棉花45SrDNA內轉錄間隔區的克隆與分析

摘 要：45S rDNA的內轉錄間隔區（Internal transcribed space，ITS）序列變異性強，是被廣泛應用于物種間進化關系研究的序列標簽.通過克隆艾克棉（Gossypium ekmanianum，AD6）、斯蒂芬斯棉（Gossypium stephensii，AD7）、異常棉（Gossypium anomalum，B1）、戴維遜氏棉（Gossypium davidsonii，D3-d）、克勞茨基棉（Gossypium klotzschianum，D3-k）、旱地棉（Gossypium aridum，D4）6個棉種的ITS序列，首次獲得新鑒定的2個四倍體棉種艾克棉和斯蒂芬斯棉的ITS區序列信息，補充了異常棉、克勞茨基棉和戴維遜氏棉3個棉種ITS區序列的未知堿基.基于ITS序列信息構建了涵蓋A，B，C，D，E，F，AD 7個基因組的棉屬系統發育樹，確定了新鑒定的2個四倍體棉種進化地位，探討了棉屬親緣關系.研究結果補充和完善了棉屬ITS序列信息，進一步明確了棉屬間的進化關系，為棉屬親緣關系分析提供參考.

關鍵詞：棉屬；ITS；45S rDNA；進化分析

中圖分類號：Q756文獻標志碼：A

棉屬（Gossypium）屬于錦葵科（Malvaceae）棉族（Gossypieae），包括8個二倍體基因組（A-G和K）和1個由A和D基因組祖先種雜交后加倍形成的異源四倍體基因組（AD）［1］.棉屬大約有50多個種，基因組多樣性較高，是植物分類、系統發育、基因組進化研究的重要物種［2］，棉屬的進化關系、異源四倍體棉種的供體種研究倍受重視.早期研究者根據染色體大小和種間雜交的染色體行為對棉屬的不同基因組進行界定［3-5］.近年來，基于更多的形態、生理、分子生物學證據，不斷有新種被挖掘和定名［6-9］，棉屬的分類體系也不斷完善.

真核生物中，核糖體DNA基因（ribosomal DNA，rDNA）包括5S rDNA和45S rDNA.其中45S rDNA是由18S rDNA，5.8S rDNA和28S rDNA串聯排列組成的重復單元，通過內轉錄間隔區（Internal transcribed space，ITS）和基因間隔區（Intergenic spacer，IGS）連接.ITS是由ITS1，ITS2和高度保守的5.8S rDNA外顯子共同組成的區域，其中ITS1和ITS2分別處在5.8S rDNA左右兩側，嵌入在18S和28S之間［10］.相對于保守性很高的核糖體DNA基因編碼區，ITS區進化速度快，序列變異豐富，已經成為種屬關系鑒別的重要分子標記.最早PORTER 和COLLINS基于ITS序列對蚊屬姊妹種Anopheles freeborni和Anopheles hermsi進行了種間差異的鑒別［11］.之后，利用ITS進行種群分化或系統發生生物地理學等方面的研究逐漸增加，涉及真菌［12］、藻類［13］、動物［14］、植物［15-16］等.在物種屬間、種間、甚至種內關系研究中發揮了重要作用.

不同研究者依據不同的研究方法對棉屬的進化關系提出了不同的見解.WENDEL和ALBERT根據葉綠體DNA（cpDNA）限制性位點數據，提出澳洲棉譜系（C，G和K基因組）是棉屬中最早分化出來的［17］.后來基于核糖體內部轉錄間隔區（nrITS）的序列數據分析，認為E基因組和C基因組是姐妹類群［18-19］.通過對NCBI收錄的棉屬ITS序列進行分析，發現部分棉種的ITS序列存在大量的未知堿基；同時，由于近年來新種的鑒定［6-9］，棉種的ITS序列信息有待進一步完善.本研究利用真核生物ITS序列通用引物，對候選棉種的ITS序列進行克隆分析并構建候選棉種的系統進化樹，為棉屬的進化與親緣關系提供科學依據與參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的材料由中國農業科學院棉花研究所野生棉課題組提供，包括棉屬的6個棉種：艾克棉（Gossypium ekmanianum，AD6）、斯蒂芬斯棉（Gossypium stephensii，AD7）、異常棉（Gossypium anomalum，B1）、戴維遜氏棉（Gossypium davidsonii，D3-d）、克勞茨基棉（Gossypium klotzschianum，D3-k）、旱地棉（Gossypium aridum，D4）；其他14個棉種及1個棉屬的近緣屬克氏擬似棉的ITS序列從NCBI數據庫下載，具體信息見附表Ⅰ.ITS通用引物是根據18S和28S序列的保守性設計的［19］，由上海生工生物公司合成.引物信息為：F/5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，R/5′-TCCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3′.

1.2 棉花DNA提取，ITS序列的PCR擴增、回收

用EZUP柱式植物基因組DNA提取試劑盒（生工生物）提取基因組DNA，經超微量分光光度計NanoDrop2000檢測濃度，質量分數為1%瓊脂糖凝膠電泳檢，-20 ℃保存備用.以候選棉種基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增體系為50 μL，其中包括2×Taq Master Mix 25 μL，10 μmol的正向和反向引物各0.8 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 22.4 μL.擴增條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循環30次，最后72 ℃ 10 min.質量分數為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物片段長度，選擇背景清晰，亮度適合的條帶，使用HiPure Gel Pure DNA Micro Kit（D2110-024）（Magen）回收ITS擴增片段.

1.3 目的片段的克隆及測序

回收產物用pEASY-Blunt Zero Cloning Kit（TransGen Biotech）連接，轉化到50 μL大腸桿菌Trans1-T1菌株感受態細胞，涂布于含有卡那霉素的LB培養基培養過夜，以ITS引物對生長菌落進行菌落PCR鑒定，確定陽性克隆.每個棉種隨機挑選5個陽性克隆送至上海生工生物公司測序.

1.4 系統發育分析

根據文獻測得序列用DNAMAN反復比對后去除兩端18S和26S的區域以及部分引物區刪除，獲得候選棉種的ITS區（ITS1，5.8S，ITS2）序列信息［20］.用克氏擬似棉屬的克氏擬似棉（Gossypioides kirkii）ITS序列作外類群，加上NCBI數據庫選擇的棉屬不同基因組的14個代表棉種的ITS序列，用MEGA-X軟件中的Alignment程序中的Clustal W對所有序列進行多重對位排列（Multiple alignments），用MEGA-X軟件包進行系統發育分析和進化樹的構建，用Maximum Composite Likelihood模型計算遺傳距離，所有對位排列結果中的空位（gaps）或缺失數據（Missing data）作成對刪除（Pairwise deletion）處理，進化距離分析采用鄰位相連法（NJ，Neighbor-joining）.系統樹的每個分支的統計學顯著性分析以Bootstrap進行檢驗，重復次數為1 000.

2 結果與分析

2.1 基因組DNA質量檢測結果

提取得到艾克棉、斯蒂芬斯棉、異常棉、戴維遜氏棉、克勞茨基棉和旱地棉的基因組DNA，通過NanoDrop2000進行了濃度檢測，質量濃度都在200 mg/L以上，A260/280也符合要求.通過瓊脂糖凝膠電泳進行長度檢測，電泳條帶清晰，沒有降解，能夠滿足后續實驗的需要（附圖1（a））.

2.2 ITS序列擴增、回收與測序

采用通用引物ITS（F+R）以6種候選棉種DNA為模板擴增目的片段，得到范圍在750～1 000 bp之間的PCR產物.分別切膠回收，膠回收的片段結果見附圖Ⅰ（b），與預期片段大小相符合.菌落PCR檢測結果見附圖Ⅰ（c）所示，大部分克隆為陽性，挑選部分片段長度與膠回收產物長度一致的陽性克隆，送上海生工生物有限公司測序.部分棉種測得的克隆序列長度為799～800 bp，符合PCR產物的片段長度，其中包括引物設計過程中涉及的部分18S rDNA和28S rDNA序列，以及ITS1，ITS2和5.8S rDNA的序列.

2.3 ITS序列組成

根據報道［20］，陽性克隆的測序序列去除18S rDNA的3′端和26S rDNA的5′端區域的堿基序列，保留ITS區域，即ITS1-5.8S-ITS2區域.結果顯示6個候選棉種的ITS區序列長度除了異常棉683 bp外，其他皆為682 bp（表1），長度符合被子植物ITS區500～750 bp的特征.序列比對表明，艾克棉和斯蒂芬斯棉序列一致（圖1），其他棉種間表現出明顯的堿基變異.

NCBI收錄的棉種ITS序列中存在不同數量的未知堿基，本實驗結果對序列信息進行了完善.如NCBI收錄的異常棉ITS區序列（序列號U56807）在368～401 bp為未知堿基，本測序結果顯示該區域的堿基為TATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGC（圖2（a））；克勞茨基棉（序列號U12728）的211 bp，214 bp和216 bp位置處分別存在一個未知堿基N，本測序結果在相對應的堿基分別是G，A，G堿基（圖2（b））；戴維遜氏棉（序列號U12729）的第211 bp，214 bp位置分別存在一個未知堿基N，本測序結果在相對應的堿基分別是G，A（圖2（c））.

2.4 棉屬ITS序列比較和系統發育分析

克隆得到的6個棉種的ITS區（ITS1，5.8S，ITS2）序列與NCBI下載的14個棉種的ITS序列一起，以棉屬近緣屬克氏擬似棉的ITS序列作為外族，利用MEGA-X軟件構建了涵蓋棉屬A，B，C，D，E，F和AD共7個基因組的NJ系統發育樹（圖3）.結果顯示，AD基因組的艾克棉（AD6）和斯蒂芬斯棉（AD7）和陸地棉（AD1）處于同一個小分支，三者的親緣關系較近，支持率達到了61%；海島棉（AD2）與達爾文氏棉（AD5）形成獨立小分支，親緣關系較近，支持率87%；D基因組中雷蒙德氏棉（D5）與異源四倍體陸地棉（AD1）、海島棉（AD2）、達爾文氏棉（AD5）、艾克棉（AD6）和斯蒂芬斯棉（AD7）距離最近，支持率達到75%；C基因組的斯特提棉（C1）與E基因組的司篤克氏棉（E1）在一個小分支，支持率為77%；D基因組的擬似棉（D6）與D基因組的其他棉種距離較遠，更接近A，B，F基因組棉種且支持率為99%；AD基因組的黃褐棉（AD4）與異源四倍體中其他棉種的距離較遠，與D基因組的擬似棉（D6）在一個分支，支持率99%，擬似棉有可能是四倍體黃褐棉的D亞組供體種.

3 討 論

棉屬的起源進化關系，尤其是異源四倍體棉種的供體種來源一直是棉花生物學基礎研究的關注點.關于A和D基因組中的哪些種是AD基因組的供體種，一直存在單系起源說［21］和多系起源說［22］.本研究中基于ITS序列構建的進化樹顯示了7個四倍體棉種與D基因組不同棉種的親緣關系，比較明顯的是雷蒙德氏棉（D5）與陸地棉（AD1）、海島棉（AD2）、達爾文氏棉（AD5）、艾克棉（AD6）和斯蒂芬斯棉（AD7）距離較近，處于一個大的分支，推測雷蒙德氏棉（D5）可能是上述四倍體棉種的供體種.進化分析顯示黃褐棉（AD4）與其他四倍體棉種距離較遠，支持了前人研究中關于黃褐棉是AD譜系中最早分支的唯一后代的觀點［23］.WU等［24］通過45S rDNA染色體定位分析，發現黃褐棉的3對45S rDNA位點全部分布在A亞基因組染色體上，而其他異源多倍體棉種的45S rDNA位點1對位于A亞基因組，2對位于D亞基因組，在以雷蒙德氏棉作為可能供體種的前提下上推測黃褐棉可能存在四倍體化過程中經歷了45S rDNA位點的丟失，即供體種D基因組45S rDNA位點的丟失，或者存在更復雜的動態進化.擬似棉也是已經完成FISH驗證的9個D基因組棉種中唯一一個45S rDNA位點數為2對的棉種，少于其他同基因組棉種，就重復DNA而言，擬似棉與不同于其他D基因組棉種，而更近似于A基因組棉種［25］.本研究中，D基因組的擬似棉與黃褐棉、A，B和F基因組在一個大分支，結合前人研究結果中兩個棉種在各自基因組內的特殊性，推測黃褐棉的D亞組供體種可能為擬似棉，進一步支持了多系起源的觀點.

A基因組中草棉（A1）和亞洲棉（A2）與異源四倍體棉種的距離較遠，進一步支持了比草棉和亞洲棉更早的阿非利加棉（A1-a）或者滅絕的A0作為四倍體棉種A亞組供體種的推論［26］.達爾文氏棉與海島棉在一個小分支.四倍體棉種中黃褐棉與陸地棉距離最遠.C基因組的斯特提棉與E基因組的司篤克氏棉在一個小分支，被認為是姐妹類群［19］.

艾克棉（AD6）和斯蒂芬斯棉（AD7）是近年基于更多的形態、生理、分子生物學證據，被鑒定的新種.之前的5個四倍體棉種中，毛棉主要分布于夏威夷及太平洋的其他群島，黃褐棉分布在巴西一塊很小的區域內，它是遺傳上距離陸地棉最遠的一個棉種.達爾文氏棉是海島棉的野生近緣種，主要分布在加拉帕戈斯群島，黃褐棉是四倍化形成之后最早分離出來的一個分支，與陸地棉親緣關系最遠［20］.本研究進化樹分析也支持了WENDEL等［21］關于四倍體棉種的進化關系：海島棉與達爾文氏棉形成獨立小分支，支持率87%；黃褐棉獨立于其他四倍體棉種之外.新種艾克棉和斯蒂芬斯棉與陸地棉聚到同一個分支，它們親緣關系較近，也說明了在明確為新種之前被認為是陸地棉的野生種系的原因［7，9］.

4 結 論

利用ITS通用引物成功獲得了6個棉種的ITS序列信息，基于序列比對分析，補充了前人相關研究中部分棉種ITS區序列的未知堿基，并首次完成新鑒定的兩個四倍體棉種AD6和AD7的ITS區序列信息，從而修正和完善了棉屬的ITS序列.在此基礎上構建了涵蓋了A，B，C，D，E，F，AD共7個基因組的棉屬系統發育樹.進化分析表明，新鑒定的兩個四倍體棉種與陸地棉有著較近的親緣關系；四倍體棉種的D亞組供體種有著不同來源，支持了多系起源的觀點.

附 錄

附表、圖見電子版（DOI：10.16366/j.cnki.1000-2367.2023.01.018）.

參 考 文 獻

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Evolution analysis of cotton based on 45S rDNA internal transcribed spacer

Liu Yuling1， Zhai Jingjing1，2， Li Yi1， Li Xingyan1， Zhao Zilin1， Zhang Shengwen1， Wei Yangyang1， Peng Renhai1，2

（1. School of Biology and Food Engineering， Anyang Institute of Technology， Anyang 455000， China; 2. School fo Life Science， Zhengzhou University， Zhengzhou 450001， China）

Abstract： The Internal transcribed space（ITS）sequence of 45S rDNA is highly variable and is a widely used as sequence barcode in the study of evolutionary relationships among species. In this study， the ITS sequences of 6 cotton species， Gossypium ekmanianum（AD6）， Gossypium stephensi（AD7）， Gossypium anomalum（B1）， Gossypium davidsonii（D3-d）， Gossypium klotzschianum（D3-k）， Gossypium aridum（D4） were cloned. The ITS sequences of two newly identified tetraploid cotton species， G. ekmanianum and G. stephensii， were obtained for the first time， and the unknown bases of ITS sequences of G. anomalum， G. davidsonii and G. klotzschianum were added. A phylogenetic tree of Gossypium was constructed based on ITS sequence information， which covers A， B， C， D， E， F and AD 7 genomes of Gossypium. The evolutionary status of the two newly identified tetraploid cotton species was determined， and the genetic relationship of cotton was discussed. The results of this study supplemented and perfected ITS sequence information of cotton， and further clarified the evolutionary relationship between the cotton， which will provide reference for phylogenetic analysis of cotton.

Keywords： Gossypium; ITS; 45S rDNA; evolutionary analysis

［責任編校 劉洋 楊浦］

收稿日期：2022-09-29;修回日期：2022-11-25.

基金項目：國家重點研發計劃項目（2018YFD0100300）；中原科技創新領軍人才（214200510029）；河南省教育科學“十四五”規劃一般課題（2021YB0283）.

作者簡介：劉玉玲（1972-），女，河南長垣人，安陽工學院副教授，博士，研究方向為細胞遺傳學，E-mail：liuylay2012@163.com.

通信作者：彭仁海，E-mail：aydxprh@163.com.