牛至精油對嗜熱四膜蟲基因表達的影響

摘 要：牛至精油（Oregano Essential Oil，OEO）具有抗菌、殺菌、抑制寄生蟲生長等功效.為了解牛至精油影響細胞生長的分子調控過程，對牛至精油作用下0 h和24 h的嗜熱四膜蟲的基因表達情況進行分析.高通量轉錄組測序結果表明，對照組即未加入牛至精油24 h與 0 h的樣本數據，比較分析后鑒定到了6 297個差異表達基因（包括下調4 232個、上調2 065個），而實驗組即加入牛至精油24 h與 0 h的樣本數據，比較分析后鑒定到7 596個差異表達基因（包括下調6 254個、上調1 342個）.通過與對照組差異表達基因的比較發現，實驗組特異上調和下調差異表達基因分別有257個和2 329個.GO功能富集發現，特異上調差異表達基因無功能富集，特異下調差異表達基因功能主要富集在RNA加工、蛋白質分解代謝、細胞定位和信號轉導等過程.KEGG通路分析發現，特異下調差異表達基因主要涉及細胞自噬及細胞周期等通路.而這些過程或通路上基因表達水平的下調可能會抑制細胞的生長.對通路中7個下調的差異表達基因和3個無明顯差異表達變化的基因進行實時熒光定量PCR檢測，實驗結果和轉錄組測序數據結果的相關性高.根據相關基因和通路的分析，繪制了牛至精油作用下影響嗜熱四膜蟲細胞生長的可能模型，為探討分子調控機理提供線索.

關鍵詞：牛至精油;嗜熱四膜蟲;轉錄組;差異表達基因

中圖分類號：Q75文獻標志碼：A

牛至（Origanum vulgave L），又名小葉薄荷，為多年生草本植物，廣泛分布在中國大部分地區［1］.牛至精油（Oregano Essential Oil，OEO）是從牛至草中提取的具有特殊芳香氣味的揮發性油，顏色呈淡黃色且透明，是一種混合物，其化學成分大部分為酚類化合物及其前體萜類物質，主要是百里香酚、香荊芹酚、γ-萜品烯和β-聚傘花素等［2-3］.牛至精油的作用廣泛，包括抗菌作用，可破壞細菌細胞壁和細胞膜的結構，或與細胞膜中的磷脂反應，破壞蛋白質合成，使細菌生長受到抑制，或破壞細菌的DNA復制，影響細菌繁殖；抗氧化作用，通過其主要成分清除烷氧自由基；抑制寄生蟲作用，包括人或動物的腸道寄生蟲，例如瘧原蟲、艾美爾球蟲、線蟲和小隱孢子蟲等［4-10］.牛至精油是一種新型的天然植物抗生素，具有來源廣泛、抗菌效果顯著、不易產生耐藥性等特點［11］.相對于傳統的抗生素，其經濟市場需求更加強烈，在水產養殖方面尤為重要，發展前景十分廣闊.然而，目前研究主要集中在牛至精油對水產魚類的誘食作用、提高水產動物的生產性能、增添膚色肌肉的優質營養性、提高水產品品質、抗菌抗蟲等方向［11］.鮮有研究牛至精油影響細胞生長的分子調控和代謝通路等過程.相對于遺傳背景復雜的多細胞生物，單細胞真核原生動物是一類很好的實驗材料，從形態上看，原生動物是單一的細胞，從生理上看，它是很復雜的，具有維持生命和持續后代所必需的一切功能［12］，用其來研究牛至精油對細胞生長分子調控的影響，有利于理解和認識牛至精油影響細胞生長的分子調控機理.

原生動物模式生物嗜熱四膜蟲（Tetrahymena thermophila）具有典型的纖毛蟲特征，多倍體的大核和二倍體的小核，大核是營養核，基因表達活躍，小核是生殖核，基因在營養生長期不表達［12］.嗜熱四膜蟲能在實驗室進行純培養，繁殖速度快（即2.5～3 h一代），基因敲除、基因插入等遺傳操作手段已廣泛運用［13］.嗜熱四膜蟲的遺傳背景清晰，目前已鑒定到26 996個基因［14］，建立了四膜蟲的功能基因組學數據庫［15］、比較基因組學數據庫［16］、轉錄組學數據庫［17］和蛋白磷酸化組學數據庫［18］等，為嗜熱四膜蟲基因分子功能的研究提供重要支撐.

本研究通過牛至精油對嗜熱四膜蟲基因表達的影響，對轉錄組數據進行分析，探究了牛至精油對嗜熱四膜蟲生長的影響，為了解牛至精油抑制細胞生長的分子調控機理提供線索.

1 材料與方法

1.1 細胞培養

嗜熱四膜蟲在無菌條件下培養，培養基由質量分數分別為2%的示蛋白胨，0.1% 酵母粉，0.2% 葡萄糖，0.003% 檸檬酸鐵高溫高壓滅菌配制而成.培養過程中置于30 ℃，135 r/min 搖床內［19］.

1.2 牛至精油EC50測定

牛至精油由廣東海洋大學魯義善教授惠贈.該牛至精油的質量分數是100%，質量濃度為1 g/mL.牛至精油不溶于水，利用DMSO水溶液配置了牛至精油的母液，質量濃度為0.1 g/mL.

將嗜熱四膜蟲大量培養至對數期前期后（約1.2×105 cells/mL），取4.5 mL細胞分裝至黑蓋瓶，然后分別加入不同質量濃度（1×10-4，2×10-4，5×10-4，1×10-3 g/mL）的牛至精油500 μL，作用0，12，24，36 h后測取細胞密度，來繪制細胞密度與時間的變化曲線.同時，測量0 h和24 h不同質量濃度DMSO對嗜熱四膜蟲的細胞密度變化.

在不同質量濃度的牛至精油（包括0，1×10-5，2×10-5，5×10-5，1×10-4，1.5×10-4，2×10-4，5×10-4，1×10-3 g/mL）的作用下，測量0 h和24 h的嗜熱四膜蟲細胞密度，計算牛至精油24 h作用下嗜熱四膜蟲的相對生長速率.通過GraphPad Prism 8.0.2軟件（GraphPad Software，San Diego，CA，USA）計算半數抑制濃度（median effective concentration，EC50），軟件參數均默認.

1.3 總RNA 提取、文庫構建及測序

牛至精油作用0 h和24 h時，對照組（牛至精油的質量濃度為0，此時DMSO的質量濃度為0.18%，分別標記為C0和C24）和實驗組（牛至精油的質量濃度為EC50值，此時DMSO的質量濃度也為0.18%，分別標記為P0和P24）分別收集4 mL嗜熱四膜蟲經1 500 r/min離心3 min 富集細胞，并加入RNA保護細胞試劑（RNA protect cell reagent，QIAGEN，USA）凍存在-80 ℃.根據RNeasy Plus Mini kit（QIAGEN，USA）說明書進行樣品提取，總RNA 溶于RNA-free H2O水中.轉錄組樣品委托了北京諾禾致源科技股份有限公司借助 Illumina Hiseq 4000的平臺完成文庫構建及測序.

1.4 轉錄組數據處理和差異表達基因分析

轉錄組測序（transcriptome sequencing，RNA-seq）的原始數據，首先進行質量檢測，主要是利用 FASTX-Toolkit 軟件對低質量的reads進行過濾，去除，并利用 Trim-Galore軟件對測序的原始 reads 進行去接頭以及去除錯誤率大于0.001的堿基.然后，過濾后的reads 序列使用Tophat2（version2.0.9）軟件將每個樣品的reads分別比對至嗜熱四膜蟲的大核參考基因組，軟件參數均為默認值.并根據比對結果用featureCounts（v1.6.0）軟件統計比對到每一個基因的reads數目.比對完成后，利用R（version 4.0.2）中的DEseq2包對基因表達值進行標準化，并計算分析得到相對表達值（fragments per kilobase of exon per million fragments mapped，FPKM）.

在差異表達基因分析過程中，為降低由于低覆蓋的reads 造成FPKM值極低所帶來的影響，篩選差異表達基因的時候需滿足以下兩條標準條件之一：兩樣品間的FPKM值比較后的差異倍數變化（Fold Change，FC）大于等于2且其中表達值FPKM大于等于5；或當其中一個樣本基因表達的FPKM值為0時，而另一樣本中該基因表達的FPKM值大于等于5.篩選得到的差異表達基因將用于分析.

1.5 GO富集分析與代謝通路分析

差異表達基因的gene ontology（GO）富集分析由 Cytoscape中的插件 Bingo（版本號：3.0.2）完成的，使用的是錯誤發現率（FDR，False Discovery Rate）多重矯正，顯著性閾值設置為0.001，軟件參數均為默認值.富集分析中所參考的嗜熱四膜蟲全基因組GO注釋是四膜蟲基因組數據庫（Tetrahymena genome database wiki，簡稱TGD，http：//ciliate.org/index.php/home/welcome/）中公布的蛋白質組序列.KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）數據庫（https：//www.kegg.jp/kegg/mapper/color.html）可在線分析差異表達基因的代謝通路.

1.6 實時熒光定量 PCR反應

利用實時熒光定量PCR（Quantitative Real Time Polymerase Chain reaction，RT-qPCR）反應分析差異基因的表達倍數.基因擴增的引物序列由Primer Premier 5（http：//www.premierbiosoft.com/primerdesign）設計，具體信息如附表Ⅰ.利用提取的RNA逆轉錄成cDNA，逆轉錄試劑盒是利用全式金生物公司的.PCR反應是使用諾唯贊生物科技有限公司的2× Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix預混液，反應條件參考說明書.每個反應設置3組重復.以核糖體小亞基蛋白基因（RPS18）為內參基因，所有得到的數據均一化后進行比較分析.

2 結果與分析

2.1 牛至精油對嗜熱四膜蟲細胞密度的影響

將嗜熱四膜蟲培養至對數期前期，然后將其放置于一系列不同質量濃度的牛至精油中，在不同時間點（0、12、24、36 h）通過Beckman計數儀測取細胞密度，發現不同時間點嗜熱四膜蟲在不同質量濃度牛至精油比沒有牛至精油的細胞密度明顯減少，而且在12 h到24 h的過程細胞密度受到較大的影響（如圖1（a））.實驗結果發現牛至精油質量濃度為1×10-3 g/mL時，嗜熱四膜蟲細胞基本死亡，此時DMSO的質量分數為0.9%.為了驗證DMSO對嗜熱四膜蟲細胞生長的影響，測量了不同質量濃度的DMSO作用下嗜熱四膜蟲在0 h和24 h的細胞密度變化，結果顯示DMSO在1%的質量分數范圍內嗜熱四膜蟲的細胞密度變化不顯著（如圖1（b））.

將嗜熱四膜蟲放置于牛至精油中作用24 h后，其半數效應濃度EC50值為2×10-4 g/mL（如圖1（c））.嗜熱四膜蟲的相對生長率隨著牛至精油質量濃度的升高而降低，說明牛至精油對嗜熱四膜蟲細胞的生長有抑制作用.為了探究牛至精油抑制嗜熱四膜蟲細胞生長的分子調控過程，分別收集了牛至精油作用下（包括0和EC50值的質量濃度）的0 h和24 h（對照組即為牛至精油作用質量濃度為0，分別記為C0和C24，實驗組即為牛至精油作用質量濃度為EC50值，分別記為P0和P24）的嗜熱四膜蟲細胞，進行了RNA的提取及轉錄組測序.

2.2 樣本相關性分析以及差異表達與功能富集分析

為了研究樣品間的相關性，通過皮爾遜相關系數r檢測結果發現，沒有牛至精油作用下的對照組C0和牛至精油作用下的實驗組P0聚為一類，C24和P24聚為一類.結果表明，同一時間下牛至精油作用下的實驗組與沒有牛至精油作用下的對照組相關性接近，隨著時間的延長，實驗組與對照組的相關性變差，而且差距越來越大（圖2），牛至精油對嗜熱四膜蟲生長的影響較大.

通過對照組24 h與0 h的轉錄組數據比較分析發現，差異表達基因共計6 297個.其中下調差異表達基因4 232個（圖3（a）），這些基因功能富集之后主要涉及這些過程：包括基因表達相關過程（例如DNA復制和修復，RNA修飾，蛋白質合成，蛋白質翻譯等）、細胞周期過程（例如調節有絲分裂過程，染色凝聚和分離等）、氨基酸代謝、生物大分子代謝等（圖3（b））.其中上調差異表達基因2 065個（圖3（a）），這些基因功能富集之后主要涉及這些過程：代謝過程、碳水化合物代謝、氧化還原等過程（圖3（b））.嗜熱四膜蟲細胞密度在0 h時，細胞處于對數期前期，即營養狀態非常旺盛，細胞狀態非常良好的一個階段，24 h后細胞密度已接近于平臺期，這一過程中培養基中的營養物質不斷被消耗.因此，這個過程是營養相對豐富的狀態過渡到不豐富的狀態，細胞內基本生命過程（包括DNA復制和修復、細胞周期等）均處于下調的，而細胞定位及細胞組建過程加強，并可以通過細胞代謝過程為細胞提供能量.

通過實驗組24 h與0 h的轉錄組數據比較分析發現，差異表達基因共計7 596個，其中下調差異表達基因6 254個（圖3（a）），這些基因功能富集之后主要涉及這些過程：包括DNA復制和修復、基因轉錄、蛋白定位、蛋白折疊、蛋白轉運、有絲分裂、染色體分離、核分裂、生物大分子定位與組裝等（圖3（b））.其中上調差異表達基因1 342個（圖3（a）），這些基因功能富集之后主要涉及這些過程：代謝過程、碳水化合物代謝、氧化還原等過程（圖3（b））.實驗組基因功能富集的差異表明，細胞基本生命過程（包括DNA復制和修復等）也是處于下調的.此外，與有絲分裂M期調控過程、轉錄調控過程、細胞和蛋白運輸與定位、生物合成、信號轉導等過程也都處于下調.結果說明，在牛至精油作用下，培養基內的成分發生改變，營養處于更為匱乏的狀態，更多的生命過程受阻，細胞基本生命過程難以維持.因此，在牛至精油作用24 h后，嗜熱四膜蟲細胞的密度相對于沒有牛至精油作用下的密度是減少的.

2.3 牛至精油作用下嗜熱四膜蟲上下調基因過程分析

在對照組和實驗組差異表達基因的比較中，發現實驗組特異上調和下調差異表達基因分別有257個和2 329個（圖4（a））.GO富集分析僅發現特異下調差異表達基因的富集在RNA合成加工、蛋白質定位與運輸、蛋白質代謝、細胞定位和細胞內信號轉導等過程中（圖4（b）），特異上調的差異表達基因沒有功能富集.KEGG通路分析發現，特異下調差異表達基因主要涉及的代謝通路包括細胞自噬、溶酶體、PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路、細胞周期等（圖4（c）），而特異上調的差異表達基因主要涉及的代謝通路包括多種疾病，如神經退行性變的途徑、朊病毒疾病等.這些結果表明，牛至精油作用下，嗜熱四膜蟲基本生長過程受到影響，主要是由于細胞周期、細胞自噬等相關通路的基因表達水平下調，而與疾病通路相關的基因表達水平上調.因此，在牛至精油作用下，嗜熱四膜蟲細胞生長受到了抑制.

為了檢驗樣品轉錄組測序的準確性，7個差異表達下調基因和3個差異表達無明顯變化的基因進行了RT-qPCR驗證.差異表達下調基因包括AMPK信號通路關鍵基因AMPK及RAB2A，細胞自噬通路中的ATG1L1，ATG1L2和ATG3，DNA合成相關基因C-MYB和AURKA A.差異表達無明顯變化的基因包括細胞色素c相關基因CYT1，過氧化物酶相關基因CAT1及核糖體相關基因RPS12.結果顯示，RT-qPCR和RNA seq的倍數變化相關系數R2為92.32%，說明它們相關性高（圖5）.因此，本實驗牛至精油作用下嗜熱四膜蟲基因差異表達分析是可靠的.

3 討 論

牛至精油抑制了嗜熱四膜蟲細胞的生長，嗜熱四膜蟲的轉錄組分析發現牛至精油可能是影響了生長過程中的重要過程或通路，進而改變過程或通路上某些基因的表達變化導致細胞生長受到抑制.

已有研究表明，PI3K/AKT信號通路參與調控細胞增殖、生長等多個生物學過程，是非常重要的［20］.PI3K是磷脂酰肌醇3-激酶，可以接收不同受體傳遞的信號，發揮活性；而AKT也稱蛋白激酶B（protein kinase B，PKB），受PI3K蛋白直接調控［21］，進而通過磷酸化激活多種激酶（包括細胞周期蛋白激酶（cyclin dependent kinases，CDKs）、轉錄因子（包括C-MYB）等，進而調控細胞的生長［22］.CDKs細胞周期中的必需成分，也是關鍵的活化因子［23］.C-MYB是細胞核內的轉錄因子，與細胞增殖、分化密切相關［24］.AMP依賴的蛋白激酶AMPK通路是調節能量平衡一條關鍵通路［25-26］.在營養物質不足時，AMPK被激活，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體1（complex 1 of mammalian target of rapamycin，mTORC1）受到抑制，而mTORC1可通過激活核糖體S6蛋白激酶促進細胞增殖和蛋白質合成，激活自噬相關基因（autophagy-related gene，ATG）誘導細胞發生自噬，補充能量等［26］，因此該通路也是相當關鍵的.

根據不同通路上不同基因或者蛋白在起作用，并結合本實驗中的分析結果，繪制了牛至精油對嗜熱四膜蟲生長調控影響的模型：第1條通路可能是，牛至精油主要活性成分如酚類物質，通過結合膜蛋白上的某種受體或者通過改變細胞膜的通透性，直接進入細胞.當活性成分直接或者與細胞某受體作用進入細胞后，結合PI3K，改變AKT蛋白結構并使其活化，并以磷酸化作用于下游相關的因子，包括CDK的抑制分子p21和p27，抑制CDKs的表達，從而影響細胞周期的進程；IkB激酶（IKKα），抑制下游NF-κB表達，進一步抑制了C-MYB轉錄因子的表達，導致與DNA合成相關基因的表達受阻，使得細胞不能存活（圖6）.第2條通路可能是，牛至精油中酚類活性分子通過改變細胞膜通透性進入細胞，AMP量改變，從而激活AMPK.AMPK通過mTORC1復合物的去磷酸化抑制S6K，從而抑制細胞蛋白合成，導致細胞蛋白合成受阻，同時抑制細胞自噬復合體ATG1等相關基因的表達，使得細胞在低營養條件下不能維持自己的基本生存需要，使細胞數減少（圖6）.其中，2條通路中的一部分基因包括C-MYB，ATG1，AMPK等的表達水平變化，也進行了RT-qPCR驗證，結果與轉錄組測序結果一致，說明這些基因的表達變化在牛至精油的作用下明顯下調.

假設的2條通路說明，在牛至精油作用下，嗜熱四膜蟲細胞密度降低有以下幾方面原因：一是細胞周期過程受到抑制，主要是與細胞周期相關基因包括CDKs等，其表達水平下調，影響了細胞周期的過程，進而影響細胞復制和有絲分裂，使嗜熱四膜蟲細胞數目減少；二是抑制DNA合成過程，主要是與DNA合成相關基因C-MYB的表達下降，不能正常行駛轉錄的功能，進而影響下游基因的表達，使嗜熱四膜蟲不能正常的進行DNA合成；三是阻礙細胞蛋白質合成，主要影響了S6蛋白激酶的表達，影響細胞增殖，使細胞不能正常存活；四是影響了細胞自噬過程，主要自噬相關基因ATG1，ATG3等表達下調，使細胞無法在低營養的條件下繼續維持生存，進而導致細胞不能生長.

牛至精油影響細胞生長的分子調控和代謝通路等過程作用目前尚不清楚，而牛至精油的成分復雜，可能的作用方向較多，要深入研究的話，實驗對象最好一個完整的生命體.本研究中的嗜熱四膜蟲是一個單細胞真核模式生物，利用轉錄組數據分析的方法，從基因層面理解牛至精油影響嗜熱四膜蟲細胞生長的分子調控過程，這對研究牛至精油如何調控細胞的分子機理提供方向.

附 錄

附表見電子版（DOI：10.16366/j.cnki.1000-2367.2023.01.016）.

參 考 文 獻

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Effects of oregano essential oil on gene expression of Tetrahymena thermophila

Li Wenqiu1， Zhang Jing2， Luo Shuai2， Hu Che1， ChenYing1， MiaoWei2

（1. College of Life Science and Technology， Harbin Normal University， Harbin 150025， China; 2. Key Laboratory of Aquatic Biodiversity

and Conservation; Institute of Hydrobiology， Chinese Academy of Sciences， Wuhan 430072， China）

Abstract： Oregano Essential Oil（OEO）has the functions of antibacterial， bactericidal and inhibition of the parasite cells. In order to understand the molecular regulation mechanism of cells under OEO， the gene expression of Tetrahymena thermophila at 0 h and 24 h was analyzed in this study. Based on the anaysis of high-throughput transcriptome sequencing（RNA-seq）6 297 differentially expressed genes（DEGs）were identified in the control group in which there was no OEO at 0 h and 24 h， including 4 232 downregulated DEGs and 2 065 upregulated DEGs. And， 7 596 DEGs were identified in the experimental group in which OEO was added at 0 h and 24 h， including 6 254 downregulated DEGs and 1 342 upregulated DEGs. Compared to the control group， there were 257 specific upregulated DEGs and 2 329 specific downregulated DEGs in the experimental group. GO enrichment analysis showed that there was no function enriched among the specific upregulated DEGs and the process of RNA processing， protein catabolic process， cell localization and signal transduction were enriched among specific downregulated DEGs. According to KEGG analysis， downregulated DEGs were involved in autophagy and cell cycle pathway under OEO. The downregulated DEGs in these processes and pathways may inhibit cell growth. 7 downregulated DEGs and 3 unchanged genes in pathways were chosen to validate the expression differences by quantitative real time polymerase chain reaction（RT-qPCR）. RT-qPCR and RNA-seq were highly correlated to each other. Based on the analysis of relevant genes and pathways， the possible model of T. thermophila cells growth under OEO was analyzed. These provide clues to explore the molecular regulation mechanism under OEO.

Keywords： oregano essential oil; Tetrahymena thermophila; transcriptome; differentially expressed genes

［責任編校 劉洋 楊浦］

收稿日期：2022-01-12;修回日期：2022-02-09.

基金項目：國家自然科學基金（21976208）；武漢市應用基礎前沿項目（2019020701011483）.

作者簡介：李文秋（1997-），女，黑龍江雙鴨山人，哈爾濱師范大學碩士研究生，研究方向為原生動物學，E-mail：13339336600@163.com.

通信作者：繆煒，E-mail：miaowei@ihb.ac.cn. 張晶，E-mail：zhangjing@ihb.ac.cn.