咪唑類物質KK-42對日本沼蝦表皮礦化的影響

摘 要：甲殼動物為了生長必須周期性地褪去舊表皮，新表皮的形成及礦化與蛻皮周期密切相關.前期研究發現，KK-42能夠縮短日本沼蝦蛻皮周期、加速表皮的形成.為了進一步探究KK-42對表皮礦化的影響，以礦化相對穩定的蛻皮間期（C期）頭胸甲表皮為參照，選擇蛻皮后3，6，12 h的頭胸甲，采用掃描電鏡/能譜儀法（SEM/EDX），在超微水平初步研究了表皮的礦化進程及KK-42處理對表皮礦化的影響.結果顯示，對照組頭胸甲表皮中鈣、鎂、磷信號在蛻皮后3 h 開始出現，6 h鈣、磷信號在上/外表皮的邊緣處密集分布，此后逐漸向表皮內側延伸.鎂信號一直呈彌散狀分布.半定量數據分析顯示，與蛻皮后3 h相比，6，12 h及C期表皮中，鈣原子比例分別提高了67.86%（P＜0.01），402.78%（P＜0.01），2 191.67%（P＜0.01）；鎂原子比例分別提高了95.92%（P＜0.05），122.45%（P＜0.05），165.31（P＜0.05）；磷原子比例分別提高了82.46%（P＜0.05），205.26%（P＜0.01），591.23（P＜0.01）.在KK-42處理組，蛻皮后3，6，12 h，表皮中的鈣、磷信號分布一直呈離散狀，鈣原子比例分別比對照組降低了16.67%（P＞0.05），45.54%（P＜0.05），52.5%（P＜0.01），磷原子比例分別比對照組降低了15.79%（P＞0.05），45.19%（P＜0.05），50%（P＜0.01）；C期表皮中的鈣、磷信號出現密集現象，但信號強度比相應對照組分別低31.88%（P＜0.01）和5.08%（P＞0.05）.KK-42處理后鎂信號的分布和強度與對照組均無明顯差異.結果表明：日本沼蝦表皮的礦化始于蛻皮后3 h，KK-42處理能明顯抑制日本沼蝦頭胸甲表皮的礦化，表皮中鈣、磷的沉積顯著降低.

關鍵詞：日本沼蝦；表皮；掃描電鏡/能譜儀法；礦化；KK-42

中圖分類號：S917文獻標志碼：A

甲殼動物被覆堅硬的表皮，來維持身體結構和防御天敵.甲殼動物表皮是生物礦物典型代表，由外向內分為3層：上表皮、外表皮和內表皮.上表皮主要由脂類和蛋白質構成，而外表皮和內表皮由幾丁質-蛋白質微纖維網架構成，礦化的主要成分是碳酸鈣，以結晶方解石或無定形碳酸鈣的形式存在，鎂和磷的含量較低［1-2］.為了生長甲殼動物必須周期性地替換表皮［3］，因此，蛻皮周期和表皮的形成及礦化有密切的關系［4］.在蛻皮前期，原有舊表皮下形成新的上表皮和未礦化的新外表皮，舊表皮中一部分碳酸鈣被重吸收；在蛻皮后期，內表皮形成的同時內、外表皮起始礦化［5］；間期表皮發育完全，高度礦化.如此周而復始，從而完成其生長發育.雖然礦化是從蛻皮后期開始，對于不同甲殼動物礦化起始的確切時間和礦化進程的報道尚未多見，且對于礦化的研究多集中于體型較大的甲殼動物，如美洲螯龍蝦（Homarus americanus）、克氏原鰲蝦（Procambarus clarkii）、藍蟹（Callinectes sapidus）［6-7］，而關于體型較小的日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）等甲殼動物的表皮礦化研究報道較少.

KK-42（1-苯甲基-5-［反-2，6-二甲基-1，5-庚二烯］咪唑）常被用作昆蟲生長調節劑［8］，而甲殼動物的發育與昆蟲具有相似性.前期研究表明，KK-42能夠縮短日本沼蝦蛻皮周期［9］以及加速表皮的形成［10］，為了進一步探究KK-42對表皮礦化的影響，本文選取蛻皮后以及礦化相對穩定的蛻皮間期（C期）的日本沼蝦，首次采用石蠟切片的掃描電鏡（SEM）觀察方法［11］和X-射線光電子能譜（EDX）分析，在超微水平研究KK-42對表皮礦化的影響，旨在為闡明KK-42縮短蛻皮周期、加速表皮形成的機制提供理論支持.

1 實驗方法

1.1 材料及實驗動物處理

選取健康日本沼蝦（河南原陽黃寺漁場提供）幼蝦（體長2.0～2.5 cm），飼養于水族箱中，水溫（25±1）℃，每日早晚各投喂1次，1周后用于實驗研究.

文獻［12］的方法鑒定蛻皮周期.選取處于蛻皮前晚期的健康日本沼蝦，逐只放于水族箱的網格中，每2 h觀察一次.蛻皮后立即進行如下處理：12只蛻皮后立即用1.95×10-4 mol/L的KK-42溶液浸泡1 min［9］后迅速取出，為處理組；12只蛻皮后立即用不含KK-42的溶液浸泡1 min后取出，為對照組.兩組處理后繼續于水族箱的網格中單獨飼養，分別于蛻皮后3，6，12 h及進入C期時（蛻皮后2 d）取鰓區頭胸甲用于表皮礦化的研究.每組每個時間點取3只.

1.2 掃描電鏡觀察及能量色散X-射線（EDAX）分析

將鰓區頭胸甲剪成4～6 mm 的小塊，Davidson's fixative（DF）固定液［13］于4 ℃固定24 h，流水沖洗1 h，系列酒精脫水，正丁醇過夜透明，石蠟包埋，Leica切片機（德國Leica，RM2245）上行橫切和矢狀切，切片厚6 μm，將蠟片貼于14 mm×14 mm 蓋玻片上烘干，經60 ℃二甲苯脫蠟3 d，更換3次二甲苯，將含材料的蓋玻片貼于場發射掃描電鏡（蔡司，SUPPA 40）用的樣品臺上，離子濺射儀（中科科儀，SBC-12）鍍膜噴金后，用掃描電鏡觀察、拍攝并編號保存.將采集到的照片導入能譜分析軟件（OXFORD INSTRCMENTS，X-MAX20），選擇分辨率后進行面掃，采集時間為300 s，采集后對結果進行分析.本次實驗使用的標準樣品為：Ca Wollastonite"" 1-Jun-1999 12：00 AM；Mg" MgO" 1-Jun-1999 12：00 AM；P" GaP" 1-Jun-1999 12：00 AM.

1.3 統計學方法

采用SPSS統計軟件中單因素方差（ANOVA）和Ducan檢驗法進行統計學分析，其中P＜0.05表示顯著性差異，P＜0.01表示極顯著差異.

2 結 果

2.1 日本沼蝦頭胸甲表皮的礦化進程

蛻皮后3 h，鈣信號已在上表皮和外表皮均勻分布，但較為稀疏（圖1（a））；蛻皮后6 h，鈣信號在上表皮和外表皮的交界處密集分布（圖1（a）），提示表皮礦化速率加快；至12 h，上、外表皮交界處密集分布的鈣信號區域增厚，并向外表皮內側的方向延伸（圖1（a））；進入C期時，鈣信號密集分布于頭胸甲表皮的各層，外表皮中鈣信號尤為強烈（圖1（a））.鎂信號在蛻皮后期及C期始終呈彌散狀分布，而磷信號分布模式與鈣信號相同（圖1（a））.半定量數據分析支持能譜元素分布圖的觀察結果（圖2）.與蛻皮后3 h相比， 6，12 h及C期表皮中鈣、鎂、磷原子比例均相應增加，其中，鈣原子比例分別提高了67.86%（P＞0.01），402.78%（P＜0.01），2191.67%（P＜0.01）（圖2（a）），鎂原子比例分別提高了95.92%（P＜0.05），122.45%（P＜0.05），165.31（P＜0.05）（圖2（b）），磷原子比例分別提高了82.46%（P＜0.05），205.26%（P＜0.01），591.23%（P＜0.01）（圖2（c）），表明表皮中鈣、鎂、磷含量逐漸增多，表皮逐漸礦化.

2.2 KK-42對頭胸甲表皮礦化的影響

SEM觀察結果顯示，處理組頭胸甲表皮在厚度、板層結構及層數、板層中孔道形狀方面與對照組均無明顯差異，但鈣、磷信號的分布和強度與對照組相比有明顯差異.蛻皮后3～12 h，頭胸甲表皮中的鈣、磷信號一直呈離散狀分布，表明礦化程度較低（圖1（b）），鈣原子比例分別比對照組降低了16.67%（P＞0.05），45.54%（P＜0.05），52.5%（P＜0.01），磷原子比例分別比對照組降低了15.79%（P＞0.05），45.19%（P＜0.05），50%（P＜0.01）；C期鈣、磷信號在內、外表皮密集分布，但鈣、磷信號強度比相應的對照組低31.88%（P＜0.01）（圖2（a））和5.08%（P＞0.05）（圖2（c））.KK-42處理后鎂信號的分布和強度與對照組均無明顯差異.結果顯示KK-42處理能抑制日本沼蝦蛻皮后頭胸甲表皮的礦化.

3 討 論

快速發展的電鏡能譜技術能夠測試元素周期表中幾乎所有的元素，并能給出所測元素的濃度值，元素含量分析誤差小于5%［14］，因此采用該方法檢測日本沼蝦表皮中鈣元素含量，以此來分析表皮礦化進程.

礦化是甲殼動物表皮獨有的特征，其過程受到嚴謹的時空調節：表皮礦化的空間調節最典型的例證是甲殼動物身體的不同部位礦化程度不同；礦化必定是從動物脫去舊表皮后開始，這是表皮礦化時序性調節的典型例證.不同甲殼動物表皮礦化的時程差異較大，如藍蟹（C. sapidus）表皮在蛻皮后3 h即沿著上表皮/外表皮邊界出現密集鈣信號，并向逐漸外表皮內側延伸［15］.而本研究發現日本沼蝦在蛻皮后6 h，上/外表皮的邊緣處才開始出現密集鈣信號（圖1（a））.在甲殼動物表皮中，磷酸鹽的主要作用是與無定形碳酸鈣共沉淀以穩定其結構［16］.本研究發現蛻皮后日本沼蝦表皮中磷元素的分布及含量變化趨勢與鈣元素相同，進一步驗證了此觀點.

甲殼動物表皮中大部分成分是無機物，主要是碳酸鈣，一小部分是有機物，主要是幾丁質、蛋白質等有機基質，通常認為有機基質特別是蛋白質可以調節生物礦物的沉積［3］.表皮中的蛋白質種類較多，其中分布最廣泛且與表皮厚度、蛻皮周期關系最為密切的蛋白質，因能與幾丁質結合構成表皮結構支架，所以被稱為幾丁質結合蛋白（Chtin-Binding Proteins，CBPs），由表皮上皮細胞合成并分泌進入表皮，參與新表皮的形成［17］.迄今為止，已經在甲殼動物表皮中鑒定出多種與礦化相關的幾丁質結合蛋白，如在克氏原鰲蝦表皮中純化出含65個氨基酸殘基的鈣化相關肽-2（calcification-associated peptide，CAP-2）［4］，CAP-2基因主要在蛻皮后期表達，該蛋白在體外能與幾丁質結合，并且具有抑制碳酸鈣沉積的能力，因此推測CAP-2可能作為表皮鈣化過程的成核劑；日本對蝦表皮中的crustocalcin（CCN）［18］蛋白能通過誘導成核促進表皮中碳酸鈣晶體的形成，其mRNA主要表達于蛻皮后期.這些研究表明蛻皮后期表皮中的幾丁質結合蛋白能控制表皮的鈣化.本研究結果顯示，KK-42處理導致日本沼蝦頭胸甲表皮礦化時程的延遲和礦化程度的減弱，這可能與KK-42處理能顯著抑制某些CBPs基因在蛻皮后期表皮中的表達有關［19］，具體機制尚待進一步研究.

參 考 文 獻

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Effect of imidazole derivative KK-42 on mineralization of the cuticle in Macrobrachium nipponense

Du Juan， Zhang Junfang， Yue Kaidi， Peng Yanxin， Yang Hong， Ning Qianji

（College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， China）

Abstract： Crustaceans have to replace the old cuticle periodically to permit their growth， thus the molt cycle is closely related to the formation and mineralization of the new cuticle. In previous studies we found that KK-42 treatment could shorten molt cycle and accelerate the formation of the cuticle in Macrobrachium nipponense. To explore the possible mechanism of KK-42， carapaces at 3， 6 and 12 h were employed to investigate calcification of cuticle and the effect of KK-42 treatment on calcification at ultrastructural level using the observation of paraffin section by scanning electron microscope-energy dispersive spectrometer （SEM-EDS） with reference of carapaces at intermolt（C stage）during which mineralization of the cuticle is relatively stable. The results showed that calcium magnesium and phosphorous signals began to appear in the cuticle at 3 h after ecdysis. Calcium and phosphorous signals became dense and extended from the epicuticle/exocuticle boundary to the inner side of cuticle in control group at 6 h after ecdysis. Magnesium signals were dispersively distributed. Semi-quantitative data analysis showed that， compared with control group of 3 h after ecdysis， at 6， 12 h after molting and C stage， atomic percent of calcium increased by 67.86%（P＜0.01）， 402.78%（P＜0.01） and 2 191.67%（P＜0.01） respectively， atomic percent of magnesium increased by 95.92%（P＜0.05）， 122.45%（P＜0.05）， 165.31（P＜0.05） respectively， atomic percent of phosphorous improved by 82.46%（P＜0.05）， 205.26%（P＜0.01）， 591.23（P＜0.01） respectively. In KK-42 treatment group， the distribution of calcium and phosphorous signals in cuticle was discrete during 3， 6， 12 h after ecdysis. Compared with the corresponding control group， atomic percent of calcium decreased by 16.67%（P＞0.05）， 45.54%（P＜0.05） and 52.5%（P＜0.01） respectively， atomic percent of magnesium decreased by 15.79%（P＞0.05）， 45.19%（P＜0.05）， 50%（P＜0.01） respectively. Calcium and magnesium signals were dense until C stage， but the signal intensity was 31.88%（P＜0.01） and 5.08%（P＞0.05） lower than that in control group respectively. No significant difference in the distribution and intensity of magnesium signals was observed between the control and treatment group. The results indicated that mineralization of cuticle in M. nipponense started in 3 h after molt， and KK-42 treatment could significantly inhibit the mineralization of carapace cuticle， for deposition of calcium and phosphorous in the cuticle decreased significantly.

Keywords： Macrobrachium nipponense; the cuticle; SEM-EDS; mineralization; KK-42

［責任編校 劉洋 楊浦］

收稿日期：2021-09-15;修回日期：2022-11-05.

基金項目：國家自然科學基金（31873047）；河南省自然科學基金（182300410033）.

作者簡介：杜娟（1980-），女，安徽淮南人，河南師范大學博士生，研究方向為動物生理，E-mail：dujuan0313@126.com.

通信作者：寧黔冀，E-mail：nqjnqj1964@163.com.