基于網絡藥理學和分子對接技術預測西洋參抗衰老的作用機制

摘要：基于網絡藥理學聯合分子對接技術探討西洋參抗衰老的潛在有效成分及其作用機制。利用斑馬魚衰老模型評價西洋參的抗衰老活性；使用數據庫篩選出西洋參活性成分及其與抗衰老相關的潛在靶點，并繪制蛋白互作網絡（PPI），篩選核心靶點；對核心靶點進行富集分析和分子對接驗證。SA-β-Gal染色結果表明西洋參具有顯著的抗衰老活性。數據庫篩選出西洋參活性成分11個，抗衰老的潛在核心靶點AKT1、STAT3、JUN等53個。GO和KEGG分析的結果顯示西洋參的抗衰老作用可能涉及對外源刺激的反應、凋亡過程負向調控、PI3K-AKT信號通路、ErbB信號通路等。分子對接結果顯示有效成分polyacetylene PQ-2和PQ-2與關鍵靶點結合緊密，AKT1和HRAS與多種成分結合緊密。西洋參可能通過polyacetylene PQ-2和PQ-2等多種成分作用于AKT1、HRAS、MAPK1等多個靶點，進而通過調節內分泌抵抗、ErbB信號通路等多條通路發揮抗衰老作用，為西洋參在抗衰老應用方面提供了理論基礎。

關鍵詞：西洋參；抗衰老；網絡藥理學；分子對接；作用機制；斑馬魚模型

中圖分類號：R285文獻標志碼：A文章編號：1002-4026（2024）06-0042-09

衰老是一種復雜的自然現象，表現為持續的進行性功能下降和慢性疾病風險增加。它受遺傳、免疫和環境等多因素的影響，是一個不可逆的過程[1]。據統計，目前全球60歲以上人口占總人口的13.7%，該比例仍在繼續增長[2]。隨著老年人口基數的增長，衰老相關疾病發生的數量也在不斷增加，因此對老齡化過程潛在機制的挖掘，并找到有效的抗衰老治療干預措施具有重要的研究價值。衰老受免疫力降低、基礎代謝減慢、抗氧化相關酶的活性降低等多種生理過程的影響[3]。從抑制以上生物過程的角度出發，篩選出西洋參中潛在的抗衰老藥物。

中藥對于復雜病因的防治具有天然優勢，其能夠通過單靶點疊加作用、多靶點協同作用及毒性分散效應發揮藥效并削弱自身毒性[4]。西洋參屬于五加科植物，清朝吳儀洛所著《本草從新》中記載西洋參具有治療多痰、咳嗽、精神虛弱、身心疲勞等功效，對人的軀體補而不燥[5]。藥理研究表明，西洋參具有抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用[6]。然而，關于西洋參抗衰老的活性及機制報道甚少。

中藥的成分繁多，研究有較大難度。網絡藥理學有將多成分、多通路和多靶點進行系統研究的特點，使得對中藥的研究更加便捷[7]，被越來越多地應用于中藥藥理分析，為中醫問題的研究提供更基礎、更科學的解釋[8]。本研究采用網絡藥理學方法預測西洋參抗衰老的潛在有效成分及靶點，并運用分子對接技術分析了最佳結合位點。探討了西洋參抗衰老的主要成分和分子生物學機制，為后續研究提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1斑馬魚

實驗所用的野生型AB品系斑馬魚由山東省科學院生物研究所藥物篩選重點實驗室提供，動物實驗方案經由山東省科學院生物研究所動物倫理委員會審查批準（批準文號 SWS20220705 ）。斑馬魚養殖在28 ℃恒溫水循環系統中，明暗交替時間為14 h / 10 h，每天喂食兩次。于實驗前一天，將雌雄斑馬魚放入交配缸的兩側，次日上午抽去隔板使其交配。1.5 h后，收集受精卵，并用胚胎培養水（5 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、 0.4 mmol/L CaCl2、0.16 mmol/L MgSO4 ）清洗3遍以去除雜質。清潔后的胚胎放入28 ℃恒溫培養箱中備用。

1.1.2藥物與試劑

西洋參干燥根，產地美國，由威海市文登區道地參業發展有限公司提供；細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒（#C0602）購自上海碧云天生物技術有限公司；過氧化氫叔丁醇（TBHP，#C13512156）購自上海麥克林生化股份有限公司；苯基硫脲（PTU，#BCBW4842）購自美國Sigma公司；4%多聚甲醛（PFA，#BL539A）購自白鯊生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，#SL33131901）購自北京酷來搏科技有限公司；無水乙醇（#10009218）購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3儀器

斑馬魚養殖系統（北京愛生科技有限公司）；恒溫光照培養箱（HPG280-BX，東聯電子技術有限公司）；Zoom V16體視熒光顯微鏡（德國卡爾蔡司公司）；超聲波清洗機（SB-5200DT，寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2方法

1.2.1西洋參提取物的獲取

將西洋參根研磨成粗粉末，精確稱取1 g粗粉末溶于8 mL的50%乙醇中。50 ℃超聲振蕩1 h后，過濾，濾液蒸干即得西洋參提取物。

1.2.2西洋參提取物的抗衰老活性評價

挑選受精后6 h（6 hpf）的健康斑馬魚胚胎置于12孔板中，每孔10條，設置空白組、模型組（TBHP， 500 μmol/L）和不同質量濃度的西洋參提取物組（PQL.，12.5、25.0、50.0、100.0 mg/L），加入3% PTU抑制斑馬魚黑色素的形成，各孔溶液體系為3 mL，每組設置3個重復孔。繼續在28 ℃恒溫箱內避光培養至受精后6 d（6 dpf），期間每兩天更換一次藥液。暴露實驗結束后，將斑馬魚用PBS清洗三遍后置于4% PFA中固定過夜。次日用PBS清洗三遍，利用β-半乳糖苷酶染色劑進行染色，染色完成后用PBS清洗三遍，各組隨機選取10條斑馬魚置于Zoom V16體式顯微鏡下用32倍放大倍數采集圖像。使用Image Pro Plus 5.1對圖像進行數據統計，用GraphPad Prism 8.0.2對數據進行統計學分析。

1.2.3西洋參活性成分的篩選及作用靶點的獲取

利用TCMSP數據庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）檢索西洋參的化學成分，并設置口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件，篩選出活性成分[9-10]。使用PharmMapper數據庫（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）和SwissTargetPrediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）檢索活性成分獲取作用靶點。最后，利用Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org）對收集到的作用靶點進行名稱規范。

1.2.4衰老相關靶點的獲取及共有靶點的篩選

在GeneCards（https：//www.genecards.org）、OMIM （https：//www.genecards.org）和DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）中，以“aging”為檢索詞篩選相關基因。在GeneCards中，優先選擇Score值大的靶點。將結果進行合并去重，獲取衰老相關靶點。將西洋參活性成分靶點和衰老靶點導入Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制韋恩圖并獲取共有靶點。

1.2.5西洋參-衰老的蛋白質相互作用（PPI）網絡構建及核心靶點篩選

將共有靶點導入String（https：//string-db.org/）構建PPI網絡圖，物種選擇“Homo sapiens”，設置medium confidencegt;0.4。將得到的PPI數據導入CytoScape 3.9.1軟件，用Centiscape 2.2功能對數據進行分析，計算度值（degree）、介數中心性和接近中心性，選取度值、介數中心性和接近中心性高于相應中值的目標節點作為核心靶點。

1.2.6GO分析與KEGG富集分析

利用David（https：//david.ncifcrf.gov/）對核心靶點進行GO功能分析和KEGG通路富集分析，物種選擇“人類”，設置Plt;0.05為篩選條件。GO分析包括生物過程（biological process， BP）、分子功能（molecular function， MF）和細胞成分（cellular component， CC）。使用Bioinformatics（http：//www.bioinformatics.com.cn/）對得到的數據進行可視化處理。

1.2.7“中藥-成分-疾病-靶點-通路”網絡的構建與分析

將西洋參活性成分、核心靶點、KEGG前20條通路導入Cytoscape 3.9.1構建網絡圖。

1.2.8分子對接

選擇degree值排序前6的核心靶點和活性成分進行分子對接。利用RCSB PDB數據庫（https：//www.rcsb.org/）獲得靶點的蛋白質3D結構，利用TCMSP數據庫獲得活性成分配體的mol2結構。使用AutoDockTools 1.5.7軟件對靶蛋白和配體進行分子對接，使用PyMoL 2.5.5軟件對對接結果進行可視化處理。

1.2.9統計學分析

統計學分析使用GraphPad Prism 8.3.0，實驗數據用x±s表示。采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）對各組間差異的顯著性進行分析（Plt;0.05具有顯著性差異）[11]。

2結果

2.1β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色

為了評價西洋參提取物的抗衰老活性，首先進行了SA-β-Gal染色，結果如圖 1所示。與空白組相比，模型組斑馬魚的SA-β-Gal染色強度顯著上升，表明TBHP成功誘導了斑馬魚發生衰老；經西洋參提取物處理后顯著降低，表明西洋參提取物具有顯著的抗衰老活性。

2.2西洋參活性成分及靶點預測

從TCMSP網站中篩選出11種活性成分，見表 1。將PharmMapper和SwissTargetPrediction數據庫中得到的11種成分的2 111個靶點進行合并去重，獲得623個相關靶點。

2.3衰老相關靶點的獲取與篩選及共有靶點的篩選

將GeneCards、OMIM和DisGeNET獲得的靶點進行合并去重，并選擇Score值排序前3 000的靶點作為與衰老相關的靶點。將衰老相關靶點與西洋參活性成分靶點導入Venny 2.1獲得263個交集靶點的韋恩圖。

2.4西洋參抗衰老的蛋白質相互作用（PPI）網絡構建及核心靶點篩選

將交集靶點導入String數據庫得到西洋參抗衰老潛在靶點的PPI網絡數據，然后利用CytoScape 3.9.1軟件對PPI網絡數據進行分析。PPI網絡共有263節點和5 303條邊，利用Centiscape 2.2工具對數據進行分析，得到degree值為40.327、CC為261.278和BC為0.002。將degree、BC和CC作為篩選條件，篩選得到53節點和995條邊，將這53個靶點作為西洋參抗衰老的核心靶點。其中，degree值排名前10的核心靶點為AKT1、STAT3、JUN、CASP3、ESR1、TNF、EGFR、ALB、MAPK3、MTOR。PPI網絡圖與核心靶點篩選過程圖詳見OSID開放科學與數據圖1。

2.5GO分析與KEGG富集分析

將核心靶點進行GO和KEGG分析。GO分析得到生物過程（biological process， BP）471個，細胞組成（cell component， CC）53個，分子功能（molecular function， MF）82個，分別選擇P值最小的前10條進行可視化（圖2）。其中，生物過程涉及對外源刺激的反應、凋亡過程負向調控等；細胞組成包括大分子復合物、線粒體等；分子功能主要涉及酶結合、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性等。這充分說明西洋參通過多種生物過程來實現細胞和分子功能，從而發揮抗衰老的活性。

為了探究西洋參抗衰老的信號通路機制，我們進行了KEGG富集分析，共獲得155條結果，主要涉及PI3K-AKT信號通路、ErbB信號通路等。選擇P值最小的前20條信號通路進行可視化（圖3）。

2.6“成分-靶點-通路”網絡圖的構建與分析

將西洋參活性成分、靶點和通路信息導入到Cytoscape 3.9.1軟件中，構建“成分-靶點-通路”網絡圖（圖4）。按照degree值排名，得到西洋參在抗衰老方面的主要成分有罌粟堿、PQ-2、聚乙炔PQ-2、曼陀羅靈、殷金醇棕櫚酸酯、胡蘿卜苷_qt。degree值排名前6的靶點有MAPK1、AKT1、PIK3CA、MAPK3、HRAS、SRC。

2.7分子對接

分別將degree排名前6的活性成分與靶點進行分子對接驗證，對接所需結合能如表2所示，結合能熱圖見圖5。將結合能小于-5 kcal/mol（1 kcal=4.184 kJ）的對接結果進行可視化，見圖6。各靶點在PDB數據庫的編號如下，AKT1（7NH5）、HRAS（3K8Y）、MAPK1 （3SA0）、MAPK3 （4QTB）、PIK3CA （7PG5）、SRC （2H8H）。

3討論

SA-β-Gal是廣泛使用的細胞衰老生物標志物，衰老細胞內的SA-β-Gal含量會明顯升高[12]。SA-β-Gal是一種在β-D-半乳糖苷中裂解β-D-半乳糖殘基的酶，這種酶積聚在衰老細胞的溶酶體區室中；X-Gal是一種與吲哚相連的半乳糖組成的無色可溶性化合物，SA-β-Gal在pH 6.0條件下水解X-Gal，于細胞培養物或組織中釋放出深藍色的不溶性產物，從而可以檢測衰老細胞[13]。我們利用斑馬魚實驗證明了西洋參具有抗衰老活性。

通過對西洋參和衰老的交集靶點構建PPI網絡并進行拓撲分析，篩選得到AKT1、STAT3、JUN、CASP3、TNF、EGFR、ALB等西洋參抗衰老的潛在核心靶點。AKT控制基本的細胞功能，包括增殖、凋亡、代謝和轉錄；AKT1是AKT的一個亞型，參與細胞增殖和轉化的調節，對細胞周期進程和調節產生多重影響[14]。STAT3是IL-6激活的急性期反應因子（APRF）復合物的一個組成部分，在刺激肝臟先天免疫介質的表達中起著至關重要的作用[15]。JUN是AP-1轉錄因子的一個亞型，與細胞的增殖、分化、凋亡、炎癥和免疫調節有關[16]。半胱天冬酶（Caspases）參與細胞凋亡、壞死和炎癥的信號通路；CASP3是半胱天冬酶主要的效應子，對在細胞凋亡終末期裂解的大多數底物進行蛋白水解[17]。TNF在許多細胞類型中激活促炎和應激反應信號；TNF-α是TNF家族的一員，主要由巨噬細胞產生，是一種有效的炎癥細胞因子，可誘導復雜的免疫反應，并具有抗癌作用[18]。EGFR是一種酪氨酸激酶受體，參與控制細胞增殖和生長的信號通路，靶向EGFR酪氨酸激酶活化對神經退行性疾病和腦損傷有治療作用[19]。ALB是人類血液中最豐富的蛋白質，主要功能是調節血液的膠體滲透壓，是血漿中的主要鋅轉運蛋白[20]。由此推測，西洋參可能通過作用于這些靶點，對細胞增殖、生長和凋亡進行調節，進而達到抗衰老的效果。

KEGG富集分析發現西洋參可能通過內分泌抵抗通路、ErbB信號通路、PI3K-AKT信號通路等發揮抗衰老作用。虛弱與衰老過程密切相關，生理衰退會隨著虛弱加速；內分泌系統是虛弱的關鍵系統之一，它與大腦、免疫系統和骨骼肌有著復雜的相互關系[21]。Nrg-ErbB信號對發育、成人和衰老大腦中的許多功能是必不可少的，Nrg和/或ErbB基因被破壞的小鼠顯示出與精神、發育和年齡相關的疾病[22]。PI3K/AKT通路與細胞增殖、葡萄糖代謝、細胞存活、細胞周期、蛋白質合成有關，并且PI3K/AKT通路在實體瘤、免疫介導疾病、心血管疾病、糖尿病、神經系統疾病等疾病中表達不平衡[23]。由此推測，西洋參可能通過調節內分泌、細胞代謝和免疫系統發揮抗衰老作用。

最后，分別將degree排名前六的靶點與活性成分進行分子對接，結合效果最好的靶點為AKT1和HRAS。AKT與細胞的增殖、存活和代謝有關，有研究表明敲除AKT會使小鼠的體型縮小、睪丸和胸腺中自發細胞凋亡增加[24]，并且AKT1過表達消除了miR-495誘導的細胞凋亡和增殖抑制[25]。HRAS是RAS的一種亞型，參與RAS蛋白信號轉導的激活；抑制HRAS會促進靜止細胞向衰老過渡，阻止抑制可阻止衰老進程[26]。分子對接的結果顯示西洋參活性成分可以與衰老靶點穩定結合發揮抗衰老作用。

綜上所述，本研究通過SA-β-Gal染色、網絡藥理學分析和分子對接技術探究了西洋參抗衰老的活性、潛在有效成分及其作用機制。通過篩選核心靶點和對其進行富集分析，發現西洋參通過AKT、HRAS、PI3K-AKT信號通路等多靶點和多通路共同作用的方式發揮抗衰老效果，涉及內分泌調節、細胞周期調節、免疫調節等生物過程。本文對西洋參抗衰老的機制研究為理論預測，缺乏具體的實驗驗證，下一步將通過藥理實驗等方法鑒定有效成分、驗證關鍵靶點與通路，以期為實際應用提供指導。

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