莫地平組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠神經功能學評分及腦梗死率比較（±s）

表1 各組大鼠神經功能學評分及腦梗死率比較（±s）

注：假手術組、模型組均予等量生理鹽水灌胃；白附子組予10 g/kg 白附子灌胃；尼莫地平組予10 mg/kg 尼莫地平灌胃；Longa 為神經功能缺失評分；與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別假手術組模型組白附子組尼莫地平組鼠數6666 Longa 評分（分）0.00±0.00 2.83±0.41a 1.67±0.52b 1.33±0.52b腦梗死率（%）0.00±0.00 24.97±7.16a 14.96±7.54b 8.20±7.17b

2.2 各組大鼠腦梗死率比較 TTC 染色顯示，除假手術組外，其余各組均有明顯白色梗死灶。術前給予白附子和尼莫地平治療后，兩組梗死率顯著減少（P＜0.05）；尼莫地平組比白附子組梗死率小，但兩組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1、圖1。

圖1 各組大鼠的TTC 染色結果

2.3 各組大鼠腦組織病理形態學變化 假手術組動物皮層結構正常，神經元細胞分布均勻，形態正常；模型組動物皮層結構疏松，組織間隙水腫，神經元大量減少，細胞核固縮，排列不規則；與模型組相比，白附子組和尼莫地平組的神經元明顯增加，組織水腫、核固縮等現象明顯減輕。見圖2。

圖2 各組大鼠腦組織形態學表現比較（HE 染色，×100）

2.4 各組大鼠氧化應激因子水平比較 大鼠腦缺血再灌注發生后，血清MDA 大量產生，SOD 減少（P＜0.05），發生過氧化反應；經白附子及尼莫地平治療后，兩組均能使MDA 水平下降，SOD 水平升高（P＜0.05）；尼莫地平組與白附子組MDA、SOD 水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠氧化應激因子水平比較（±s）

表2 各組大鼠氧化應激因子水平比較（±s）

注：假手術組、模型組均予等量生理鹽水灌胃；白附子組予10 g/kg 白附子灌胃；尼莫地平組予10 mg/kg 尼莫地平灌胃；SOD 為超氧化物歧化酶；MDA 為丙二醛；與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別假手術組模型組白附子組尼莫地平組鼠數6666 MDA（μmol/L）2.21±0.35 3.91±1.09a 1.26±1.02b 1.67±0.54b SOD（U/mL）16.13±4.77 8.08±3.93a 12.53±2.56b 13.81±1.75b

3 討 論

引起腦缺血再灌注損傷的機制很復雜，包括氨基酸過度釋放、自由基損傷及細胞內Ca2+超載等[8]。腦缺血后血流恢復，會產生大量的氧自由基，出現脂質過氧化反應，加重一系列的生理病理變化，造成神經細胞的進一步損害[9]。作為氧自由基發生脂質過氧化后的產物，MDA 的含量高低可間接反映機體的氧化損傷程度。而SOD 作為抗氧化相關酶，其含量往往與MDA 負相關[10]。本研究發現，模型組神經細胞大量減少，細胞腫脹，同時伴有SOD 水平降低，MDA水平升高，可能與大量氧自由基反應引起的細胞結構破壞有關。

白附子主要成分包括苷類、酚類、脂類和揮發油等[11]，其中酚類和黃酮類化合物占比較高，可有效清除氧自由基[12]。有研究表明，其腦苷成分對于大鼠腦缺血再灌注后引起的神經損傷具有保護作用，其作用機制可能是通過激活鉀離子通道，然而其他成分的作用機制尚不明確[11]。本研究結果表明，白附子可以縮小腦梗死體積，使神經功能評分降低，證實其對于腦缺血再灌注有一定的保護作用，且效果不劣于尼莫地平。氧化應激是腦缺血再灌注損傷的重要機制。腦缺血再灌注發生后，活性氧迅速產生，破壞氧化還原平衡，導致大量的MDA 產生。白附子可以通過抑制MDA 產生，增加抗氧化酶的活性來減少氧化應激的刺激，分析其原因可能與酚類和黃酮類化合物清除氧自由基相關。

對于白附子的劑量選擇，本研究通過藥理實驗中動物與人體間的等效劑量換算，并參考文獻[13]，選擇了10 g/kg，結果表明該劑量安全有效。

綜上所述，通過減少缺血事件后活性氧的產生，白附子可以減輕氧化應激和腦缺血后的神經元損傷，但對其他方面的作用機理，仍需進一步探討。