納米金/還原氧化石墨烯修飾的鹽酸環(huán)丙沙星分子印跡電化學傳感器

摘 要：以吡咯和鄰苯二胺為功能單體，以鹽酸環(huán)丙沙星為模板，在納米金和還原氧化石墨烯（AuNP/rGO）修飾的玻碳電極上，采用電化學方法制備分子印跡聚合物薄膜電化學傳感器.利用掃描電鏡對修飾電極表面形貌進行表征；電化學技術測試分子印跡傳感器性能.研究了納米金和還原氧化石墨烯用量對電極電化學性能的影響，并對傳感器制備和測試條件進行了優(yōu)化.在優(yōu)化條件下，分子印跡傳感器對鹽酸環(huán)丙沙星具有寬的線性檢測范圍（1.0×10-8～1.0×10-2 mol/L），低檢測限（7.41×10-12 mol/L（S/N=3）），選擇性高，穩(wěn)定性好.此外，該傳感器成功檢測出了實際藥品和牛奶樣品中的鹽酸環(huán)丙沙星.

關鍵詞：分子印跡；納米金顆粒；還原氧化石墨烯；鹽酸環(huán)丙沙星；電化學傳感器

中圖分類號：O657.1文獻標志碼：A

喹諾酮類藥物是一組人工合成的廣譜抗生素，可有效地抑制革蘭氏陽性和革蘭氏陰性有氧病原體引起的細菌感染.喹諾酮類藥物以細菌的脫氧核糖核酸（DNA）為靶，通過抑制DNA回旋酶作用，造成細菌DNA的不可逆損害，從而達到抗菌效果.鹽酸環(huán)丙沙星是喹諾酮類藥物中最重要的一種，廣泛用于治療尿道、呼吸道、胃腸道、眼部、皮膚感染，以及性傳染疾病［1-2］;鹽酸環(huán)丙沙星作為一種常規(guī)藥物還被用于動物疾病的防治.鹽酸環(huán)丙沙星的大量使用，導致其易在血液中殘留，而這種殘留會引起彎曲桿菌、沙門桿菌和大腸桿菌對鹽酸環(huán)丙沙星的耐藥性［3］.目前，已有多種技術方法用于鹽酸環(huán)丙沙星殘留的檢測，最常用的方法是高效液相色譜法，該方法與紫外、熒光及質譜聯用可對鹽酸環(huán)丙沙星殘留進行有效檢測［4-6］.與高效液相色譜法相比，電化學分析技術具有許多優(yōu)點，如方法簡單、成本低、省時、線性范圍廣、精度和準確度高等［7］.

分子印跡技術可以制備出在空間結構和鍵合作用上與模板分子完全匹配的分子識別位點［8］，從而提高傳感器的選擇性和專一識別能力.納米金具有導電性高、生物相容性好、電活性表面積大等獨特性能，成為非常有吸引力的生物傳感器材料；還原石墨烯具有大的比表面積和良好的生物相容性，具有電化學窗口寬、電子轉移速率快、電催化活性高等優(yōu)點，修飾到電極上可提高電極的比表面積，增強其導電性，進而顯著提高檢測信號和傳感器的靈敏度［9-13］.司凱萌等［9］利用電化學沉積技術將納米金粒子沉積在玻碳電極上，制備了葉酸電化學傳感器，提高了測定葉酸的靈敏度；通過部分電化學還原法［12］，將還原石墨烯對玻碳電極進行修飾，可得到用于測定苦參堿的傳感器，該方法具有較低的檢出限，較好重現性、再現性和準確度，并具有一定的抗干擾能力，為較低濃度的苦參堿的測定提供了技術參考.本文將納米金和還原石墨烯同時修飾到玻碳電極上，制備鹽酸環(huán)丙沙星分子印跡傳感器，以期改善傳感器的性能.

在納米金（AuNPs）和還原石墨烯（rGO）修飾過的玻碳電極上，以鹽酸環(huán)丙沙星（CPX）為分子模板，以吡咯（Py）和鄰苯二胺（OPD）為單體，通過電化學聚合方法得到鹽酸環(huán)丙沙星分子印跡電化學傳感器，利用方波伏安法（SWV）對傳感器的性能進行測試，傳感器具有選擇性好、靈敏度高、使用方便等優(yōu)點.

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

CH1660D 型電化學工作站（北京華科普天科技責任有限公司）；三電極系統：以232 型飽和甘汞電極（SCE）為參比電極，213 型鉑電極為對電極，直徑5 mm的玻碳電極為工作電極；SUPRA 40型場發(fā)射掃描電子顯微鏡（Carl Zeiss AG）.吡咯、鄰苯二胺和鹽酸環(huán)丙沙星均為阿拉丁試劑，吡咯使用前通過減壓蒸餾純化；氯金酸（AR，Alfa-Aesar），石墨（AR，深圳瀚輝石墨有限公司），其余試劑均為分析純，實驗用水為高純水.

1.2 玻碳電極的處理

將玻碳電極用0.05 μm的氧化鋁進行拋光，用高純水沖洗后超聲清洗5 min，再用無水乙醇沖洗，然后放入1 mol/L的H2SO4中激活，激活成功后取出清洗備用.

1.3 AuNPs/rGO的制備

AuNPs的制備：將50 mL二次水在圓底燒瓶中加熱并攪拌至微沸，取0.75 mL質量分數為2%的氯金酸溶液加入燒瓶，接著快速把5.4 mL的質量分數為1%的檸檬酸三鈉溶液加入其中，再加熱15 min后，關閉電源，繼續(xù)攪拌冷卻到室溫，放入4 ℃的冰箱中保存.

rGO的制備：石墨烯（GO）參照Hummer的方法［14］合成；將合成的GO進行還原，取20 mg的GO和200 mg的抗壞血酸，用10 mL的二次水溶解，25 ℃的溫度下放置5 h.殼聚糖（CS）用醋酸稀釋成0.05%（質量分數）溶液.將制得的CS與rGO按體積比1∶2的比例超聲混合10 min.

按照體積比為1∶1比例，取AuNPs溶液與CS和rGO的混合液超聲混合20 min，得到AuNPs/rGO混合液.

1.4 分子印跡電極的制備

將20 μL的AuNPs/rGO混合液均勻滴涂在玻碳電極表面，對電極進行修飾，室溫干燥后放入制備液中進行電化學聚合.制備液為溶解有Py，OPD和CPX的0.1 mol/L（pH=2.5～5.5）的醋酸緩沖溶液，溶液中Py和OPD復合單體的總濃度為20 mmol/L，CPX為模板分子，其濃度在3～20 mmol/L之間 .電化學聚合采用循環(huán)伏安（CV）法進行，其電勢掃描范圍是-0.1～1.2 V，掃描速度是50 mV/s，掃描循環(huán)次數為5～35次.

聚合完成后，將分子印跡聚合物（MIP）電極放入洗脫液中以除去模板分子，用水清洗后得到分子印跡電極.洗脫液是2 mol/L的NaOH溶液與無水乙醇按照體積比1∶3配制而成.非印跡聚合膜（NIP）在同樣的實驗條件下制備，只是溶液中不加入模板.

1.5 檢測方法

采用方波伏安法對傳感器性能進行檢測.檢測時以5 mmol/L 的K3［Fe（CN）6］溶液（含1 mol/L KCl）作探針溶液，掃描電位區(qū)間為-0.1～0.6 V，電位增量為5 mV/s，方波振幅為50 mV，方波頻率為20 Hz.

2 結果與討論

2.1 不同電極的掃描電鏡

不同電極的形貌如圖1所示.裸電極（圖1（a））表面光滑均勻平整，電極分別經AuNPs和rGO修飾后，表面分別覆蓋一層納米金微粒（圖1（b））和層狀結構的還原氧化石墨烯（圖1（c）），圖1（d）表明AuNPs和rGO同時修飾在了玻碳電極上，同時納米金微粒分散在層狀石墨烯的間隙里，增大了電極的表面積，為形成較多的印跡位點提供了條件.

2.2 分子印跡聚合膜的電化學聚合

以Py和OPD為復合單體，CPX為模板分子，在醋酸緩沖溶液中進行電化學聚合.電聚合循環(huán)伏安過程如圖2所示.可以看出，最初幾次循環(huán)的電流較大，這可能是由于電極通過修飾后表面積較大，有利于聚合反應的進行.隨循環(huán)次數的增加電流逐漸下降，說明絕緣的分子印跡聚合膜不斷形成.

2.3 電極的電化學表征

在三電極體系中用鐵氰化鉀作為分子探針，采用方波伏安法對不同電極的電化學性質進行表征，結果如圖3.可以看出納米金和還原氧化石墨烯修飾過的玻碳電極（a線）峰電流最大高于裸電極（b線），這一方面可能是因為經過修飾增大了電極表面積，另一方面納米金和還原氧化石墨烯都具有良好的導電性，提高了電極的導電能力.e線和f線表明，分子印跡和非印跡的聚合膜電極的峰電流均幾乎為零，表明聚合膜不具有導電性.印跡電極經洗脫后（c線）導電能力增強，表明經洗脫印跡電極釋放出印跡位點，探針分子能穿過印跡膜達到電極的表面產生響應電流；當印跡電極重新吸附模板分子后（d線）峰電流下降，這是因為模板分子占據了印跡位點，使得穿過聚合膜的探針分子減少.

2.4 制備條件的優(yōu)化

2.4.1 電極的修飾

用AuNPs/rGO復合材料對玻碳電極進行修飾，復合材料的用量對電極的性能會產生一定的影響.實驗采用滴涂的方法對電極進行修飾，考察了復合材料滴涂量對電極導電性的影響.圖4為復合材料用量不同時的電極峰電流.由圖4可知用AuNPs/rGO修飾電極能明顯提高電極的導電能力，當用量為25 μL時電極的峰電流最大；當用量過多時修飾材料會部分從電極上脫離從而使電極的導電性反而降低，因此實驗中采用25 μL的用量對電極進行修飾.

2.4.2 復合單體比例的優(yōu)化

為研究單體Py與OPD的比例對印跡效果影響，將CPX的濃度設定為0.01 mol/L，復合單體的總濃度為0.02 mol/L，制備了Py與OPD物質的量之比為2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4和純單體Py，OPD條件下的分子印跡電極，洗脫模板后用方波伏安法對印跡電極進行了檢測.結果表明（圖5），當Py與OPD的物質的量之比為1∶1時，印跡電極具有最高的峰電流，這可能是因為在此比例時形成的分子印跡位點最多、構型最穩(wěn)定，有利于電子的轉移.

2.4.3 制備液pH值的優(yōu)化

制備分子印跡傳感器的電聚合溶液由0.1 mol/L的醋酸緩沖溶液配置，溶液的pH值不僅影響功能單體的聚合，還會影響單體與模板分子的相互作用.實驗配置了pH值為2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5 的緩沖溶液，考察了制備液pH值對傳感器性能的影響，測定結果見圖6.由圖6可知，在pH值為3.5時峰電流達到最大，因此采用pH為3.5的緩沖溶液作為分子印跡傳感器的制備液.

2.4.4 模板分子與單體比例的優(yōu)化

模板分子與單體的比例是影響印跡聚合物中分子印跡位點數量的重要因素之一.保持Py和OPD的濃度為0.02 mol/L，配制不同模板CPX與單體的物質的量之比（分別為1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7）的制備液，電聚合完成后進行洗脫，用方波伏安法對制得的電極進行測量，結果如圖7所示.當模板分子較少時形成的印跡位點較少相應地峰電流較小，隨著模板分子的增加印跡位點逐漸增多，峰電流也逐漸增大；當模板與單體比例為1∶4時峰電流最大，表明此時形成的有效印跡位點最多；隨著模板比例繼續(xù)增大峰電流稍微有所下降，這可能是因為過多的模板分子影響了單體的聚合，使得有效印跡位點有所減少.

2.4.5 聚合時間的優(yōu)化

電聚合時間影響分子印跡膜的厚度，實驗中考察了循環(huán)伏安次數對分子印跡電極性能的影響.圖8為循環(huán)伏安次數不同時得到的分子印跡電極的峰電流.可以看出，當循環(huán)次數為25圈時電極峰電流最大，這是因為聚合時間過短形成的印跡位點太少，而聚合時間太長又會導致印跡膜太厚，模板不能充分洗脫，有效印跡位點下降.

2.4.6 洗脫時間與吸附時間的優(yōu)化

洗脫液為體積比為3∶1的無水乙醇與2 mol/L的氫氧化鈉溶液.將印跡電極浸泡于洗脫液中，每5 min取出進行測量，結果（圖9）表明當15 min后峰電流達到穩(wěn)定，為了確保模板分子從印跡位點充分移除，洗脫時間采用20 min.

配制5 mmol/L的CPX溶液，將印跡電極放入到所配制溶液中，每5 min測試一次，結果（圖10）表明25 min后電極峰電流達到穩(wěn)定，說明此時吸附已達平衡，為了確保吸附達到平衡，實驗中采用的吸附時間為30 min.

2.5 分子印跡傳感器的性能表征

2.5.1 電化學性能表征

將優(yōu)化條件下制備的傳感器浸入到不同濃度的CPX溶液中30 min以上，吸附達到平衡后將傳感器取出進行方波伏安測試.圖11插圖是測量結果，可以看出隨吸附液CPX的濃度增大峰電流逐漸減小，這是因為CPX的濃度增大，有較多的印跡位點被占據只能有較少的探針分子穿過印跡薄膜.圖11是峰電流差（CPX濃度為0時的峰電流值與濃度為C時的峰電流值之差）與吸附液濃度對數的關系.可以看出在1.0×10-8～1.0×10-2 mol/L濃度范圍內，峰電流差與濃度的對數呈良好的線性關系，其線性回歸方程為ΔI/A=0.121 33lg （C/mol·L-1）+1.362 44，相關系數為R=0.999 6.最低檢出限LOD為7.41×10-12 mol/L（S/N=3）.與文獻報道的結果相比（表1），該分子印跡電化學傳感器具有較寬的線性測量范圍和更低的檢測限.

2.5.2 選擇性和穩(wěn)定性

實驗選擇與環(huán)丙沙星分子結構類似的分子如恩諾沙星（ENR）、氯霉素（CHL）、諾氟沙星（NFX）和四環(huán)素（TC）作為干擾物，來測定鹽酸環(huán)丙沙星分子印跡傳感器的特異選擇性.將優(yōu)化條件下制備的鹽酸環(huán)丙沙星分子印跡傳感器和非印跡傳感器浸入5 mmol/L的CPX，ENR，CHL，NFX，TC的0.1 mmol/L的醋酸溶液中30 min，然后用方波伏安法進行測試，結果如圖12所示.由圖12（a）可以看出，復合功能單體非印跡電極對所有物質均有少量吸附并且不同物質的吸附量相差不大，這種少量的吸附主要源于非印跡薄膜對被測量分子的物理性吸附；但是，復合功能單體印跡電極對CPX吸附量較大而對干擾物吸附量較少，這是因為印跡薄膜上印跡位點對CPX具有特異識別能力產生了特異吸附，選擇性因子（分子印跡電極吸附檢測物導致的峰電流下降值與非印跡電極吸附同樣檢測物導致的峰電流下降值的比值）為8.56；由圖12（b）和12（c）可以得到單一功能單體Py或OPD分子印跡電極的選擇性因子分別為4.67和4.05.上述結果表明，復合功能單體的CPX分子印跡傳感器比單一功能單體具有更好的選擇性.

將同一支分子印跡傳感器浸入到相同濃度的CPX溶液（5 mmol/L）中，30 min后取出用方波伏安法進行測試.前5 d每天測試一次，以后每5 d測試一次，至40 d時，測試結果保持初時的92%，說明印跡傳感器性能穩(wěn)定，有較長的使用壽命.

2.6 實際樣品分析

本工作對市面上的鹽酸環(huán)丙沙星藥物及牛奶產品中鹽酸環(huán)丙沙星含量進行了分析.從藥店購買幾種不同品牌的鹽酸環(huán)丙沙星，將藥片進行研磨后分別用0.1 mol/L的醋酸緩沖溶液（pH=3.5）配制成0.1 mol/L的溶液，取上清液稀釋至1.0×10-5 mol/L進行測試，各個樣品平行測試3次，結果如表2所示.從表2中可知測定值與標示量非常接近，該傳感器可用于實際藥物中鹽酸環(huán)丙沙星的檢測.

將購買的純牛奶與0.1 mol/L的醋酸緩沖溶液以體積比2∶7的比例混合，超聲5 min，然后在8 000轉速下離心10 min，取上清液作為牛奶測試樣品.取出3份20 mL上述牛奶樣品，分別加入1.0×10-2 mol/L，1.0×10-5 mol/L，1.0×10-8 mol/L的鹽酸環(huán)丙沙星標準溶液，然后用制備的分子印跡傳感器進行測試，每份樣品平行測定3次，結果如表3所示.從表3中可知，加標回收率在89.8%～97.4%之間，RSD為1.14%～1.53%，說明該傳感器可用于牛奶樣品中CPX殘留的檢測.

3 結 論

本研究利用復合材料納米金溶膠和還原氧化石墨烯修飾玻碳電極，以吡咯和鄰苯二胺為復合單體制備了鹽酸環(huán)丙沙星分子印跡電化學傳感器.在優(yōu)化條件下，得到的傳感器表現出良好的分析性能，該傳感器不僅線性響應范圍較寬、檢出限低，而且重現性好、選擇性和穩(wěn)定性較高，可以用于實際樣品中鹽酸環(huán)丙沙星的超痕量檢測.

參 考 文 獻

［1］ "RADIOV M，BEHU＇L M，MARTON M，et al.Heavily boron doped diamond electrodes for ultra sensitive determination of ciprofloxacin in human urine［J］.Electroanalysis，2017，29（6）：1612-1617.

［2］RANI R，DEEP A，MIZAIKOFF B，et al.Copper based organic framework modified electrosensor for selective and sensitive detection of ciprofloxacin［J］.Electroanalysis，2020，32（11）：2442-2451.

［3］SHAN J，LIU Y，LI R Z，et al.Indirect electrochemical determination of ciprofloxacin by anodic stripping voltammetry of Cd（II）on graphene-modified electrode［J］.Journal of Electroanalytical Chemistry，2015，738：123-129.

［4］劉永明，劉振波，徐淑周.分子印跡-后化學發(fā)光法測定鹽酸環(huán)丙沙星［J］.分析試驗室，2009，28（3）：47-50.

LIU Y M，LIU Z B，XU S Z.A molecular imprinting-chemiluminescence method for deternination of ciprofloxacin hydrochloride［J］.Chinese Journal of Analysis Laboratory，2009，28（3）：47-50.

［5］叢俏，宋相孟，秦洪偉.聚甲基紅膜修飾電極電化學檢測鹽酸環(huán)丙沙星［J］.應用化工，2017，46（3）：592-596.

CONG Q，SONG X M，QIN H W.Electrochemical detection of ciprofloxacin hydrochloride by poly methyl red film modified electrode［J］.Applied Chemical Industry，2017，46（3）：592-596.

［6］PHAM T S H，MAHON P J，LAI G S，et al.Reduced graphene oxide nanocomposite modified electrodes for sensitive detection of ciprofloxacin［J］.Electroanalysis，2018，30（9）：2185-2194.

［7］NI Y N，WANG Y R，KOKOT S.Simultaneous determination of three fluoroquinolones by linear sweep stripping voltammetry with the aid of chemometrics［J］.Talanta，2006，69（1）：216-225.

［8］朱桂芬，程國浩，李世穎，等.2，4，6-三氯苯酚磁性印跡聚合物在食品分析中的應用［J］.河南師范大學學報（自然科學版），2020，48（5）：55-63.

ZHU G F，CHENG G H，LI S Y，et al.Preparation of 2，4，6-trichlorophenol magnetic surface imprinted polymer and the application in food samples［J］.Journal of Henan Normal University（Natural Science Edition），2020，48（5）：55-63.

［9］司凱萌，張曉靜，彭友元.基于納米金-多壁碳納米管增敏的分子印跡電化學傳感器測定葉酸［J］.化學研究與應用，2020，32（12）：2158-2164.

SI K M，ZHANG X J，PENG Y Y.A sensitive molecularly imprinted sensor for folic acid based on molecularly imprinted poly（o-phenylenediamine）and gold nanoparticles/multiwalled carbon nanotubes［J］.Chemical Research and Application，2020，32（12）：2158-2164.

［10］張盼，曾冬冬，賈冬玲，等.基于納米金的分子印跡傳感器檢測果蔬中的氧化樂果和樂果［J］.分析試驗室，2021，40（2）：169-173.

ZHANG P，ZENG D D，JIA D L，et al.Detection of dimethoate and omethoate in fruits and vegetables based on nanogold molecular imprinting sensor［J］.Chinese Journal of Analysis Laboratory，2021，40（2）：169-173.

［11］馬靜，金葆康.納米金生物傳感器的制備及其在汞離子檢測中應用［J］.安徽大學學報（自然科學版），2021，45（4）：79-87.

MA J，JIN B K.Preparation of gold nanoparticles biosensors and the application in mercury（Ⅱ）ions detection［J］.Journal of Anhui University（Natural Science Edition），2021，45（4）：79-87.

［12］陶菡，黃銳，劉豐，等.部分電化學還原氧化石墨烯修飾玻碳電極用于苦參堿的測定［J］.理化檢驗-化學分冊，2021，57（6）：481-486.

TAO H，HUANG R，LIU F，et al.Determination of matrine by glassy carbon electrode modified with partially electrochemical reduced graphene oxide［J］.Physical Testing and Chemical Analysis（Part B：Chemical Analysis），2021，57（6）：481-486.

［13］秦洪偉，連爽，劉妍，等.電還原氧化石墨烯/多壁碳納米管復合修飾電極檢測萘普生［J］.化學研究與應用，2021，33（6）：1044-1050.

QIN H W，LIAN S，LIU Y，et al.Determination of Naproxen by reduced graphene oxide/multi-wall carbon nanotubes composite modified electrode［J］.Chemical Research and Application，2021，33（6）：1044-1050.

［14］PAN Z H，LIU M N，YANG J，et al.High electroactive material loading on a carbon Nanotube@3D graphene aerogel for high-performance flexible all-solid-state asymmetric supercapacitors［J］.Advanced Functional Materials，2017，27（27）：1701122.

［15］CHAUDHARY N，VERMA D，GOPAL SHARMA J，et al.A novel bioinspired carbon quantum dots based optical sensor for ciprofloxacin detection［J］.Materials Letters，2022，308：131090.

［16］POLLAP A，BARAN K，KUSZEWSKA N，et al.Electrochemical sensing of ciprofloxacin and paracetamol in environmental water using titanium Sol based sensor［J］.Journal of Electroanalytical Chemistry，2020，878：114574.

［17］REDDY K R，BRAHMAN P K，SURESH L.Fabrication of high performance disposable screen printed electrochemical sensor for ciprofloxacin sensing in biological samples［J］.Measurement，2018，127：175-186.

An electrochemical sensor modified by AuNP/rGO based on the molecularly imprinting of ciprofloxacin

Yan Changlinga， Wang Gongkeb， Zhang Ruixinga

（a. School of Chemistry and Chemical Engineering; b. School of Materials Science and Engineering， Henan Normal University， Xinxiang 453007， China）

Abstract： An electrochemical sensor was prepared through electrochemical polymerization of a molecularly imprinted polymers（MIPs）film onto a glass carbon electrode（GCE）modified by AuNP/rGO， using pyrrole and o-phenylenediamine as functional monomer， ciprofloxacin as template molecule. The surface morphology of the electrodes modified by AuNP/rGO was characterized by scanning electron microscopy. The performance of the molecularly imprinted sensor was detected with electrochemical technique. The influence of quantity of AgNP/rGO on electrochemical property of the sensor was researched and conditions for preparation and detection of the sensor were optimized. Under the optimum conditions， the molecularly imprinted sensor presented a wide linear detection range（1.0×10-8 to 1.0×10-2 mol/L）， a low detection limit（7.41×10-12 mol/L（S/N=3））， high selectivity and good stability for ciprofloxacin. In addition， the sensor has been successfully applied to determine ciprofloxacin in real medicine and milk.

Keywords： molecular imprinting; nano-gold particles; reduced graphene oxide; ciprofloxacin; electrochemical sensor

［責任編校 趙曉華 陳留院］

收稿日期：2021-12-16;修回日期：2022-02-28.

基金項目：國家自然科學基金（21973028）.

作者簡介（通信作者）：

閆長領（1965-），男，河南清豐人，河南師范大學副教授，博士，研究方向為電化學傳感器，E-mail：yanchangling@163.com.