馬鈴薯植株再生和遺傳轉化技術研究進展

摘" 要：高效的馬鈴薯植株再生和轉化體系是開展馬鈴薯轉基因和基因編輯育種的關鍵技術之一。該文從馬鈴薯基因型、外植體類型、培養(yǎng)基和激素、農桿菌濃度、共轉化條件及其他因素等對影響馬鈴薯植株再生體系和轉化技術體系的影響因素進行綜述，為相關的研究提供參考。

關鍵詞：馬鈴薯；再生體系；愈傷組織；遺傳轉化；農桿菌

中圖分類號：S532" " " " 文獻標志碼：A" " " " " 文章編號：2096-9902（2023）09-0012-04

Abstract： Efficient potato plant regeneration and transformation system is one of the key technologies for transgenic and gene editing breeding of potatoes. In this paper， the factors affecting potato plant regeneration system and transformation technology system were reviewed from potato genotype， explant type， medium， hormone， concentration of agrobacterium， co-transformation conditions and other factors， so as to provide reference for related research.

Keywords： potato; regeneration system; callus; genetic transformation; agrobacterium

馬鈴薯是繼水稻、小麥和玉米之后的第四大糧食作物，在保障國家糧食安全方面具有重要的作用。馬鈴薯是四倍體作物，基因組構成十分復雜，采用傳統(tǒng)育種方法對馬鈴薯品種進行遺傳改良周期較長，成效不明顯。隨著植物基因編輯技術的發(fā)展，利用基因編輯技術對馬鈴薯進行遺傳改良成為可能，而建立高效穩(wěn)定的馬鈴薯植株再生和遺傳轉化體系是利用基因編輯技術開展馬鈴薯育種的基礎[1]。目前，已被廣泛采用的植物轉基因技術有農桿菌轉化法、基因槍法、花粉通道法、顯微注射法及離子束介導法等[2]。在馬鈴薯遺傳轉化中以農桿菌轉化法作為最主要的手段。

自1983年首例馬鈴薯轉化獲得成功的報道發(fā)布以來，國內外學者對馬鈴薯的再生和遺傳轉化技術進行深入的研究，并取得了一定的進展，但迄今已報道的許多馬鈴薯遺傳轉化體系均具有相對的獨立性，其轉化的頻率仍然受到基因型、外植體類型、培養(yǎng)條件和轉化過程中的許多因素的影響[3-11]。本文在總結和分析前人研究的基礎上，對馬鈴薯的植株再生和遺傳轉化技術體系的研究進展進行綜述，為后續(xù)研究者開展類似的研究提供借鑒。

1" 馬鈴薯植株再生體系影響因素

1.1" 基因型與外植體類型

利用農桿菌對馬鈴薯進行遺傳轉化的前提是建立穩(wěn)定的植株再生體系。馬鈴薯植株再生體系受多種因素影響，其中基因型是影響馬鈴薯植株是否可以有效進行再生的重要因素，不同基因型品種的馬鈴薯再生效果差異較大，具有較強的基因型依賴。楊明賀等[12]以大西洋、春薯3號、春薯5號和吉薯1號等4個品種試管苗的莖段進行誘導愈傷組織，結果顯示大西洋品種的愈傷組織誘導及分化效果最佳，誘導率和分化率分別為100%和95%，春薯3號、春薯5號和吉薯1號的分化率分別達79.4%、68.75%、85.7%。

由于植物細胞具有全能性，理論上所有的植株外植體部位都包含有植物生長發(fā)育所需的全部基因，均可以再生形成完整的植株。但由于不同部位外植體的生理狀態(tài)不一樣，同一馬鈴薯品種不同外植體部位再生的效果也存在一定的差異。

馬鈴薯常用于建立植株再生體系的外植體部位包括莖段、葉片、微型薯、試管薯及大田薯塊等[13-15]。

1.2" 培養(yǎng)基與激素配比

馬鈴薯植株再生體系包括誘導愈傷組織、愈傷組織分化和生根等環(huán)節(jié)。誘導馬鈴薯植株再生的基本培養(yǎng)基一般采用MS培養(yǎng)基，然后再添加一定的植物激素。合理的細胞分裂素和生長素之間配比是愈傷組織誘導和分化的關鍵因素，高濃度的生長素和細胞分裂素配比有利于愈傷組織的誘導，而低濃度的生長素和細胞分裂素配比則有利于愈傷組織的分化。不同研究者發(fā)現(xiàn)對于不同的馬鈴薯品種，甚至不同外植部位之間的誘導和分化的激素配比存在一定的差異。張冬梅等[16]利用大西洋的莖段和葉片愈傷組織進行誘導，最佳的誘導培養(yǎng)基分別為MS+0.25 mg/L 6-BA+0.40 mg/L NAA和MS+5.00 mg/L 6-BA+0.30 mg/L NAA，誘導率分別為96.67%和77.04%。莖段和葉片愈傷組織不定芽分化的最佳培養(yǎng)基均為MS+5.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA+10.00 mg/LGA3，不定芽分化率均可達40%以上，分化出的芽多且較壯。高志鵬等[17]以鄂馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）3號為試驗材料，采用3種不同濃度的6-BA和NAA激素配比進行對比試驗，3.00 mg/L的6-BA和0.08 mg/L的NAA的組合能夠最大限度促進愈傷組織的形成，出愈率達到96.25%。而在此培養(yǎng)基的基礎上進行分化，發(fā)現(xiàn)6-BA和GA3濃度分別為1.00、3.00 mg/L時，能有效提高不定芽的分化率，分化效率達到38%。

1.3" 其他因素

除了外植體的基因型、生理狀況、培養(yǎng)基及激素配比以外，培養(yǎng)的環(huán)境條件也對馬鈴薯的愈傷組織的誘導、分化有著重要的影響。光照、溫度和濕度是影響馬鈴薯植株再生的3個重要的因素。有研究認為光照有利于馬鈴薯愈傷組織的誘導，愈傷組織分化需要用 2 000～3 000 lx、16 h/d光照培養(yǎng)，在馬鈴薯誘導愈傷組織和分化過程中，需要保持24 ℃和75%左右的相對濕度[18-19]。

2" 馬鈴薯遺傳轉化的研究進展

2.1" 農桿菌介導法的馬鈴薯轉化體系

農桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，其能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導產生冠癭瘤或發(fā)狀根。分為根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）和發(fā)根農桿菌（Agrobacterium rhizogenes）2種，其中根癌農桿菌中含有Ti（Tumer induce）質粒，發(fā)根農桿菌中含有Ri （Root induce）質粒。Ti質粒和Ri質粒都含有一段T-DNA （T-DNA region），即轉移DNA（Transfer DNA），也被叫做T區(qū)。在基因工程中，通常對T-DNA進行改造，插入需要轉化的目的基因、啟動子及其他標記基因。

在感染植物時，根癌農桿菌或發(fā)根農桿菌能將Ti質?；騌i質粒中的T-DNA區(qū)通過植物傷口進入細胞，并最終整合到基因組中。農桿菌介導法最早應用于雙子葉植物的轉化，隨著轉化載體和轉化方法的改進，農桿菌介導法也在單子葉植物中逐漸得到推廣應用。以農桿菌介導的馬鈴薯遺傳，其轉化過程包括轉化過程包括載粒的構建、農桿菌的活化、預培養(yǎng)、侵染和共培養(yǎng)、抗性植株的再生、抗性植株的篩選和鑒定、移栽和后代篩選等過程。1983年，OOMS1成功建立了四倍體馬鈴薯品種“Maris Bard”的遺傳轉化體系。楊美珠等[4]自1992年在國內最早開展馬鈴薯遺傳轉化試驗以來，我國一些學者利用馬鈴薯葉片、葉柄、莖段、試管薯和微型薯作為轉化受體材料均能成功獲得轉化植株[8，20-22]。

2.2" 農桿菌轉化馬鈴薯的影響因素

2.2.1" 農桿菌轉化濃度

轉化時，首先需要對農桿菌進行活化，活化農桿菌目的是調整最合適的農桿菌的OD值，如果OD值過低，不利于轉化，如果OD值過高，不利于后面轉化材料的培養(yǎng)，極容易造成農桿菌污染。多數(shù)研究者認為，較合適轉化的農桿菌OD值在0.5左右。張西英等[23]研究指出，在侵染后3 d觀察培養(yǎng)材料，發(fā)現(xiàn)農桿菌濃度菌液OD600≥0.7時，農桿菌生長旺盛，外植體切口變黑，污染嚴重，死亡率隨菌液濃度增高而增高。而菌液濃度OD600＜0.3時，可提高成活率，但濃度太低會影響轉化效率，綜合考慮分化率和后期的轉化率，確定合適的菌液濃度的OD600值為0.3～0.5，侵染時間為10 min。

2.2.2" 預培養(yǎng)時間

在利用農桿菌侵染馬鈴薯莖段和葉片之前，通常需要對待侵染的材料進行一定時間的預培養(yǎng)，這對于提高轉化效率具有重要的作用，預培養(yǎng)目的主要是調整外植體的生理狀態(tài)，使轉化材料處于適合轉化的“感受態(tài)”，有助于T-DNA更好地整合到受體細胞中。預培養(yǎng)的時間一般為2～3 d，大多數(shù)研究認為2 d效果最為理想。在張西英等[23]的研究中，探究預培養(yǎng)時間對愈傷組織的生長情況的影響，得到最佳條件是預培養(yǎng)時間為2 d時，其愈傷組織誘導率和芽分化率最高，未進行預培養(yǎng)的外植體極易出現(xiàn)褐化死亡的現(xiàn)象。王清等[24]研究指出，以農桿菌介導的反義POT32基因對純合四倍體馬鈴薯不同外植體類型進行遺傳轉化，葉盤預培養(yǎng)2 d，莖段預培養(yǎng)3 d獲得的抗性愈傷組織頻率最高，分別達到41.67%和48.33%。

2.2.3nbsp; 侵染和共培養(yǎng)時間

侵染和共培養(yǎng)是將農桿菌趨化、附著到外植體表面，并將T-DNA轉化整合到宿主細胞染色體的過程。在侵染過程中，加入50～100 mg/L乙酰丁香酮有效提高轉化效率。侵染和共培養(yǎng)時間對轉化效果具有較大的影響。侵染時間過短，農桿菌附著在外植體表面過少，轉化效率低，如果侵染時間過長，農桿菌在培養(yǎng)液中停留的時間過長，外植體細胞就會因為缺氧而變得軟化，從而失去生長和再生的能力。侵染適宜的時間在8～10 min之間。共培養(yǎng)過程是T-DNA向植物細胞轉移的過程，由于T-DNA向植物細胞轉移的時間大約需要16～24 h，共培養(yǎng)時間過短，沒有達到轉化的效果，而共培養(yǎng)時間過長，農桿菌殘留過多，容易造成植株污染，造成培養(yǎng)失敗。因此，共培養(yǎng)時間一般為48 h為宜。王清等[24]研究指出，48 h的共培養(yǎng)時間有利于控制污染、促進愈傷組織形成，3種供試外植體（莖段、葉盤和葉柄）中以莖段作為轉化材料更為適宜。

2.2.4" 其他因素

馬鈴薯轉化體系是一個復雜的體系，除上述有關因素以外，其他一些因素也對馬鈴薯的轉化有一定的影響[6]。研究表明，在馬鈴薯轉化過程中共轉化階段，加入50～100 umol/L 的乙酰丁酮，對于提高轉化效率有一定作用。也有研究指出，遺傳轉化效率的大小與供試材料的倍性有關[25]。有研究認為轉化過程中誘導芽分化的時候，必須保證充足的光照強度 ，否則會導致愈傷組織生成、芽分化過程緩慢進而使污染的概率增大[26]。此外還有研究認為，在培養(yǎng)基中加入適宜的蔗糖等均有利于提高轉化效率[27]。

3" 存在問題及展望

國內外雖然對于馬鈴薯的植株再生和遺傳轉化體系進行了大量的研究，也取得了相應的研究成果，但也存在一些問題需要解決。在植株再生體系研究方面，存在的主要問題是因不同基因型的馬鈴薯品種誘導傷組織和分化的激素配比存在較大的差異，對于接種不同基因型和外植體的馬鈴薯材料，其誘導和分化培養(yǎng)基中激素配比仍要單獨進行探索。另外一方面，由于材料基因型、愈傷組織的生理狀態(tài)、激素配比及培養(yǎng)條件等均對愈傷組織分化效率有較大的影響，從而導致馬鈴薯愈傷組織分化效率總體偏低。在遺傳轉化體系中，由于馬鈴薯遺傳轉化周期較長，操作和培養(yǎng)過程繁瑣，同時也受到材料基因型、植株再生體系和轉化體系中各種因素的影響，最終獲得陽性植株的比例較低，從而嚴重影響到馬鈴薯遺傳轉化的實際應用。如何進一步優(yōu)化馬鈴薯轉化體系，探索適合普遍基因型的轉化體系，進一步提高轉化效率仍是今后需要解決的問題。此外，轉化后目標基因的沉默現(xiàn)象，也是馬鈴薯轉化中普遍存有的問題。

隨著植物基因編輯技術的發(fā)展，建立在馬鈴薯遺傳轉化基礎的基因編輯技術將成為馬鈴薯分子育種的主要研究方向[28-29]。今后主要的研究重點是研究出適合多種馬鈴薯基因型的再生體系，建立起普遍適合馬鈴薯的轉化體系，結合基因編輯技術，有助于培育出抗病毒、抗逆和品質改良的馬鈴薯新品種。

參考文獻：

[1] 葉明旺，李燦輝，龔明.基因組編輯技術在馬鈴薯精準分子育種中的應用及研究展望[J].生物技術通報，2020，36（3）：9-17.

[2] 屈聰玲，賀榆婷，王瑞良，等.植物轉基因技術的過去、現(xiàn)在和未來[J].山西農業(yè)科學，2017，45（8）：1376-1380，1383.

[3] OOMS G， KARP A， ROBERTS J. From tumour to tuber；tumour cell characteristics and chromosome numbers of crown gall-derived tetraploid potato plants（Solanum tuberosum cv. 'Maris Bard'）[J].Theor Appl Genet，1983，66（2）：169-172．

[4] 楊美珠，潘乃穟，陳章良.高效馬鈴薯遺傳轉化體系的建立及甜蛋白基因的導入[J].Jｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９２（１）：３１－３６，９0.

[5] 王光清，王蘊珠，揚金水，等．高必需氨基酸轉基因馬鈴薯的研究[J]．植物學報，1995（8）：655-658.

[6] 張寧，司懷軍，李學才，等．根癌農桿菌介導的馬鈴薯高效遺傳轉化體系的研究[J]．中國馬鈴薯，2004（3）：132-135．

[7] 鄭秀芳，繆為，李名揚．根癌農桿菌介導的馬鈴薯遺傳轉化體系的研究[J]．蘭州大學學報，2005（3）：41-44．

[8] 盧翠華，邸宏，石英，等.馬鈴薯微型薯外植體遺傳轉化體系的優(yōu)化[J]．作物雜志，2009（1）：3l-35．

[9] 熊偉，馬耀華，胡碧波，等．根癌農桿菌介導的馬鈴薯轉化系統(tǒng)的優(yōu)化[J]．廣西農業(yè)生物科學，2007（1）：1-7．

[10] 司懷軍，謝從華，柳俊.農桿菌介導的馬鈴薯試管薯遺傳轉化體系的優(yōu)化及反義class Ⅰ patatin基因的導入（英文）[J].作物學報，２００３（６）：８０１－８０５．

[11] 齊恩芳．馬鈴薯再生體系建立及農桿菌介導AcInv反義基因轉化[D]．蘭州：甘肅農業(yè)大學，2006．

[12] 楊明賀，朱旭，李楠，等.馬鈴薯莖段高頻再生體系的建立[J].東北農業(yè)科學，2019，44（1）：57-62.

[13] 牛瑜琦，孫蕾，梅超，等.馬鈴薯晉薯16號愈傷組織再生體系的建立[J].中國種業(yè)，2021（2）：70-73.

[14] 閆婷婷，賀媛，高茜，等．馬鈴薯品種Favorita再生體系的優(yōu)化[J]．分子植物育種，2017，15（8）：3057-3062．

[15] 王麗，楊宏羽，張俊蓮，等．根癌農桿菌介導馬鈴薯試管薯轉化體系的優(yōu)化及AtNHXl基因的導人[J]．西北植物學報，2008（6）：1088-1094．

[16] 張冬梅，修志君，馮亞艷，等.馬鈴薯莖段和葉片再生體系建立[J].內蒙古民族大學學報（自然科學版），2021，36（5）：402-408.

[17] 高志鵬，杜玉蕭，馮霞，等.鄂馬鈴薯3號遺傳轉化體系的構建與表達[J].湖北農業(yè)科學，2022，61（9）：162-167，191.

[18] 石虎，楊永智，周云，等．馬鈴薯新品種青薯9號高效再生體系的建立[J]．江蘇農業(yè)科學，2013，41（5）：14-19．

[19] 方貫娜，龐淑敏．馬鈴薯愈傷組織再生體系的研究進展[J]．中國馬鈴薯，2012，26（5）：307-310．

[20] 周鶴峰，邵敏，葛正龍.根癌農桿菌介導的馬鈴薯莖段遺傳轉化條件的研究[J]．河南農業(yè)大學學報，2008，42（3）：345-349.

[21] 曹貞菊，李飛，陳明俊.農桿菌介導幾種不同馬鈴薯外植體轉化研究[J].種子，2021，40（9）：52-56.

[22] 齊恩芳，賈小霞，劉石，等.多抗轉基因馬鈴薯植株的獲得及農桿菌介導試管薯遺傳轉化體系優(yōu)化[J].甘肅農業(yè)科學，2020（11）：1-6.

[23] 張西英，張愛萍，劉江娜.馬鈴薯遺傳轉化體系的優(yōu)化建立及其主要影響因素[J]．基因組學與應用生物學，2019，38（7）：3174-3179.

[24] 王清，李靜文，戴朝曦，等.純合四倍體馬鈴薯遺傳轉化體系優(yōu)化及轉基因塊莖的褐化鑒定[J]．分子植物育種，2006（4）：553-558.

[25] 葉明旺，張春芝，黃三文.二倍體栽培馬鈴薯高效遺傳轉化體系的建立[J]．中國農業(yè)科學，2018，51（17）：3249-3257.

[26] 鞏慧玲，王蒂．馬鈴薯遺傳轉化影響因素的探討[J]．中國馬鈴薯，2003（5）：284-286．

[27] 栗亮，文鋼，楊濤，等．根癌農桿菌介導的CMO基因轉化馬鈴薯的研究[J]．生物技術，2009，19（3）：16-19．

[28] CLASEN B M， STODDARD T J， LUO S， et al． Improving cold storage and processing traits in potato through targeted gene knockout[J]．Plant Biotechnology Journal， 2016，14（1）：169-176.

[29] NICOLIA A，PROUX-WERA E， AHMAN I，et al．Targeted gene mutation in tetraploid potato through transient TALEN expression in protoplasts[J]．Journal of Biotechnology，2015（204）：17-24．