基于網絡藥理學和分子對接探究花椒葉抗動脈粥樣硬化的作用機制

摘要：借助網絡藥理學探究花椒葉抗動脈粥樣硬化的潛在活性成分和作用機制，并用分子對接與細胞實驗進行驗證。通過查閱文獻收集花椒葉化學成分，借助Swiss Target Prediction對花椒葉活性成分和相關靶點進行篩選；利用Gene Cards、OMIM數據庫檢索與動脈粥樣硬化疾病相關的靶點；繪制花椒葉抗動脈粥樣硬化的蛋白蛋白相互作用網絡，進一步借助David數據庫進行通路富集分析；對關鍵靶點進行分子對接驗證；最后，用脂多糖刺激的RAW264.7細胞驗證關鍵成分的抗炎作用。結果表明，篩選得到花椒葉活性成分168個，花椒葉抗動脈粥樣硬化的潛在靶點131個，蛋白蛋白相互作用分析得到的關鍵靶點有TNF、IL6、AKT等，KEGG富集顯示參與的信號通路有AGE-RAGE信號通路、VEGF信號通路、HIF-1信號通路等。分子對接結果顯示，關鍵靶點與關鍵成分有較好的結合性?？寡讓嶒灲Y果顯示，花椒葉關鍵成分可以有效抑制脂多糖刺激的RAW264.7細胞中NO的產生。為花椒葉抗動脈粥樣硬化研究提供了理論依據，為花椒葉的開發利用提供了有益探索。

關鍵詞：花椒葉；動脈粥樣硬化；網絡藥理學；分子對接；作用機制

中圖分類號：R96 " " nbsp; " " " " "文獻標志碼：A

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種慢性炎癥性疾病，嚴重影響人類健康，是世界范圍內的主要死亡原因之一[1]。AS相關的炎癥主要是由促炎細胞因子、炎癥信號通路、生物活性脂質和粘附分子等介導的[2]。AS的主要病理表現為動脈血管壁出現脂質斑塊的沉積，單核細胞來源的巨噬細胞在斑塊的形成、發展和破裂過程中起著關鍵作用[3-4]，巨噬細胞通過分泌腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、一氧化氮（Nitric oxide，NO）等炎癥因子參與了AS中炎癥的形成[5]，炎癥反應也會增加斑塊的不穩定性，加速斑塊破裂。近年來，阿托伐他汀、辛伐他汀等藥物多用于治療AS，但長期使用會引起神經毒性、腎毒性以及肝毒性等副作用[6]。中藥具有毒副作用小的特點，在 " AS治療中具有獨特的優勢[7]。

花椒葉蕓香科花椒屬植物花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim. ）的干燥葉子，《本草綱目》記載其味辛，性熱，無毒，是傳統的調味料和中藥，具有悠久的使用歷史[8]?；ń啡~的化學成分復雜，

主要含有揮發油類、黃酮類、生物堿類、木脂素類等，花椒葉中含有揮發性成分α-水芹烯、α-石竹烯、桉葉醇、棕櫚酸都具有較強的抗氧化活性[9]；花椒葉中含量較多的黃酮類成分有蘆丁、槲皮素、三葉豆苷等[10]，黃酮類成分具有抗心腦血管疾病、抗炎、降血糖等藥理作用[11]；山椒素是花椒葉中生物堿類代表成分，也是花椒葉麻味的主要來源，具有麻醉、抑菌等功效[12，13]。因此，花椒葉可能為治療AS的潛在藥物。目前，花椒葉作用于心血管疾病的研究較少，未從生物學的角度揭示花椒葉抗AS的物質基礎及作用機制，具有潛在的開發與應用價值。網絡藥理學是以生物學為基礎，與中藥的系統性和整體性相結合，體現中藥治療疾病多靶點、多通路的特點[14]。因此，本文將首次基于網絡藥理學探究花椒葉治療AS的活性成分及潛在作用機制，并通過分子對接和細胞實驗進行了驗證，為后續中藥花椒葉的合理開發提供依據。

1材料與方法

1.1材料

Swiss Target Prediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/），Pubchem數據庫（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），Gene Cards數據庫（https：//www.genecards.org/），OMIM數據庫（https：//www.omim.org/），String數據庫（https：//cn.string-db.org/），微生信平臺（https：//www.bioinformatics.com.cn/），Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），PDB數據庫（https：//www.rcsb.org/），Cytoscap 3.9.1，Sybyl X 2.0，Pymol 2.5.0，GraphPad Prism，ChemDraw18.0， Office 2016。

RAW 264.7細胞購自中國科學院細胞庫。磷酸鹽緩沖鹽水（Phosphate-buffered saline，PBS）、胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）和RPMI 1640培養基（RPMI 1640）購自北京索萊寶科技有限公司。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）和地塞米松（Dexamethasone，Dex）購自美國西格瑪奧德里奇公司（純度 gt; 98 %），茵芋堿（Skimmianine）、青花椒堿（Schinifoline）、異鼠李素（Isorhamnetin）、橙皮素（Hesperetin）、山柰酚（Kaempferol）和槲皮素（Quercetin）購自四川恒誠致遠生物科技有限公司（純度 gt; 98 %）。

1.2 方法

1.2.1花椒葉成分及靶點的篩選 "通過查閱文獻對花椒葉的成分搜集整理，將化學成分輸入Pubchem數據庫，獲得相對應的CAS號和Smiles號，借助Swiss ADME篩選出活性較高的成分，得到候選成分，將候選成分借助Swiss Target Prediction進行靶點預測，設置Probability得分 gt; 0.1為預測靶點條件，得到各成分對應的靶點。

1.2.2動脈粥樣硬化靶點的篩選 "以“Atherosclerosis”為關鍵詞，在Gene Cards數據庫和OMIM數據庫中檢索與AS相關的靶點，兩次搜索得到的靶點合并后去除重復項，再以相關中位數為標準，篩選靶點基因。借助Venny 2.1.0在線平臺，導入花椒葉候選成分靶點與AS靶點，繪制韋恩圖，交集為二者共有靶點，即花椒葉抗AS的潛在靶點，潛在靶點對應的成分為花椒葉抗AS的活性成分。

1.2.3成分-靶點網絡與蛋白蛋白相互作用（PPI）網絡的構建 "將篩選出來的潛在靶點與活性成分導入Cytoscape 3.9.1進行拓撲參數分析，構建成分-靶點網絡圖，根據Degree值篩選出關鍵成分。將潛在靶點導入String數據庫，在人源選項下搜索，所有參數操持默認值，進行PPI分析，隨后將得到的數據導入Cytoscape 3.9.1，并用CytoNCA插件對其做介數中心性（Betweenness centrality，BC）分析，構建PPI網絡，根據BC值調整網絡圖，篩選出關鍵靶點。

1.2.4富集分析 "將篩選得到的關鍵靶點導入David數據庫，進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，GO功能又分為生物過程（BP）、細胞組分（CC）和分子功能（MF）３大類。設定閾值為P lt; 0.05，借助微生信平臺對GO前十條通路和KEGG前二十條通路進行可視化。

1.2.5分子對接 "選擇PPI網絡中BC值排名前七的關鍵靶點TNF、IL6、AKT1等與Degree值排名前十的關鍵成分茵芋堿、橙皮素、香葉木素等進行分子對接驗證。從PDB蛋白質數據庫獲得目標晶體結構，使用Surflex-Dock進行分子對接，選用Total-score打分最高的對象進行分析，得出較好的分子構象。

1.2.6抗炎實驗 "RAW 264.7細胞用含有10%（v/v）FBS的RPMI 1640培養基培養，置于37℃，5% CO2條件下的細胞培養箱中傳代培養。

采用Griess法測定RAW 264.7細胞產生的NO[15]。取狀態良好且處于對數生長期的RAW 264.7細胞接種于96孔板中，接種密度為5×105 個/mL，100 μL/孔，置于培養箱中孵育24 h。待細胞貼壁后，更換含有不同化合物和LPS（1μg/mL）的培養基，共孵育24 h。該實驗分為四組，空白對照（0.1% DMSO）、模型對照（LPS，1 μg/mL）、陽性對照（Dex，10 μmol/L）和化合物組（30 μmol/L），所有的孔做平行處理。24 h后，收集上清液，加入Griess試劑A、B，并用酶標儀（540 nm）測定吸光度。

1.3統計分析

數據分析應用 GraphPad Prism 9統計軟件，實驗數據以xs表示，多組數據通過單因素方差分析及統計比較各組間的差異，兩兩比較采用T檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2結果與討論

2.1 關鍵成分與靶點

對收集到的花椒葉成分借助Swiss ADME進行篩選，共得到候選成分168個，將候選成分用Swiss Target Prediction平臺進行靶點預測，篩選可能性大于0.1的靶點共692個。通過數據庫搜索到的AS靶點，以相關分數的中位數為標準，進行2次篩選，保留高于中位數的靶點，共得到動脈粥樣硬化靶點669個。繪制維恩圖，得到花椒葉抗AS的潛在靶點131個，圖1所示。

2.2 成分-靶點網絡及PPI網絡的構建

通過借助Cytoscape 3.9.1軟件，構建成分-靶點網絡和PPI網絡，如圖2、3所示。在圖2中，節點之間的連線代表成分和靶點之間的潛在關系，Degree值反應靶點之間關系的強弱，根據Degree gt; 15篩選關鍵成分，共19個，包括茵芋堿、槲皮素、異鼠李素等，結構圖見圖4。據文獻報道，茵芋堿有抗炎活性，用茵芋堿預處理LPS刺激的BV-2小膠質細胞，可以降低促炎細胞因子TNF-α和IL-6的水平，抑制NO、iNOS和PGE 2蛋白的表達，增加COX-2蛋白的表達，從而抑制炎癥[16]；槲皮素通過上調RAW 264.7細胞中的ABCA1和下調PCSK9的表達來治療AS[17]；異鼠李素可以降低ox-LDL刺激的巨噬細胞中ROS的水平，通過激活PI3K/AKT信號通路，上調HO-1和Nrf 2的蛋白水平，來發揮抗AS的作用[18]。進一步將數據導入Cytoscape 3.9.1進行BC分析，BC越大，靶點之間的關系越緊密，以BC的中位數為標準，進行兩次篩選，保留高于中位數的靶點，共得到33個關鍵靶點，例如TNF、IL6、AKT等，這些靶點與炎癥和脂質代謝相關。

2.3 富集分析

通過借助David數據庫分析，共得到條373條GO通路和132條KEGG通路，其中GO通路包含284條BC通路，36條CC通路和53條MF通路，基于P lt; 0.05篩選，按降序排列，借助微生信平臺，分別對BC、CC、MF通路的前十條和KEGG通路的前二十條可視化，如圖5、圖6。BC富集顯示花椒葉主要參與基因表達的調控、脂多糖介導的信號通路的調控、炎癥反應等。CC富集顯示主要有細胞核、細胞質和復雜的大分子等。MF主要富集到酶結合、RNA聚合酶II轉錄因子活性，配體激活序列特異性DNA結合等。KEGG富集到的主要有AGE-RAGE信號通路、VEGF信號通路、HIF-1信號通路等，提示其可能是花椒葉治療AS的潛在作用機制。晚期糖基化終產物（Advanced glycation endproducts，AGE）與晚期糖基化終產物受體（Receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）相互作用后，激活多種下游細胞信號通路，包括JAK/STAT、NADPH、MAPK信號通路，進而導致NF-κB信號通路的激活，增加促炎癥和促動脈粥樣硬化介質的產生[19-21]。血管內皮生長因子（Vascular edothelial growth factor，VEGF）可以促進粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表達來增強炎癥細胞的粘附能力，促進AS的發展[22]。低氧誘導因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是低氧誘導因子-1（Hypoxia inducible factor-1，HIF-1）的主要功能亞基，HIF-1α能夠促進內皮細胞形成新血管，在VEGF的介導下，新生血管轉換成不穩定脂質斑塊，促進AS的發展[23]。花椒葉可能通過介導AGE-RAGE、VEGF、HIF-1信號通路來改善AS的發生與發展。

2.4 分子對接

分子對接結果與網絡藥理學結果保持一致，結果顯示花椒葉關鍵成分與關鍵靶點對接良好，分子對接靶點蛋白見表1。神經元型一氧化氮合酶（Neuronal nitric oxide synthase，NOS1）是一氧化氮合成酶（Nitric oxide synthase，NOS）的主要亞型之一，在巨噬細胞中表達產生NO，參與調控炎癥反應的信號通路[24]。MAPK3是絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）的其中一員，MAPK信號通路調節多種細胞過程，包括細胞存活、增殖、凋亡和分化等過程[25]。研究顯示，對接分值大于4.25，成分與靶點蛋白的結合能力較強[26]。在本研究中，對接結果（表2）表明，關鍵成分與關鍵靶點大部分都具有結合活性，其中NOS1、MAPK3和PPARG與各成分的對接活性較好，說明它們的潛在活性相對較高。選擇與每個靶點對接分值最高的成分進行可視化，結果如圖7所示，其中，生物堿類成分與MAPK3的結合能力較好。

2.5 抗炎實驗

巨噬細胞可以產生大量的炎性細胞因子，促進血栓的形成，增加斑塊面積和不穩定性。LPS可以誘導巨噬細胞RAW 264.7分泌多種炎癥因子和炎癥介質，如白介素-1β、白介素-6、腫瘤壞死因子-α、NO等[27]。為了評估花椒葉中關鍵成分的抗炎作用，我們采用Griess法測定花椒葉關鍵成分中的茵芋堿（Skimmianine）、青花椒堿（Schinifoline）、異鼠李素（Isorhamnetin）、橙皮素（Hesperetin）、山柰酚（Kaempferol）、槲皮素（Quercetin）在LPS刺激的RAW 264.7細胞中NO的含量。如圖7所示，與對照組相比，LPS組NO的濃度顯著增加，在給予30 μmol/L藥物之后，可以顯著降低NO的濃度，與模型組相比，所有藥物均能顯著降低RAW 264.7細胞的炎癥水平，其中異鼠李素顯示了最強的抗炎活性。

3結 "論

綜上所述，本研究借助網絡藥理學篩選得到花椒葉抗AS的關鍵成分茵芋堿、橙皮素、異鼠李素、羥基-α-山椒素以及羥基-β-山椒素等，花椒葉通過介導AGE-RAGE、VEGF、HIF-1等信號通路抑制炎癥介質的產生、調節脂質代謝，展現出較強的抗AS作用。運用網絡藥理學的手段探究花椒葉抗AS的作用機制體現出中藥治療疾病多靶點、多通路的特點。本研究為中藥的開發以及動脈粥樣硬化的治療提供了理論依據。

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Anti-atherosclerosis Mechanisms of Zanthoxylum Bungeanum Maxim. Leaves Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

LI Can，YANG Shufang，YANG Xiaoli，LIU Rongxia*

（School of Pharmacy， Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation（Yantai University）， Ministry of Education， Collaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of Shandong，Yantai University， Yantai 264005， China）

Abstract： The potential active components and mechanisms of Z. bungeanum Maxim. leaves against atherosclerosis are investigated by means of network pharmacology， and verified by molecular docking and cell experiments. The chemical components of Z. bungeanum Maxim. leaves are collected by referring to literatures， and the active components and related targets are screened by Swiss Target Prediction; Genecards and OMIM databases are used to search the targets related to atherosclerosis; The protein-protein interaction network of Z. bungeanum Maxim. leaves against atherosclerosis is mapped， and pathway enrichment analysis is conducted with David database; the key components and targets are verified by molecular docking. Finally， the anti-inflammatory effects of key components are verified on lipopolysaccharide stimulated RAW264.7 cells. The results show that 168 active components and 131 potential anti-atherosclerosis targets of Z. bungeanum Maxim. leaves are screened，and the key targets are obtained by PPI analysis， including TNF， IL6 and AKT， etc. KEGG enrichment results show that the signaling pathways， ie AGE-RAGE， VEGF， HIF-1 signaling pathways， involved in the regulation. The results of molecular docking of key components and targets show a good bonding. The results of anti-inflammatory experiment show that the key components of Z. bungeanum Maxim. leaves can effectively inhibit the production of NO in lipopolysaccharide stimulated RAW264.7 cells. This study provides theoretical basis for the investigation of anti-atherosclerosis effect of Z. bungeanum Maxim. leaves and also provides beneficial exploration for the development and utilization of Z. bungeanum Maxim. Leaves.

Key words： Zanthoxylum bungeanum Maxim. leaf; atherosclerosis; network pharmacology; molecular docking; mechanism of action