念珠藻類(藍藻)psbA基因的進化分析

摘 要：藍藻psbA基因家族編碼不同形式的D1蛋白，該蛋白是光系統II反應中心的重要組成部分.以39條念珠藻屬（Nostoc）及與其同源性較高的psbA基因序列為研究對象，構建最大似然樹進行系統發育分析，然后運行PAML4.9軟件，使用分支模型、位點模型和分支位點模型估測氨基酸位點ω值，進一步探討psbA基因所受到的選擇壓力.結果表明：（1）系統發育樹呈現出內類群中念珠藻分為2個大分支.（2）在分支位點模型和位點模型下檢測出13S，42V，75S，152R和255K為統計學上顯著的正選擇位點，絕大多數為負選擇位點.揭示了念珠藻psbA基因所經歷的正選擇可能在其適應極端環境中起著重要作用.

關鍵詞：念珠藻；psbA基因；正向選擇；負向選擇

中圖分類號：Q941.2文獻標志碼：A

念珠藻是由膠質外鞘包被的絲狀固氮藍藻，自身能合成多種特殊的化合物，有助于其在各種高度競爭的生態位中生存下來，尤其可在極度干旱、高溫和寒冷等環境中生活［1-2］.該類藍藻含有具免疫調節作用和抗氧化活性的三萜類氨基酸、肽類、多不飽和脂肪酸和色素等天然產物［1，3］.在醫學中，還有很多用于不同治療目的的新型藥物化合物，而高度多樣化的生態系統中生長的念珠藻成為了化學合成的替代品，在食品、醫藥和化妝品等行業具有極高的推廣價值，經濟效益可觀［3-4］.

植物類囊體膜蛋白D1是光系統II反應中心的核心.在光照條件下，光合作用中水的分解涉及多步氧化和光化學反應，這些反應主要導致藍藻、綠藻和高等植物光系統II反應中心D1蛋白的光致光損傷，促進新的D1蛋白來替換損失蛋白以維持其正常的生理功能.因此，D1蛋白比其他光系統II蛋白有更高的周轉率［5］.而藍藻psbA基因家族編碼不同形式的D1蛋白，每種亞型的不同調節確保其適應不斷變化的環境條件［6］.另一方面，由于psbA基因保守性較強，植物分類學家把它作為一個重要的分子標記，尤其是屬以上水平有較好的區分度［7］.但是對其功能研究還較少，尤其是藻類psbA基因是否存在正選擇很少受到關注.

自然選擇不斷推動物種進化，維持著生態系統的物種多樣性，而物種在進化過程中核心蛋白往往要承受巨大的選擇壓力.判斷選擇壓力的分子進化參數用ω來表示，也就是核苷酸非同義替換率（dN）與同義替換率（dS）的比值.計算所得結果中，若ω=1，即dN=dS，表明選擇不影響適合度，屬于中性進化；ω＜1，即dN＜dS，表明非同義突變降低了固定速率；ω＞1，即dN＞dS，暗示蛋白質可能發生了適應性進化［8-9］.目前已有大量文獻報道了蕨類植物多個科屬rbcL［10-12］，psaA［13］，psbA［14］，psbD［15］，rps4［16］，rps12［17］，rpoC1［18］，matK［19］等基因的適應性進化研究成果，結果表明matK，rpoC1，psaA，rbcL和rps12等5個基因中均存在正選擇位點.森林等［20］對裸子植物4亞綱53個代表種的psbA基因展開了適應性進化研究，檢測到了3個正選擇位點.目前對于低等植物基因的適應性進化研究僅集中到幾種藻類上，MILLER等［21］分析了特殊生境下生長的聚球藻（藍藻門）rbcL基因的適應性進化情況，發現正選擇位點389位氨基酸與多個蛋白活性位點相關.鞏超彥等［22］對淡水紅藻中的psaA基因（主要編碼光系統Ⅰ反應中心蛋白）適應性進化研究中發現處于強烈的負選擇作用下的位點占比較大.LIANG等［23］發現雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）PDS基因正選擇位點所占比例為7.9%.此外，王捷等［24-25］也對念珠藻固氮作用相關基因hetR和nifH進行了適應性進化分析，在nifH基因中發現14個位點經歷了正選擇，而在hetR基因中僅發現1個位點經歷了正選擇.生物分子水平上正選擇和負選擇位點的準確剖析，不僅能深度挖掘基因結構和功能變異，還可進一步揭示其進化歷程.

念珠藻可在多種逆境條件下生存，而逆境條件下的選擇壓力往往可以導致植物的光合作用相關基因發生進化［10-15］，因此本研究主要分析環境脅迫下念珠藻psbA基因在進化過程中的選擇壓力，為探索其精確的功能位點及進化歷程提供一定的證據.

1 材料和方法

1.1 測序及系統樹構建

本研究共選取了39條藍藻psbA基因序列，其中測定了31株形態多樣化的念珠藻基因序列（31株念珠藻樣品以及PCR擴增條件的詳細信息參考文獻［24-26］），正、反向測序工作均由北京華大基因科技有限公司完成，其余8條同源性較高的基因序列是從GenBank數據庫中下載獲得.使用Clustal X version 2.0［27］軟件將以上39條序列進行對齊排列，并逐一仔細檢查校正.運用MEGA7.0［28］軟件中的K2P（Kimura2-parameter）模型來分析每一條序列，然后通過Modeltest（Version3.7）［29］軟件計算并獲得最優進化模型，最后使用PhyML3.0［30］軟件構建最大似然樹.

1.2 選擇壓力分析

基于念珠藻屬psbA基因構建最大似然樹的本源數據，打開PAML4.9軟件包，分別運行位點模型、分支模型和分支位點模型等3種模型中Codeml模塊，以此結果來分析psbA基因在其演化歷程中是否經受正選擇作用［13-14］.分支模型中采用兩種極端模型來檢測各分支的選擇壓力，這兩種模型為簡單的單比率模型和最全面的自由比率模型.這兩種極端模型之間還存在一些其他模型，本研究還使用了二比率模型進行了分析.位點模型主要通過ω值來估測psbA基因是否經歷了正選擇，如果ω＞1，說明可能存在正選擇位點，如果ω＜1，則不存在正選擇位點.主要分析3對模型（M1a和M2a，M0和M3，M7和M8），每對模型兩兩之間比較，然后依χ2分布進行LRT（likelihood ratio test）檢驗并確定位點是否發生過正選擇.分支位點模型可檢驗指定分支中位點的進化方式，經查閱文獻發現，選擇test2算法檢驗前景分支（所指定的分支）中的正選擇位點更具有準確性［15-16］.

1.3 三維結構建模

以普通念珠藻（Nostoc commune HK-02）PsbA氨基酸序列（GenBank登錄號：AP018326）為參比序列，提交瑞士生物信息研究所網站［24］，基于同源建模原理來預測PsbA蛋白的三維結構.然后用BioEdit［31-32］軟件比對建模序列（AP018326）和鑒定出正選擇位點的氨基酸序列，直觀展現正選擇位點.最后運用Raswin［33］軟件將正選擇位點標記于晶體結構中.

2 實驗結果

2.1 系統發育分析

選取無類囊體藍藻Gloeobacter violaceus PCC 7421（GenBank登錄號：BA000045）為外類群，利用最大似然法重建了念珠藻psbA基因的譜系關系.結果顯示，內類群中的念珠藻明顯聚集到2個大的分支E和F上，本研究所測序的大部分念珠藻藻株聚到E分支中，而E分支又包含A，B，C和D 4個較小的分支，其中A分支包含3株新疆古爾班通古特沙漠采集到的念珠藻（XA013，XA017和XA019），吉林省靖宇縣采集到的未定種念珠藻（CHAB2813），我國山西忻州市神池縣山坡、寧夏回族自治區土地和湖北省鶴峰市稻田等地分別采集到的普通念珠藻（Nostoc commune）、發狀念珠藻（Nostoc flagelliforme）和擬球狀念珠藻（Nostoc sphaeroides），以及中國淡水藻種庫保存的來源于美國的1株普通念珠藻（FACHB261）和中國科學院植物研究所的1株發狀念珠藻（FACHB838）.B分支包含C和D兩個小的分支，其中C分支包含7株新疆古爾班通古特沙漠采集到的念珠藻（XA009，XA010，XA011，XA012，XA014，XA015和XA016）、湖南省永州市采集到的普通念珠藻（CHAB2806）和中國淡水藻種庫保存的來源于美國的1株灰色念珠藻（Nostoc muscorum，FACHB316）.D分支包含分別采集于浙江省寧波市東錢湖湖邊、云南省洱源海西海湖邊以及中國科學院水生生物研究所蘇鐵共生和土體上未定種的4株念珠藻、湖北省武昌區水稻田中采集到的1株沼澤念珠藻（Nostoc paludosum，FACHB88）.F分支包含分別來自于我國以及日本的3株普通念珠藻（CHAB2803，CHAB2807和CHAB2820），還有來自于我國內蒙古自治區和甘肅省的2株發狀念珠藻.根據所計算出的樹型結構，分析以上6個分支中位點的進化方式.

2.2 選擇壓力分析

三種模型下所計算出的估計值、似然值和正選擇位點等結果詳見附表1和附表2.分支模型中計算了單比率模型、二比率模型和自由比率模型，其中單比率模型結果顯示似然值為-7 156.439 702，ω估計值為0.075 81.自由比率模型結果顯示A，B，C，D和E分支ω值小于1，僅有F分支的ω值大于1（ω值為999.000 00），說明該分支位點可能經歷了正選擇，需對F分支進行進一步的分支位點模型檢測驗證.二比率模型指定的前景支F的ω估計值大于1，數值同樣為999.000 00，表明這個分支可能存在正選擇位點，前景支A，B，C，D，E的ω估計值均小于1，表明這幾個分支可能均不存在正選擇位點.LRT檢驗發現（見附表2），B，C，E和F分支的后驗概率均大于0.05，說明上述結果不可靠.位點模型下，鑒定出255K為具有統計學意義的正向選擇位點，在兩個模型M2a和M8中都有檢出，后驗概率均大于99%.分支位點模型中，在前景支B檢測出位點75S（后驗概率為100%）經歷了正選擇，前景支E檢測出位點94S（后驗概率為99.7%）經歷了正向選擇，分支F檢測出13S（后驗概率為96.8%），42V（后驗概率為95.5%），75S（后驗概率為99.7%）和152R（后驗概率為99.7%）等5個正選擇位點，其余分支均未檢出正選擇位點.經似然比檢驗發現（表2），A，C，D和E分支的后驗概率均大于0.05，拒絕檢出正選擇位點.

2.3 正選擇位點定位

經同PDB數據庫中蛋白序列比對發現，與一株嗜熱藍藻（Thermosynechococcus vulcanus，PDB ID：6JLK）的PsbA蛋白結構相似度高達88.95%.基于此來預測念珠藻PsbA蛋白的三維結構.經對位排列，圖2直觀展示了不同藻株的氨基酸序列所檢測出的正選擇位點.圖3中標示出13S，42V，75S，152R和255K等5個正選擇位點.

3 討 論

藍藻psbA基因家族編碼不同形式的D1蛋白，每種亞型的不同調節確保其適應不斷變化的環境條件［6］.當念珠藻的某些基因經受強烈的正選擇壓力時，則暗示該藻已適應所生存環境中的一些關鍵影響因子，并預示著在該進化時間點可能激發出部分蛋白的新功能，而強烈的負選擇壓力會使該藻的蛋白維系其固有的重要功能且變得高度保守［12-16］.正選擇位點的篩選將有助于預測基因功能區或解決遺傳育種等生物技術難題.

由于psbA基因保守性較強，植物分類學家把它作為一個重要的分子標記用于植物系統發育分析中，尤其是屬以上水平有較好的區分度［7］.所構建的ML系統發育樹顯示，內類群中的念珠藻明顯聚集到2個大的分支E和F上，本研究所測序的大部分念珠藻藻株聚到E分支中，而E分支又包含A，B，C和D 4個較小的分支，其中A分支包含3株新疆古爾班通古特沙漠采集到的念珠藻（XA013，XA017和XA019）、吉林省靖宇縣采集到的未定種念珠藻（CHAB2813），我國山西忻州市神池縣山坡、寧夏回族自治區土地和湖北省鶴峰市稻田等地分別采集到的普通念珠藻、發狀念珠藻和擬球狀念珠藻，以及中國淡水藻種庫保存的來源于美國的1株普通念珠藻（FACHB261）和中國科學院植物研究所的1株發狀念珠藻（FACHB838）.普通念珠藻、發狀念珠藻和擬球狀念珠藻野外形態分別呈現片狀、頭發絲狀和圓球狀等，但是在實驗室純化培養條件下都長成圓球狀，難以辨認.現系統發育樹中的3種近似藻類聚為一支，且有較高的支持率.猜測這3種念珠藻是否屬于同一種念珠藻，可進行二代測序或結合其他相關生理生化手段分析.B分支包含C和D兩個小的分支，其中C分支包含7株新疆古爾班通古特沙漠采集到的念珠藻（XA009，XA010，XA011，XA012，XA014，XA015和XA016）、湖南省永州市采集到的普通念珠藻（CHAB2806）和中國淡水藻種庫保存的來源于美國的1株灰色念珠藻（FACHB316）.D分支包含分別采集于浙江省寧波市東錢湖湖邊、云南省洱源海西海湖邊以及中國科學院水生生物研究所蘇鐵共生和土體上未定種的四株念珠藻、湖北省武昌區水稻田中采集到的1株沼澤念珠藻（FACHB88）.這幾株未定種的念珠藻也可能是新種，可以進一步進行多基因分析.F分支包含分別來自于我國以及日本的3株普通念珠藻（CHAB2803，CHAB2807和CHAB2820），還有來自于我國內蒙古自治區和甘肅省的2株發狀念珠藻.可以看出以上6分支中不同的系統發育位置分布著同一物種，不同國家、省份采集到的藻種聚到不同的分支上，表明利用psbA單一基因的系統發育分析具有一定的局限性，未能呈現出念珠藻的進化關系.根據系統發育樹樹形結構，選定以上6個分支分析念珠藻psbA基因是否經歷了正選擇.

本研究分支模型中，自由比率模型結果顯示A，B，C，D和E分支ω值小于1，僅有F分支的ω值大于1（ω值為999.000 00），說明該分支位點可能經歷了正選擇，需對F分支進行進一步的分支位點模型檢測驗證.二比率模型指定的前景支F的ω估計值大于1，數值同樣為999.000 00，表明這個分支可能存在正選擇位點.前景支A，B，C，D，E的ω估計值均小于1，表明這幾個分支可能均不存在正選擇位點.LRT檢驗發現（見附表2），B，C，E和F分支的后驗概率均大于0.05，說明上述結果不可靠.位點模型下，鑒定出255K為具有統計學意義的正向選擇位點，在兩個模型M2a和M8中都有檢出，后驗概率均大于99%.鞏超彥等［33］和韓雨昕等［34］分別對不同紅藻rbcL基因適應性進化研究中，均并未能在位點模型下發現正選擇位點.分支位點模型中，在前景支B檢測出位點75S（后驗概率為100%）經歷了正選擇，前景支E檢測出位點94S（后驗概率為99.7%）經歷了正向選擇，分支F檢測出13S（后驗概率為96.8%），42V（后驗概率為95.5%），75S（后驗概率為99.7%）和152R（后驗概率為99.7%）等5個正選擇位點，其余分支均未檢出正選擇位點.經似然比檢驗發現（附表2），A，C，D和E分支的后驗概率均大于0.05，拒絕檢出正選擇位點.

本文采用分支模型、位點模型以及分支位點模型探討了環境脅迫下的念珠藻psbA基因在進化過程中的選擇壓力，發現13S，42V，75S，152R和255K等5個位點經受了正向選擇壓力，絕大多數為負選擇位點.大量文獻表明高等植物在進化過程中大多數基因處于正向選擇壓力之下［10，20］.相比低等植物，藍藻在地球上出現已有35億年之久，分布廣泛，種類繁多，有更廣闊的研究前景.目前對藍藻甚至更多藻類基因的選擇壓力研究較少，而藻類重要基因選擇壓力分析的新發現可推斷其分子水平的進化.

附 錄

附表見電子版（DOI：10.16366/j.cnki.1000-2367.2023.01.015）.

參 考 文 獻

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Evolutionary analysis on psbA gene of Nostoc-like（Cyanobacteria）

Wei Aili1， Yang Xie1， Wang Jie1， Gong Chaoyan2， Wang Qinghua1， Li Yanhui1

（1. Department of Biology， Taiyuan Normal University， Jinzhong 030619， China; 2. Laboratory Management Center，

Shanxi University of Chinese Medicine， Jinzhong 030619， China）

Abstract： The psbA gene family in cyanobacteria encodes different forms of the D1 protein which is part of the Photosystem II reaction center. In this study， 39 psbA gene sequences with high homology of Nostoc were used to construct a maximum likelihood tree for phylogenetic analysis. Then using PAML4.9 software， the branch model， site model and branch-site models were estimated ω values， to explore the selective pressure of the psbA gene. Our results indicate that： （1）the phylogenetic tree showing the inner group could be divided into two large branches of Nostoc. （2）five significant positively selected sites such as 13S， 42V， 75S， 152R and 255K were detected in branch-site models and site model， indicating that most of the sites were under negative selection pressure. Therefore， the results showed that positive selection of psbA might have played an important role in the adaption of Nostoc to the extreme environments.

Keywords： Nostoc; psbA gene; positive selection; purifying selection

［責任編校 劉洋 楊浦］

收稿日期：2021-10-29;修回日期：2021-12-04.

基金項目：國家自然科學基金（32000167；51709197）；山西省“1331工程”服務流域生態治理產業創新學科集群建設項目；山西省基礎研究計劃面上項目（自由探索類）（202103021224302）；山西省高等學校教學改革項目（J2020273）.

作者簡介：魏愛麗（1969-），女，山西太谷人，太原師范學院教授，博士，研究方向為植物發育與生態毒理學，E-mail：67514292@qq.com.

通信作者：王捷， E-mail：nostoc@126.com.