miR-141-3p通過調節Keap1-NRF2/ARE信號通路對急性呼吸窘迫綜合征大鼠肺纖維化的影響

龍光文，張謙，楊秀林，孫鴻鵬，吉春玲

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是由彌漫性肺部炎癥和水腫引起的肺損傷，導致肺泡毛細血管屏障破壞、低氧血癥、細胞大量凋亡和肺纖維化［1］。其中，肺損傷后組織修復異常導致肺纖維化是急性期后ARDS患者病死率較高的主要原因［2］。自噬和上皮-間充質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）在急性肺損傷（acute lung injury，ALI）及其纖維化過程中起重要作用。自噬可通過抑制EMT，增強肺纖維化的局部肌成纖維細胞分化，調節ARDS 進展［3］。因此，探究介導ARDS患者肺部損傷和肺纖維化發展分子機制對治療和改善預后非常重要。微小RNA（miRNA）是調節基因的非編碼RNA，廣泛參與炎癥和纖維化，其中miR-141-3p具有調節細胞增殖、分化、凋亡和炎癥反應的作用。研究表明，miR-141-3p在脂多糖（LPS）誘導的人肺成纖維細胞中表達下調［4］。核因子E2 相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，NRF2）是一種具有抗炎和抗氧化活性的轉錄因子，在正常情況下，NRF2 與Kelch 樣環相關蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）結合；當細胞中存在氧化還原失衡時，NRF2 與Keap1解離，并結合細胞核中的抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）來促進抗氧化基因的轉錄［5］。通過調節Keap1/NRF2 信號通路可緩解LPS 誘導的ALI［6］。miR-141-3p 能否通過調節Keap1-NRF2/ARE 信號通路影響ARDS 大鼠肺纖維化尚不清楚。本研究通過構建肺纖維化大鼠模型，對其進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只SPF級SD大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，生產許可證號：SCXK（滬）2022-0004，飼養單位為貴州省疾病預防控制中心，使用許可證號：SYXK（黔）2020-0001，6～8周齡，適應性喂養1周，飼養環境溫度22 ℃左右，濕度55%，12 h光暗循環，不禁水食。本研究通過動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器 大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞RLE-6TN購自美國ACCT 細胞庫。miR-141-3p agomir 及其陰性對照（agomir-NC）、miR-141-3p 模擬物（mimics）及其陰性對照（miR-NC）、Keap1 過表達質粒（Keap1）及其對照（pcDNA，上海艾博思生物公司）；胎牛血清（FBS）、Ham's F12 培養基（武漢普諾賽生命科技有限公司）；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（美國Promega 公司）；TRIzol 試劑盒（沈陽萬類生物公司）；實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒、反轉錄試劑盒（日本Takara公司）；羥脯氨酸（Hyp）試劑盒、Masson染色試劑盒（北京索萊寶公司）；HE 染色試劑盒（上海翌圣生物公司）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（上海酶聯生物公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）；上皮型鈣黏附素（E-cadherin）、神經型鈣黏附素（N-cadherin）和β-actin 一抗（上海愛必信公司）；微管相關蛋白輕鏈3B（LC3B）、自噬相關基因Beclin-1、α 平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）、Keap1、NRF2、血紅素氧合酶1（HO-1）抗體和辣根酶標記山羊抗兔IgG二抗（英國Abcam公司）。全自動酶標儀（奧地利TECAN公司）；熒光定量PCR儀（美國Bio-rad公司）；顯微鏡（日本尼康公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物模型構建和分組 將大鼠按隨機數字表法分為對照組、模型組、agomir-NC 組、miR-141-3p agomir 組，每組10只。除對照組外，其余大鼠構建ARDS 模型［7］，麻醉大鼠，分離暴露氣管，將LPS（5 mg/kg）滴注于大鼠氣管內，輕柔旋轉大鼠以促進LPS 均勻分布。對照組滴注相同劑量的生理鹽水。24 h 后大鼠出現呼吸頻率增快、精神萎靡、活動減少等癥狀表明模型構建成功，其中造模過程中4只大鼠死亡，對造模不成功或死亡大鼠進行補充。造模48 h 后，agomir-NC組、miR-141-3p agomir 組分別氣管滴注agomir-NC、miR-141-3p agomir慢病毒50 μL，并輕柔旋轉大鼠，對照組和模型組給予相同劑量的生理鹽水，每周2次，連續3周。造模成功后，麻醉處死大鼠，取左肺組織4%多聚甲醛固定進行HE 染色、Masson染色；右肺組織-80 ℃保存進行其余檢測。

1.3.2 細胞培養、處理和分組 將RLE-6TN 細胞置于含10%PBS 的Ham's F12 培養基中，37°C、5%CO2培養箱中培養至對數生長期。將RLE-6TN 細胞分為NC 組、LPS 組、miR-NC 組、miR-141-3p mimics 組、miR-141-3p mimics+pcDNA 組、miR-141-3p mimics+Keap1 組。除NC 組外，其余各組RLE-6TN 細胞以5 mg/L LPS［8］誘導24 h 構建LPS 細胞模型，miR-NC 組、miR-141-3p mimics 組、miR-141-3p mimics+pcDNA 組、miR-141-3p mimics+Keap1 組在LPS 誘導的基礎上質粒轉染miR-NC、miR-141-3p mimics、miR-141-3p mimics+pcDNA、miR-141-3p mimics+Keap1，NC 組正常培養，所有細胞經培養48 h后用于后續實驗。

1.3.3 qPCR 將各組肺組織和細胞培養48 h 后使用TRIzol試劑盒提取總RNA，并用逆轉錄試劑盒得到cDNA，隨后進行qPCR。反應體系為20 μL：2×SG Fast qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 模板2 μL，PCR-grade water 補至20 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性3 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計40 個循環。miR-141-3p 以U6 為內參，Keap1 以GAPDH 為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-141-3p、Keap1 mRNA相對表達水平。引物由上海生工生物公司合成，見表1。

Tab.1 qPCR primer sequences表1 qPCR引物序列

1.3.4 Western blot 檢測蛋白表達 取-80 ℃保存的大鼠肺組織和細胞，用RIPA 裂解，提取總蛋白，用BCA 試劑盒進行濃度定量，按步驟將蛋白SDS-PAGE 電泳、轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，在4 ℃下加入兔抗鼠一抗E-cadherin、Ncadherin、LC3B、Beclin-1、α-SMA、Col-Ⅰ、Keap1、NRF2、HO-1（1∶1 000）和β-actin（1∶2 000）過夜孵育，清洗，在4 ℃下加入二抗山羊抗兔IgG（1∶2 000），孵育2 h。用ECL 發光顯影，觀察拍照，各條帶灰度值用Image J軟件處理分析

1.3.5 HE 染色和Masson 染色 取多聚甲醛固定的肺組織，石蠟包埋，制備肺切片（4 μm），脫蠟后HE 染色、Masson 染色，脫水封片后在電子顯微鏡下觀察肺部組織病理學變化并拍照。并對肺組織進行肺損傷評分和肺纖維化面積評分，其中肺損傷評分：有無出血；肺泡隔膜數；肺泡內纖維蛋白量；每視野肺泡內炎性浸潤，共計為0～4 分，分數越高損傷程度越重。肺纖維化面積評分：0分，不存在纖維化；1分，輕度；2分，中度；3分，重度；4分，極重度［9］。

1.3.6 Hyp 含量測定 取-80 ℃保存大鼠肺組織，6 mol/L 的120 ℃HCl 中水解過夜，并調節pH 值至中性，按照Hyp 試劑盒說明書檢測其含量。

1.3.7 ELISA法檢測炎性因子和氧化應激指標 取-80 ℃保存大鼠肺組織和細胞，按照ELISA 試劑盒說明書，檢測炎性因子IL-1β、TNF-α和氧化應激指標MDA、SOD水平。

1.3.8 雙螢光素酶報告實驗 構建含Keap1 的野生型（WT）和突變型（MUT）序列的重組質粒，將突變位點克隆至PmirGLO 載體，分別命名為WT-Keap1 和MUT-Keap1。將上述重組報告質粒分別與miR-141-3p mimics 或miR-NC 共轉染至RLE-6TN 細胞中，轉染48 h 后用螢光素酶試劑盒檢測螢光素酶活性。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0 軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-141-3p 和Keap1 在各組大鼠肺組織中的表達 與對照組相比，模型組、agomir-NC 組大鼠肺組織miR-141-3p、NRF2、HO-1 表達水平降低，Keap1 mRNA 及蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，miR-141-3p agomir 組miR-141-3p、NRF2、HO-1 表達水平顯著升高，Keap1 mRNA 及蛋白表達降低（P＜0.05）。見圖1、表2。

Fig.1 Expression of Keap1-NRF2/ARE pathway protein in lung tissue of rats in each group圖1 各組大鼠肺組織Keap1-NRF2/ARE通路蛋白表達

Tab.2 Expression of miR-141-3p,Keap1-NRF2/ARE in lung tissue of rats in each group表2 各組大鼠肺組織miR-141-3p、Keap1-NRF2/ARE表達（n=10，±s）

Tab.2 Expression of miR-141-3p,Keap1-NRF2/ARE in lung tissue of rats in each group表2 各組大鼠肺組織miR-141-3p、Keap1-NRF2/ARE表達（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組agomir-NC組miR-141-3p agomir組F miR-141-3p 1.03±0.10 0.41±0.04a 0.45±0.06a 0.88±0.10b 152.209＊＊Keap1 mRNA 1.00±0.09 1.59±0.16a 1.61±0.14a 1.18±0.13b 52.517＊＊Keap1 0.46±0.05 0.94±0.09a 0.95±0.10a 0.52±0.06b 115.083＊＊NRF2 0.88±0.10 0.44±0.06a 0.45±0.07a 0.81±0.09b 81.454＊＊HO-1 0.78±0.09 0.37±0.04a 0.35±0.05a 0.62±0.08b 92.186＊＊

2.2 過表達miR-141-3p對肺組織病理學變化的影響 對照組大鼠肺組織結構完整，無炎癥、水腫、出血，未見膠原沉積；模型組、agomir-NC 組大鼠出現肺組織損傷，肺泡壁增厚、水腫出血、破裂，炎性細胞浸潤，出現大量藍色膠原纖維；相比于模型組、agomir-NC 組，miR-141-3p agomir 組大鼠肺組織病理損傷減輕，炎性細胞和膠原沉積減少。見圖2，與對照組相比，模型組、agomir-NC 組大鼠肺損傷評分、肺纖維化面積評分升高（P＜0.05）；與模型組相比，miR-141-3p agomir 組肺損傷評分、肺纖維化面積評分降低（P＜0.05）。見表3。

Fig.2 Pathological staining of lung tissue in each group(×200)圖2 各組大鼠肺組織病理染色圖（×200）

Tab.3 Lung injury and pulmonary fibrosis area scores in each group表3 各組大鼠肺組織肺損傷和肺纖維化面積評分（n=10，分，±s）

Tab.3 Lung injury and pulmonary fibrosis area scores in each group表3 各組大鼠肺組織肺損傷和肺纖維化面積評分（n=10，分，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組agomir-NC組miR-141-3p agomir組F肺損傷評分0.00±0.00 3.08±0.36a 3.12±0.34a 1.24±0.26b 110.639＊＊肺纖維化面積評分0.00±0.00 3.29±0.46a 3.32±0.49a 1.70±0.35b 44.875＊＊

2.3 過表達miR-141-3p 對Hyp 含量、炎性因子和氧化應激水平影響 與對照組相比，模型組、agomir-NC 組大鼠肺組織Hyp、IL-1β、TNF-α、MDA升高，SOD降低（P＜0.05）；與模型組相比，miR-141-3p agomir 組Hyp、IL-1β、TNF-α、MDA 降低，SOD 升高（P＜0.05）。見表4。

Tab.4 Comparison of Hyp content,inflammatory factors and oxidative stress levels in lung tissue between the four groups of rats表4 各組大鼠肺組織Hyp含量、炎性因子和氧化應激水平比較（n=10，±s）

Tab.4 Comparison of Hyp content,inflammatory factors and oxidative stress levels in lung tissue between the four groups of rats表4 各組大鼠肺組織Hyp含量、炎性因子和氧化應激水平比較（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組agomir-NC組miR-141-3p agomir組F Hyp/（μg/g）413.68±52.06 1 068.51±14.27a 1 019.84±10.41a 583.74±62.08b 114.771＊＊IL-1β/（ng/L）17.39±2.14 62.83±7.53a 61.29±6.32a 24.58±3.52b 201.172＊＊TNF-α/（ng/L）35.62±4.97 80.37±9.13a 81.43±8.75a 42.57±5.39b 142.026＊＊MDA/（mmol/g）2.37±0.54 5.26±1.23a 5.24±1.47a 2.45±0.47b 25.700＊＊SOD/（U/mg）22.38±2.61 12.75±1.38a 13.46±1.41a 20.64±3.68b 39.818＊＊

2.4 過表達miR-141-3p 對肺組織E-cadherin、Ncadherin、LC3B、Beclin-1、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達的影響 與對照組相比，模型組、agomir-NC 組大鼠肺組織E-cadherin、LC3B、Beclin-1 蛋白表達降低，N-cadherin、α-SMA、Col-Ⅰ升高（P＜0.05）；與模型組相比，miR-141-3p agomir 組E-cadherin、LC3B、Beclin-1蛋白表達升高，N-cadherin、α-SMA、Col-Ⅰ降低（P＜0.05）。見圖3、表5。

Fig.3 The expression of E-cadherin,N-cadherin,LC3B,Beclin-1,α-SMA and Col-I protein in lung tissue of rats in each group圖3 各組大鼠肺組織E-cadherin、N-cadherin、LC3B、Beclin-1、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達變化

Tab.5 The expression of E-cadherin,N-cadherin,LC3B,Beclin-1,α-SMA and Col-Ⅰprotein in lung tissue of rats in each group表5 各組大鼠肺組織E-cadherin、N-cadherin、LC3B、Beclin-1、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達 （n=10，±s）

Tab.5 The expression of E-cadherin,N-cadherin,LC3B,Beclin-1,α-SMA and Col-Ⅰprotein in lung tissue of rats in each group表5 各組大鼠肺組織E-cadherin、N-cadherin、LC3B、Beclin-1、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組agomir-NC組miR-141-3p agomir組F Col-Ⅰ0.34±0.05 1.04±0.13a 1.02±0.10a 0.45±0.06b 165.444＊＊E-cadherin 0.96±0.10 0.54±0.06a 0.51±0.05a 0.83±0.09b 80.331＊＊N-cadherin 0.57±0.06 1.04±0.11a 1.08±0.10a 0.61±0.07b 96.950＊＊LC3B 0.92±0.10 0.46±0.05a 0.49±0.07a 0.88±0.09b 95.098＊＊Beclin-1 1.03±0.13 0.52±0.06a 0.55±0.07a 0.84±0.09b 71.048＊＊α-SMA 0.48±0.07 0.95±0.11a 0.97±0.14a 0.53±0.06b 69.146＊＊

2.5 miR-141-3p 與Keap1 靶向關系驗證 生物信息學分析顯示，miR-141-3p 與Keap1 存在靶向結合位點，見圖4。雙螢光素酶實驗顯示，與miR-NC+WT-Keap1 組相比，miR-141-3p mimics+WT-Keap1組相對螢光素酶活性降低（0.41±0.06vs.1.02±0.10，t=12.813，P＜0.05），與miR-NC+MUT-Keap1 組相比，miR-141-3p mimics+MUT-Keap1 組相對螢光素酶活性差異無統計學意義（1.03±0.11vs.1.00±0.13，t=0.432，P＞0.05）。

Fig.4 Prediction of the targeting relationship between Keap1 and miR-141-3p圖4 Keap1與miR-141-3p靶向關系預測

2.6 miR-141-3p 和Keap1-NRF2/ARE 信號通路在各組細胞中的表達 與NC組相比，LPS組、miR-NC組miR-141-3p、NRF2、HO-1 表達水平降低，Keap1mRNA 及蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與LPS 組相比，miR-141-3p mimics 組、miR-141-3p mimics+pcDNA 組miR-141-3p、NRF2、HO-1 表達水平顯著升高，Keap1 mRNA 及蛋白表達降低（P＜0.05）；與miR-141-3p mimics 組相比，miR-141-3p mimics+Keap1 組miR-141-3p、NRF2、HO-1 表達水平降低，Keap1 mRNA及蛋白表達水平升高（P＜0.05）。見圖5、表6。

Fig.5 Expression changes of Keap1-NRF2/ARE signaling pathway in each group of cells圖5 各組細胞Keap1-NRF2/ARE信號通路表達變化

Tab.6 Changes in expression levels of miR-141-3p and Keap1-NRF2/ARE in each group of cells表6 各組細胞miR-141-3p、Keap1-NRF2/ARE表達變化（n=6，±s）

Tab.6 Changes in expression levels of miR-141-3p and Keap1-NRF2/ARE in each group of cells表6 各組細胞miR-141-3p、Keap1-NRF2/ARE表達變化（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與LPS組比較，c與miR-141-3p mimics組比較，P＜0.05。

組別NC組LPS組miR-NC組miR-141-3p mimics組miR-141-3p mimics+pcDNA組miR-141-3p mimics+Keap1組F miR-141-3p 1.00±0.10 0.32±0.04a 0.35±0.05a 0.89±0.10b 0.90±0.11b 0.40±0.06c 91.128＊＊Keap1 mRNA 1.02±0.09 1.85±0.19a 1.83±0.18a 1.28±0.14b 1.25±0.13b 1.74±0.18c 37.999＊＊Keap1 0.48±0.06 1.04±0.10a 1.05±0.11a 0.57±0.07b 0.55±0.06b 0.84±0.09c 57.719＊＊NRF2 0.92±0.10 0.34±0.05a 0.35±0.06a 0.85±0.09b 0.83±0.08b 0.41±0.05c 83.166＊＊HO-1 0.86±0.09 0.32±0.04a 0.31±0.04a 0.76±0.08b 0.74±0.09b 0.43±0.05c 76.020＊＊

2.7 miR-141-3p靶向調節Keap1對IL-1β、TNF-α、

MDA、SOD、E-cadherin、N-cadherin、LC3B、Beclin-1、α-SMA、Col-Ⅰ的影響 與NC組相比，LPS組、miRNC 組SOD、E-cadherin、LC3B、Beclin-1 表達降低，IL-1β、TNF-α、MDA、N-cadherin、α-SMA、Col-Ⅰ表達水平升高（P＜0.05）；與LPS 組相比，miR-141-3p mimics 組、miR-141-3p mimics+pcDNA 組SOD、Ecadherin、LC3B、Beclin-1 表達水平升高，IL-1β、TNF-α、MDA、N-cadherin、α-SMA、Col-Ⅰ表達降低（P＜0.05）；與miR-141-3p mimics 組相比，miR-141-3p mimics+Keap1 組SOD、E-cadherin、LC3B、Beclin-1 表達水平降低，IL-1β、TNF-α、MDA、Ncadherin、α-SMA、Col-Ⅰ表達升高（P＜0.05）。見圖6，表7、8。

Fig.6 The protein expressions of E-cadherin,N-cadherin,LC3 B,Beclin-1,α-SMA and Col-Ⅰin each group圖6 各組細胞E-cadherin、N-cadherin、LC3B、Beclin-1、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達

Tab.7 Comparison of IL-1β,TNF-α,MDA and SOD levels between the six groups表7 各組細胞IL-1β、TNF-α、MDA、SOD水平比較（n=6，±s）

Tab.7 Comparison of IL-1β,TNF-α,MDA and SOD levels between the six groups表7 各組細胞IL-1β、TNF-α、MDA、SOD水平比較（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與LPS組比較，c與miR-141-3p mimics組比較，P＜0.05。

組別NC組LPS組miR-NC組miR-141-3p mimics組miR-141-3p mimics+pcDNA組miR-141-3p mimics+Keap1組F IL-1β/（ng/L）20.14±2.81 73.46±7.35a 71.08±7.48a 31.25±4.07b 35.73±4.28b 62.15±7.06c 91.789＊＊TNF-α/（ng/L）40.62±4.59 91.39±10.13a 89.73±9.64a 49.56±5.03b 48.41±5.72b 71.53±8.04c 52.171＊＊MDA/（nmol/L）2.45±0.32 5.63±1.53a 5.64±1.47a 2.86±0.48b 2.85±0.47b 4.36±1.25c 11.416＊＊SOD/（U/L）25.81±2.63 11.97±1.36a 12.04±1.39a 19.68±2.46b 20.54±2.63b 15.36±1.58c 40.727＊＊

Tab.8 Comparison of E-cadherin,N-cadherin,LC3 B,Beclin-1,α-SMA and Col-Ⅰprotein levels between the six groups表8 各組細胞E-cadherin、N-cadherin、LC3B、Beclin-1、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達比較（n=6，±s）

Tab.8 Comparison of E-cadherin,N-cadherin,LC3 B,Beclin-1,α-SMA and Col-Ⅰprotein levels between the six groups表8 各組細胞E-cadherin、N-cadherin、LC3B、Beclin-1、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達比較（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與LPS組比較，c與miR-141-3p mimics組比較，P＜0.05。

組別NC組LPS組miR-NC組miR-141-3p mimics組miR-141-3p mimics+pcDNA組miR-141-3p mimics+Keap1組F E-cadherin 1.16±0.14 0.45±0.06a 0.48±0.07a 0.91±0.09b 0.93±0.11b 0.56±0.25c 27.623＊＊N-cadherin 0.47±0.06 1.08±0.12a 1.06±0.11a 0.56±0.06b 0.58±0.07b 0.93±0.13c 48.701＊＊LC3B 0.98±0.10 0.45±0.06a 0.47±0.05a 0.83±0.09b 0.85±0.08b 0.51±0.08c 52.012＊＊Beclin-1 1.13±0.12 0.36±0.05a 0.38±0.06a 0.88±0.10b 0.85±0.09b 0.48±0.05c 88.257＊＊α-SMA 0.45±0.06 1.14±0.12a 1.12±0.10a 0.57±0.06b 0.56±0.07b 0.86±0.11c 61.578＊＊Col-Ⅰ0.38±0.04 1.06±0.12a 1.04±0.11a 0.43±0.05b 0.46±0.06b 0.91±0.10c 84.890＊＊

3 討論

肺纖維化的主要特征是成纖維細胞增殖伴細胞外基質（主要是膠原蛋白）過度沉積，導致肺泡結構的破壞并促進重塑，是ARDS 患者預后不良的主要因素［2］。LPS 氣管給藥是誘導ARDS 和肺纖維化的常用方法，可促進炎癥反應和活性氧（ROS）的產生，抑制抗氧化活性，從而誘導肺組織和細胞EMT的發生［10］。EMT 是上皮細胞逐漸獲得間充質特征的關鍵過程，與多種病理過程相關，如肺纖維化，從而導致ARDS 患者的不良結局。研究證實，抑制EMT 可改善ARDS肺纖維化［11］。自噬是一種依賴溶酶體的自我消化過程，可對功能失調的細胞成分和受損蛋白質進行降解。自噬在許多病理生理狀況中起著重要作用，其中肺部疾病時肺組織可出現不同程度的自噬異常，而中等程度的自噬有利于疾病狀況的改善［12］。已有研究表明，抑制自噬會導致肺成纖維細胞增殖［13］。此外，自噬與EMT還可能相互調節參與肺纖維化，在肺泡上皮細胞中，抑制自噬可促進EMT，增強局部肌成纖維細胞分化，導致纖維化發生［14］。因此，促進ARDS自噬，抑制EMT可能緩解肺纖維化進程。

本研究發現，LPS誘導后ARDS大鼠肺組織出現嚴重損傷，肺泡壁增厚、水腫、出血、破裂，炎性細胞浸潤，大量膠原沉積，IL-1β、TNF-α、MDA、纖維化相關蛋白（α-SMA、Col-Ⅰ）升高，表明ARDS大鼠出現炎癥反應和氧化應激，導致肺部損傷。肺組織中Hyp水平可反映肺纖維化的程度，ARDS大鼠肺組織Hyp水平升高，肺組織和細胞中纖維化相關蛋白（α-SMA、Col-Ⅰ）、間充質標志物N-cadherin 升高，上皮標志物E-cadherin、自噬相關蛋白（LC3B、Beclin-1）表達降低，表明ARDS中發生自噬抑制和EMT，猜測肺纖維化的發生與自噬抑制和EMT進程有關。

miR-141-3p是miR-200家族的成員，可以通過調節功能蛋白參與多種疾病的發生發展。miR-141-3p與多種疾病EMT和纖維化有關。Zhang等［15］發現miR-141-3p 下調促進腎曲小管上皮細胞EMT進程和纖維化發展；Zhu 等［16］發現在博來霉素（BLM）誘導建立的小鼠肺纖維化模型中，上調miR-141-3p表達可促進肺上皮細胞增殖，抑制EMT和凋亡，改善小鼠肺纖維化；Qian 等［17］發現miR-141-3p的上調通過靶向E 盒結合鋅指蛋白1（ZEB1），抑制EMT進展來減輕BLM誘導的肺纖維化。此外，miR-141-3p在急性肺炎患者和LPS刺激的人肺成纖維細胞中下調，上調其表達可減輕LPS誘導的細胞凋亡、自噬和炎癥反應［4］。本研究通過建立ARDS模型，發現miR-141-3p 在LPS 誘導的肺組織和細胞中表達下調，而過表達miR-141-3p可改善肺組織病理損傷和纖維化程度，降低Hyp含量，減少炎癥反應和氧化應激，促進自噬并降低EMT的發生。

Keap1/NRF2通路對于調節氧化應激至關重要，氧化應激下NRF2與Keap1解離，從細胞質轉移到細胞核并與ARE 結合來激活下游抗氧化效應子，如HO-1、SOD，發揮抗炎和抗氧化作用［5］。Keap1-NRF2/ARE信號通路參與調節肺部損傷和纖維化發展。研究發現，Hispolon 通過調節Keap1/Nrf2/HO-1通路，抑制氧化應激介導的細胞凋亡和自噬，減輕LPS誘導的ALI［18］；七氟醚通過下調細胞核Keap1和上調NRF2 激活下游抗氧化劑信號級聯反應，以消除氧化損傷改善LPS誘導的細胞凋亡和肺纖維化損傷［19］。此外，自噬不足與肺纖維化密切相關，自噬激活通過調節Keap1/NRF2 信號通路來緩解肺纖維化［20］。本研究發現，ARDS 大鼠炎癥和氧化應激激活，自噬受到抑制，且肺組織和細胞中Keap1表達升高，NRF2、HO-1 表達水平顯著降低，表明Keap1/Nrf2/HO-1 通路參與ARDS 肺纖維化發展，可能與Keap1/NRF2信號通路介導的炎癥、氧化應激和自噬有關。miR-141-3p 與Keap1 可能存在靶向關系。miR-141-3p通過調節Keap1/Nrf2/HO-1途徑可抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移，表明miR-141-3p可能通過激活Keap1-NRF2/ARE通路，激活自噬，抑制炎癥反應、氧化應激和EMT，抑制ARDS 大鼠肺纖維化［21］。過表達Keap1 可逆轉過表達miR-141-3p 對ARDS大鼠肺纖維化的改善作用。

綜上所述，過表達miR-141-3p 可能激活Keap1-NRF2/ARE信號通路，激活自噬，抑制炎癥反應、氧化應激和EMT 進展，改善ARDS 大鼠肺纖維化。本研究為改善ARDS大鼠肺纖維化提供了新思路，但miR-141-3p與Keap1-NRF2/ARE信號通路之間的具體分子機制和miR-141-3p 在ARDS 肺纖維化中的其他發病機制還需進一步探討。