HPLC-ELSD法測定梅子提取物中糖和糖醇的含量

馬舒翼 梁佳欣 許春平 張婷 李冉 董愛君 肜霖

摘要：建立了一種高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法（HPLC-ELSD）同時測定梅子提取物中果糖、葡萄糖、山梨醇、蔗糖、麥芽糖水合物、麥芽三糖、麥芽四糖的方法。分離采用Grace Prevail Carbohydrate ES色譜柱，柱溫為30 ℃；流動相為乙腈-水，流速為1.00 mL/min；檢測使用蒸發(fā)光散射檢測器，漂移管溫度為60 ℃，氮氣流速為2.50 L/min。結果表明，果糖、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖水合物、麥芽三糖、麥芽四糖分別在34.69～2 220.00、16.22～1 038.00、38.66～2 474.00、24.53～1 570.00、22.91～1 466.00、6.09～390.00、14.69～940.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好，精密度良好，重復性的相對標準偏差（RSD）為1.00%～4.09%，各目標物的回收率為85.5%～110.1%，精密度為0.3%～4.6%（n=6）。本方法在30 min內(nèi)實現(xiàn)了糖和糖醇的分離，靈敏度和重復性檢測較好，有效避免了溶劑及溫度的影響，測量結果較準確且操作方便，可用于批量檢測梅子提取物中糖和糖醇的含量。

關鍵詞：高效液相色譜（HPLC）；蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）；梅子提取物；糖；糖醇

中圖分類號：TS411? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）12-0158-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.12.029 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Determination of sugar and sugar alcohol content in plum extract by HPLC-ELSD

MA Shu-yi1， LIANG Jia-xin1， XU Chun-ping1， ZHANG Ting3， LI Ran 2， DONG Ai-jun2， RONG Lin2

（1.College of Tobacco Science and Engineering， Zhengzhou University of Light Industry， Zhengzhou? 450000，China； 2. China Tobacco Hubei Industrial Co.， Ltd.， Wuhan? 430040，China； 3. School of Pharmacentical Sciences， South-Central University Minzu， Wuhan? 430074，China）

Abstract： A high performance liquid chromatography and evaporative light scattering detector （HPLC-ELSD） method was established for the simultaneous determination of fructose， glucose， sorbitol， sucrose， maltose hydrate， maltotriose， and maltotriose in plum extract. The separation was carried out using a Grace Prevail Carbohydrate ES column at a column temperature of 30 ℃； the mobile phase was acetonitrile water， with a flow rate of 1.00 mL/min；the detection used an evaporative light scattering detector， with a drift tube temperature of 60 ℃ and a nitrogen flow rate of 2.50 L/min. The results showed that fructose， sorbitol， glucose， sucrose， maltose hydrate， maltotriose， and maltotetraose had a good linear relationship，ranging from 34.69～2 220.00， 16.22～1 038.00， 38.66～2 474.00， 24.53～1 570.00， 22.91～1 466.00， 6.09～390.00 and 14.69～940.00 μg/mL，respectively，the precision was good， and the relative standard deviation （RSD） of repeatability was 1.00%～4.09%， the recovery rates of each target substance were 85.5%～110.1%， and the precision was 0.3%～4.6% （n=6）. This method achieved the separation of sugar and sugar alcohols within 30 minutes， with good sensitivity and repeatability detection， effectively avoiding the influence of solvents and temperature. The measurement results were accurate and the operation was easy， which could be used for batch detection of sugar and sugar alcohols in plum extract.

Key words： high performance liquid chromatography （HPLC）； evaporative light scattering detector （ELSD）； plum extract； sugar； sugar alcohol

梅子，別稱垂枝梅、烏梅、酸梅等，是薔薇科杏屬植物梅（Armeniaca mume Sieb.）的果實，距今有3 000多年的栽培歷史，品種多樣，在中國各地均有栽培，但以長江流域以南各省最多［1］。梅是一種經(jīng)典的藥食同源植物，營養(yǎng)物質(zhì)豐富，有止咳、止瀉、生津、止渴之效［2］；其鮮花可提取香精，葉、根、種仁、果實均可入藥，果實及其提取物也是食品工業(yè)常用的天然原料，可通過干制、鹽漬、熏制等加工成蜜餞、果脯、果汁、果酒等食品［3-5］。

梅子中的有機酸和糖類物質(zhì)是產(chǎn)生食品風味的主要物質(zhì)基礎［6，7］，也是在食品工業(yè)上應用的關鍵成分，其含量也是確定梅子產(chǎn)品質(zhì)量是否合格的重要指標之一，因此對梅子提取物中有機物和糖類物質(zhì)的快速、準確檢測是提高食品質(zhì)量的關鍵。目前對梅子有機酸成分檢測方法及優(yōu)化的研究較多［8-10］，但針對梅子提取物糖類物質(zhì)的檢測方法研究較少。

目前，關于糖類物質(zhì)含量的測定主要采用容量法［11］、分光光度法［12］、酶分析法［13］、旋光法、色譜分析法等［14-16］?？偟膩碚f，色譜分析法的準確度及精密度均較高；氣相色譜［17，18］、液相色譜［19-22］結合不同的檢測器，可對各種糖類物質(zhì)進行分離和定量，其中，液相色譜檢測器常采用示差折光檢測器（Refractive index detector，RID）和蒸發(fā)光散射檢測器（Evaporative light scattering detector，ELSD），而ELSD檢測器是濃度型檢測器，最大優(yōu)勢是響應值與溶質(zhì)顆粒的大小和數(shù)量有關，與溶質(zhì)的化學組成無關，即可檢測不含發(fā)色團的化合物，響應不依賴于樣品的光學特性，任何揮發(fā)性低于流動相的樣品均能被檢測，低溫下也能使用，受溶劑和溫度的影響小，靈敏度高，且適用于梯度洗脫，可彌補紫外檢測器和RID的不足［23，24］，已被廣泛應用于糖類物質(zhì)的檢測。本研究采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法（HPLC-ELSD），充分利用色譜法和ELSD檢測器的優(yōu)勢，建立同時測定梅子提取物中7種糖和糖醇含量的方法，為梅子提取物中糖類成分的快速分析提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

14批次梅子品種、產(chǎn)地的具體信息見表1。

果糖、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖水合物、麥芽三糖、麥芽四糖（純度>99%，美國Sigma公司）；乙腈（色譜純，美國Sigma公司）。

2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；ELSD 2424型蒸發(fā)光散射檢測器（美國Waters公司）；SB-520DT型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；5418R型離心機（艾本德有限公司）；Avanti J-E型離心機（美國貝克曼庫爾特公司）；XS-205DU型電子分析天平（美國梅特勒-托利多公司）；FW100型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；回流提取裝置（武漢科析化玻儀器有限公司）；Milli-Q 超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 樣品處理與分析

1.2.1 梅子提取物制備 將梅子（MZ-1至MZ-14）低溫烘干，用粉碎機粉碎后各取100 g粉末樣品，加500 mL去離子水浸泡30 min，加熱回流提取2 h，過濾，將過濾得到的沉淀物按上述步驟進行二次加熱回流提取、過濾，合并提取液后進行減壓濃縮，減壓濃縮至相對密度（20 ℃）為1.200 0±0.008 0，待濃縮液冷卻至室溫后，加入3倍體積的95%乙醇，攪拌均勻，沉降24 h，過濾，最后濃縮至相對密度（20 ℃）為1.300 0±0.008 0，經(jīng)1.2×105 Pa高壓滅菌20 min后存放于4 ℃冰箱備用［25，26］。

1.2.2 標準溶液與樣品溶液制備 標準溶液制備：將250 mL 乙腈與250 mL去離子水超聲波混合，用作稀釋液。稱取果糖（Fructose）11.10 mg、山梨醇（Sorbitol）5.19 mg、葡萄糖（Glucose）12.37 mg、蔗糖（Sucrose）7.85 mg、麥芽糖水合物（Maltose monohydrate）7.33 mg、麥芽三糖（Maltotriose）1.95 mg、麥芽四糖（Maltotetraose）4.70 mg于5 mL容量瓶中，用稀釋液溶解定容，然后分別用2倍稀釋法稀釋成7個梯度（L1至L7）。

樣品溶液的制備：稱取梅子提取物，分別為MZ-1（119.57 mg）、MZ-2（121.67 mg）、MZ-3（101.04 mg）、MZ-4（169.93 mg）、MZ-5（117.67 mg）、MZ-6（136.07 mg）、MZ-7（161.94 mg）、MZ-8（186.16 mg）、MZ-9（225.23 mg）、MZ-10（210.25 mg）、MZ-11（222.34 mg）、MZ-12（210.26 mg）、MZ-13（257.20 mg）、MZ-14（219.27 mg），置于25 mL的容量瓶中，用稀釋液溶解，并定容，配制成的樣品溶液濃度分別為4.783、4.867、4.042、6.797、4.707、5.443、6.478、7.446、9.009、8.410、8.894、8.410、10.288、8.771 mg/mL，用0.45 μm針式濾膜過濾，濾液收集至進樣瓶中待測。

2 結果與分析

2.1 色譜條件

色譜條件參照文獻［27］的方法并稍作修改。色譜柱為Grace Prevail Carbohydrate ES（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流動相A為水，流動相B為乙腈；洗脫梯度：0～25 min，85%～65% B；25～35 min，65%～55% B；35～45 min，55% B；45～55 min，55%～85% B。流速：1.00 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。漂移管溫度：60 ℃；載氣流速：2.50 L/min；進樣量：10 μL。分離效果如圖1所示。目標化合物在30 min內(nèi)全部出峰。

2.2 方法學考察

2.2.1 線性范圍 將“1.2.2”方法配制的7種糖和糖醇各濃度梯度（L1至L7）的標準溶液進行HPLC-ELSD分析，由于ELSD的濃度與響應值為雙對數(shù)關系［28］，因此以峰面積的對數(shù)Y為縱坐標，以標準溶液濃度（g/100 mL）的對數(shù)X為橫坐標，繪制7種糖和糖醇的標準工作曲線，得到線性范圍。結果（表2）表明，7種糖和糖醇在其線性范圍內(nèi)與峰面積呈線性關系，相關系數(shù)（R2）均≥0.998 0。

2.2.2 重復性試驗 按“1.2.2”方法配制MZ-1梅子提取物樣品溶液，在相同條件下進行6次平行測定，進樣量10 μL，以峰面積計算相對標準偏差（Relative standard deviation，RSD）。結果（表3）表明，MZ-1梅子提取物中含有7種糖和糖醇，并且其相對標準偏差為1.00%～4.09%，說明該方法的重復性良好。

2.2.3 精密度和回收率 按“1.2.2”方法制備MZ-1梅子提取物樣品溶液，加入高、中、低3個濃度的標準品混合母液，按照試驗方法進行回收率試驗并計算測定值的相對標準偏差，進樣量10 μL，共做6組平行測定。結果（表4）表明，各目標物的回收率為85.5%～110.1%，精密度為0.3%～4.6%（n=6），說明該方法回收率較高，精密度良好，測定結果比較準確，適用于目標物的分析。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 按“1.2.2”方法制備MZ-1梅子提取物樣品溶液，室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后分別進樣（10 μL），計算目標物在不同放置時間后的相對標準偏差。其相對標準偏差為1.5%～4.5%，說明該方法在24 h之內(nèi)穩(wěn)定性良好（表5）。

2.3 梅子提取物的糖和糖醇含量分析

將梅子（MZ-1至MZ-14）提取物溶液各進樣3次，14批梅子提取物的色譜如圖2所示。14批梅子根據(jù)峰面積計算梅子提取物中糖和糖醇的含量，結果如表6所示。

新疆維吾爾自治區(qū)酸梅的糖和糖醇種類、含量相比烏梅和青梅均較少，糖和糖醇的種類僅有果糖、山梨醇和麥芽糖水合物。四川省、福建省省內(nèi)不同批次烏梅的糖和糖醇含量差別均較小。而浙江省不同批次青梅的糖和糖醇含量差異較大；其他地區(qū)的青梅各有差異，安徽省、江西省、湖北省青梅的糖和糖醇種類和含量均較少；云南省、廣東省青梅的糖和糖醇含量較高且含量差異較大?？煞从吵雒纷犹鹞冻煞值暮?，對梅子及梅子提取物在食品中的應用提供指導作用。

3 小結

本試驗選取3個不同品種、9個不同產(chǎn)地的梅子共14批，采用加熱回流提取法制備了梅子的水提物，經(jīng)過抽濾、定容，再用0.45 μm微孔濾膜過濾，用Grace Prevail Carbohydrate ES色譜柱分離，蒸發(fā)光散射檢測器進行檢測，建立一種可同時檢測梅子提取物中7種糖和糖醇含量的方法，該方法的重復性相對標準偏差為1.00%～4.09%（n=6），各目標物的回收率為85.5%～110.1%，精密度為0.3%～4.6%（n=6）。該方法準確簡單、易操作、靈敏度高、線性范圍寬，適用于梅子提取物中糖和糖醇含量的常規(guī)檢測。梅子提取物作為一種天然的食品添加劑，其糖類物質(zhì)含量是反映味覺特征的重要指標，但因梅子產(chǎn)地、品種多，不同地質(zhì)、氣候條件、品種的梅子中糖類含量也不同，本研究也為梅子原料的產(chǎn)地篩選提供了技術手段。

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