基于全譜非靶向代謝組學技術的川芎不同部位代謝物深度解析

李若詩 丁海燕 杜 華 黃 鳳 連 艷 劉曉芬 蔣桂華，4，* 尹顯梅，*

（1成都中醫藥大學藥學院，西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137；2成都中醫藥大學本草基因組學研究院，四川 成都 611137；3重慶市中醫院，重慶 400021；4成都中醫藥大學民族醫藥學院，四川 成都 611137）

藥材川芎為傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiongHort.）的干燥根莖，是著名的川產道地藥材，性溫，味辛，歸肝、膽、心包經，具有活血行氣、祛風止痛的功效［1］，多用于治療胸痹心痛、胸脅刺痛、跌撲損傷、月經不調等［2-4］，在四川地區種植面積穩定在9 萬畝（6 000 hm2），占全國栽培產量90%以上，在云南、貴州等地區也有少量分布［5］。川芎地上部分嫩葉可作為菜食用或泡茶飲用，用于頭痛、風濕痹痛和預防心腦血管疾病等［6］。

目前對川芎資源利用主要集中在川芎的根莖，而有研究結果表明，川芎地上部分化合物類型豐富［7-9］，揮發油中的苯酞類化合物質量分數占38.95%［10］，綠原酸、3，5-O-二咖啡酰奎寧酸和藁本內酯含量在5—6月均處于較高水平［11］。譚玉柱等［12］對川芎地上部分進行質量評價，結果顯示不同產區的川芎莖葉具有較好的指紋圖譜相似性，且地上部分占全株鮮重75%以上，資源量豐富，也具有開發潛力。由于川芎中多種活性成分具有重要的藥效學價值，而目前對川芎化學成分分析大多使用單一的檢測技術，如氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）［13-14］、高效液相色譜-質譜聯用（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS）［15］、高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）［16］、薄層掃描［17］、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）［18］、超快速液相色譜（ultra fast liquid chromatograph，UFLC）［19］等，由于技術的局限性，單一的技術往往只能檢測到某類或某幾類成分。目前，通過多質譜聯用的全譜非靶向代謝組學可以更加全面而深入地進行代謝物分析，且已用于番茄［20］、茶［21］、葫蘆巴屬［22］、姜黃屬［23］等植物的代謝物分析。為了進一步挖掘川芎資源、提高資源利用率，本研究基于全譜非靶向代謝組學對川芎根莖、莖、葉三個主要組織部位的代謝物進行分析，并全面評估不同代謝物在川芎不同組織部位的分布格局，旨在為川芎資源的合理利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

川芎樣品于2022年6月采自四川省都江堰市石羊鎮高品質川芎生態種植科研示范基地種質資源圃，經成都中醫藥大學蔣桂華教授鑒定為傘形科植物川芎（LigusticumchuanxiongHort.）的新鮮植株。共收集川芎20 株，去掉泥沙后分為根莖、莖、葉三個部分，各設置6個重復，于50 ℃烘干后備用，樣品保存于成都中醫藥大學中藥標本館。

洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、阿魏酸松柏酯、藁本內酯、歐當歸內酯A、洋川芎內酯A，購自成都曼思特生物科技有限公司，批號分別為MUST-21083105、MUST-22080607、MUST-22021903、MUST-22072108、MUST-22070810、MUST-21090718，純度分別為99.43%、99.39%、98.94%、97.04%、98.38%、定性；水為娃哈哈（杭州）純凈水；甲醇、乙腈、甲酸、正己烷均為色譜純，購自德國Merck 公司；氯化鈉為分析純，購自中國國藥集團（上海）。

1.2 儀器與試劑

BP121S十萬分之一電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司（北京）；恒溫鼓風干燥箱，上海瑯玕實驗設備有限公司；TD5A-WS 型臺式高速離心機，湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；高速組織研磨儀，上海凈信事業發展有限公司；ExionLC? AD 超高效液相色譜（UPLC），美國SCIEX公司；Applied Biosystems 4500 QTRAP串聯質譜（tandem mass spectrometry，MS/MS），美國SCIEX公司；7890B-7000D 氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS/MS），美國安捷倫公司；PLA RSI 120 全自動頂空固相微提取，瑞士CTC Analytics公司。

1.3 供試品制備

1.3.1 HPLC 供試品制備 取1.1 節得到的樣品，粉碎后過二號篩（24 目）。稱取粉末1 g 置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，稱定質量，超聲處理1 h（功率400 W、頻率50 kHz），冷卻至室溫，再次稱定，用甲醇補足減失的質量后搖勻，微孔濾膜（0.22 μm）過濾。

1.3.2 標準品溶液制備 精密稱取洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、阿魏酸松柏酯、藁本內酯、歐當歸內酯A、洋川芎內酯A對照品適量，加甲醇溶解并定容，制成濃度分別為0.068、0.060、0.096、0.011、0.021 mg·mL-1的混合對照品溶液備用，其中洋川芎內酯A僅作定性使用。

1.3.3 LC-MS 供試品制備 參考文獻［24］進行，將剩余干燥川芎樣品粉末混合后，根莖、莖、葉各稱取1 份50 mg 樣本粉末，加入-20 ℃預冷的70%甲醇水內標提取液1 200 μL，靜置提取3 h（每隔30 min 渦30 s）后12 000 r·min-1離心3 min，取上清用0.22 μm 微孔濾膜過濾備用。

1.3.4 GC-MS 供試品制備 取混合后干燥川芎樣品粉末根莖、莖、葉各1 份50 mg 于頂空瓶中，分別加入飽和NaCl溶液1 000 μL、50 μg·mL-1內標溶液10 μL于全自動頂空固相微提取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）進行樣品提取。

1.4 HPLC色譜分析[25]

1.4.1 色譜條件 wondasil C18-WR 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，日本島津公司）；流動相以0.1%磷酸-水為流動相A，甲醇為流動相B 進行梯度洗脫（0～10 min，42%～55%B；10～30 min，55～70%B；30～40 min，70%～80%B；40～45 min，80%B）；柱溫30 ℃；流速：1 mL·min-1；檢測波長：280 nm；進樣量：20 μL。

1.4.2 含量計算 用標準曲線分別計算洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、阿魏酸松柏酯、藁本內酯、歐當歸內酯A的含量：

Y=115.150X-65.450 (R2=0.999 8)

Y=88.693X+286.430 (R2=0.999 0)

Y=38.428X+91.096 (R2=0.999 3)

Y=55.272X-46.158 (R2=0.999 8)

Y=63.699X+18.421 (R2=0.999 8) 。

1.5 LC-MS分析

1.5.1 LC 色譜條件 LC 分析所用色譜柱為SB-C18（1.8 μm，2.1 mm×100 mm，德國Agilent 公司）；0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B）梯度洗脫（0～9 min，5%～95%B；9～10 min，95%B；10～11 min，95%～5%B；11～14 min 5% B）；流速0.35 mL·min-1；柱溫40 ℃；進樣量2 μL。

1.5.2 質譜條件 設置電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）溫度500 ℃；離子噴霧電壓（ion spray voltage，IS）5 500 V（正離子模式）/-4 500 V（負離子模式）；離子源氣體Ⅰ（ion source gas Ⅰ，GSⅠ）344.378 kPa，氣體Ⅱ（ion source gas Ⅱ，GSⅡ）413.685 kPa，氣簾氣（curtain gas，CUR）172.369 kPa碰撞誘導電離參數設置為高。數據采集使用QTRAP 6500+的分段多反應監測模式（multiple reaction monitoring，MRM）模式，分子量掃描范圍50～1 200，碰撞氣體（氮氣）設置為中等。分析在邁維代謝公司（湖北武漢）進行，檢索數據庫為該公司自建數據庫（metware database，MWDB），根據二級譜信息進行物質定性，分析時去除無關的碎片離子的重復信號。

1.6 GC-MS分析

1.6.1 HS-SPME 萃取條件 進樣前將萃取頭在萃取頭調節模塊（Fiber Conditioning Station）中250 ℃下老化5 min。將供試品溶液在60 ℃恒溫條件下，振蕩5 min后，取120 μm DVB/CWR/PDMS 萃取頭插入樣品頂空瓶，頂空萃取15 min，250 ℃下解析5 min，然后進行GCMS分離鑒定。

1.6.2 質譜條件 DB-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Agilent J&W Scientific 公司），載氣為高純氦氣，恒流流速1.2 mL·min-1，進樣口溫度250 ℃，不分流進樣，溶劑延遲3.5 min。程序升溫：40 ℃保持3.5 min，以10 ℃·min-1升至100 ℃，再以7 ℃·min-1升至180 ℃，最后以25 ℃·min-1升至280 ℃，保持5 min。離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，質譜接口溫度280 ℃，電子能量70 eV，掃描方式為選擇離子檢測模式（selected ion monitoring，SIM），定性定量離子精準掃描［26］GC-MS/MS分析在邁維代謝公司（湖北武漢）進行。

1.7 數據分析

采用SIMCA 14.0軟件對6批川芎指紋圖譜中的活性成分進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）。

通過軟件Analyst 1.6.3 處理質譜數據。LC-MS平臺獲得代謝物定量利用三重四級桿質譜的MRM 分析完成，用MultiQuant 3.03 軟件打開樣本下機質譜文件，進行色譜峰的積分和校正工作。GC-MS 平臺通過MassHunter 軟件處理質譜分析后的下機原始數據，用于定性定量分析。對代謝組的定性定量的數據采用R軟件（www.r-project.org/）的內置統計prcomp 函數對數據進行自動標度化（unit variance scaling，UV）處理，對代謝物不同樣本間的積累模式進行層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、PCA 和OPLS-DA分析。選取fold change≥2 和fold change≤0.5 的代謝物為差異代謝物。利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）數據庫對差異代謝物進行注釋［27］。

2 結果與分析

2.1 川芎中主要活性成分含量分析

洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、阿魏酸松柏酯、藁本內酯、歐當歸內酯A 的含量測定結果見表1、圖1。結果顯示，川芎中各活性成分含量多數存在根莖中高于莖、葉的情況，但所有樣品中均未檢測到洋川芎內酯H。洋川芎內酯A 在根莖中均存在，但在莖、葉中含量較少。川芎莖、葉的成分和含量更為相似，活性成分的總含量為0.676%～2.113%，而川芎根莖中的成分含量則存在較大的個體差異，活性成分的總含量范圍波動較大，為5.234%～12.460%。從PCA 和OPLC 分析結果（圖1-B、C）可以看出川芎地上部分的成分和含量更為相似，且可以聚為一類，而川芎根莖中的成分含量則存在較大的個體差異活性。

表1 川芎不同部位活性成分含量Table 1 The content of active ingredients in different parts of L.chuanxiong/%

2.2 川芎的代謝組結果分析

2.2.1 川芎的全譜非靶向代謝組結果分析 川芎的全譜非靶向代謝分析結果表明，川芎根莖、莖、葉共檢出2 942個代謝物，去重后為2 891個代謝物，分為32類（圖2-B、表2），并對代謝物進行熱度分析（圖2-A）。其中，大于100 種代謝物的10 類分別為氨基酸及其衍生物387個、萜類311個、酚酸類247個、酯類205個、雜環化合物199 個、脂質187 個、有機酸169 個、醇和胺類119 個、酮類119 個、黃酮類117 個，共占化合物總數的76.79%。川芎中代謝物總豐度為莖（2.16×1010）＞葉（2.10×1010）＞根莖（2.09×1010）。

圖 1 川芎不同部位的HPLC分析Fig.1 HPLC analysis of different parts of L.chuanxiong

圖2 LC-MS和GC-MS的川芎代謝物檢測結果比較分析Fig.2 Classification and analysis of metabolites of L.chuanxiong on different platforms

表2 川芎不同平臺檢測的代謝物種類豐度Table 2 Metabolites abundance in different platform of L.chuanxiong

LC-MS 平臺檢出18 類共1 726 個代謝物（圖2-C、表2），化合物分子量范圍為61.05～1 088.50，以各種類總豐度1×108為篩選條件，氨基酸及其衍生物、有機酸類、其他類、酚酸類、核苷酸及其衍生物在川芎中均表現出較高的豐度，此外，根中的脂質類化合物豐度較高，葉中脂質類、木脂素和香豆素類、萜類、黃酮類化合物豐度較高。其他類成分中符合篩選條件的為根莖中的糖類（6.41×108）、苯酞類（1.82×108）、糖及醇類（1.49×108）；莖中的糖類（3.31×108）；葉中的糖類（3.43×108）、苯酞類（1.16×108）。GC-MS 平臺檢出16 類共1 216 個代謝物（圖2-D、表2），化合物分子量范圍在68.037～316.24，以1×109為篩選條件篩選出豐度較高的化合物種類，萜類、雜環化合物、酯類在川芎中表現出較高的豐度，此外，烴類在根莖、莖中豐度較高，酮類在葉中豐度較高。

兩個平臺共同檢出代謝物有51 個（圖2-B），主要分布在LC-MS 平臺的酚酸類等6 類，GC-MS 平臺的萜類等9類中，分子量范圍為94.19～226.23，均為極性或弱極性化合物。

2.2.2 基于LC-MS 的川芎不同部位代謝物差異分析 分別對不同部位LC-MS 檢測豐度大于3×107的物質進行分析（電子附表1），結果表明，根莖中豐度較高的化合物有26 個，在其他類（糖類、苯酞類）中有9 個，其中豐度最高的是肌醇半乳糖苷（其他類、糖類）（1.24×108）。莖中豐度較高的化合物有15 個，在核苷酸及其衍生物有4 個，豐度最高的是N-（1-脫氧-1-果糖基）亮氨酸（核苷酸及其衍生物）（1.30×108）。葉中豐度較高的有27個化合物，其中酚酸類有6個，豐度最高的是槲皮素3-（6''-乙酰基葡萄糖苷）（黃酮類）（1.51×108）。川芎中主要活性成分川芎嗪、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、藁本內酯、丁基苯酞、洋川芎內酯A、H、I均在川芎不同部位差異積累，存在根莖＞莖＞葉的趨勢，表明川芎中有效成分的合成和積累主要發生在川芎根莖中。

2.2.3 基于GC-MS 的川芎不同部位代謝物差異分析 分別對不同部位GC-MS 檢測豐度大于2×108的物質進行分析（電子附表2），根莖中豐度較高的代謝物有21個，其中萜類有5 個，豐度最高的是乙硫苯威砜-苯酚（酚類）（8.08×108）。莖中豐度較高的代謝物有20 個，其中萜類有11 個，豐度最高的為4-甲基-1-（1-甲基乙基）-雙環［3.1.0］己-2-烯（烴類）（9.02×108）。葉中豐度較高的代謝物有22 個，其中萜類有15 個，豐度最高的是樟腦（萜類）（6.78×108）。

2.3 川芎的差異代謝物分析

2.3.1 顯著差異代謝物分析 對以上數據進行整合分析，共篩選出川芎不同部位2 471種差異代謝物，由韋恩圖可知，根莖與莖中篩選到顯著差異代謝物1 683個，根莖與葉中篩選到顯著差異代謝物2 054個，莖與葉中篩選到顯著差異代謝物1 844個，根莖、莖、葉共有差異代謝物891種（圖3）。

圖3 川芎中差異代謝物的韋恩圖Fig.3 Venn diagram of chemical constituents in L.chuanxiong

川芎根莖、莖、葉差異代謝物的總豐度如表3所示，為根莖1.66×1010≈莖1.67×1010＞葉1.58×1010，基于LC-MS 檢測到豐度較高的種類為氨基酸及其衍生物、有機酸類、其他類、酚酸類、核苷酸及其衍生物、脂質，其他類成分中豐度較高的為糖類（根莖中6.41×108、莖中3.31×108、葉中3.43×108）、苯酞類（根莖中1.82×108、葉中1.16×108）、糖及醇類（根莖中1.49×108）。基于GC-MS 檢測平臺檢測到豐度較高的種類為雜環化合物、萜類，此外，醌類和烴類在根莖、莖中豐度較高，酮類在葉中豐度較高。

表3 川芎不同平臺差異代謝物種類豐度Table 3 Differential metabolite speciese abundance in different platform of L.chuanxiong

對川芎不同部位差異代謝物進行OPLS-DA 分析，代謝物的差異倍數條形圖和含量差異動態分布圖如圖4所示。根莖與莖中篩選到顯著差異代謝物1 683個，上調代謝物826個，幅度最大的代謝物是1，3-丁二醇；下調代謝物857 個，幅度最大的代謝物是苯甲酸乙酯（圖4-A、D）。根莖與葉中篩選到顯著差異代謝物2 054 個，其中上調代謝物899 個，幅度最大的物質為4-（2，6，6-三甲基-1，3-環己二烯-1-基）-2-丁酮；下調代謝物1 155 個，幅度最大的物質為（E）-α-佛手柑（圖4-B、E）。莖與葉中篩選到顯著差異代謝物1 844個，其中上調代謝物864 個，幅度最大的是Asp-His-Phe-Asp；下調代謝物980 個，下調幅度最大的是（E）-α-佛手柑（圖4-C、F）。

圖4 川芎根莖與莖、葉差異倍數最大的20種代謝物（A～C）和代謝物含量差異動態分布圖（D～F）Fig.4 20 metabolites with the largest up-regulated and down-regulated ratios（A-C）and dynamic distribution of metabolite content differences（D-F）between rhizome and stem and leaf of L.chuanxiong

川芎中活性成分川芎嗪、阿魏酸、藁本內酯、洋川芎內酯A、H、I、O、P 等，均為川芎根莖與葉、根莖與莖、莖與葉的差異代謝物且呈下調趨勢，而少數代謝物如歐當歸內酯A、Z-蒿本內酯二聚體E-232等，則在根莖與莖、根莖與葉、莖與葉中上調。此外，丁基苯酞、洋川芎內酯G、川芎萘呋內酯、阿魏酸松柏酯等代謝物在根莖豐度較高（電子附表3）。

2.3.2 差異代謝物KEGG 分析 利用川芎不同部位的差異代謝物進行KEGG 通路富集和相關通路差異豐度比較結果如圖5所示，有479、477、478個代謝物被分別注釋到川芎根莖與莖、根莖與葉、莖與葉的差異代謝物中相應代謝通路中。其中次生代謝產物的生物合成途徑涉及339 代謝物、119 個差異代謝物，包括氨基酸及其衍生物、有機酸類、酚酸類、酯類等多種化合物，是涉及代謝物最多的途徑。此外，氨基酸的生物合成、ATP 結合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉運途徑、輔助因子的生物合成、苯丙素類生物合成均涉及差異代謝物20 種以上，可以作為川芎不同部位產生化學成分差異的主要研究途徑。

圖5 KEGG差異富集氣泡圖（A～C）和差異豐度得分圖（D～F）Fig.5 Bubble map of KEGG differential enrichment（A-C）and differential Abundance Score of KEGG differential enrichment（D-F）

3 討論

化學成分是藥用植物資源開發和可持續利用的物質基礎，在本研究中，HPLC 分析結果表明，川芎中活性成分為根莖大于莖、葉，但各部位構成的成分相似。本研究進一步在全譜非靶向代謝組學中，LC-MS 檢出1 726 個代謝物，GC-MS 檢出1 216 個代謝物，其中僅有51 個共同檢出的極性或弱極性的代謝物，表明不同的檢測平臺對化合物檢出的適用范圍不同，LC-MS 平臺檢測分子量范圍更大、適用于極性化合物，GC-MS平臺檢測適用于非極性、小分子化合物，因此，多質譜聯用的全譜非靶向代謝組學方法能夠明顯提升代謝組學檢測的覆蓋度，對代謝物深入分析具有明顯優勢。本研究通過全譜非靶向代謝組學共檢出32 類2 891 個代謝物，其中氨基酸及其衍生物、萜類、酚酸類、酯類在各部位中均為主要的代謝物，川芎中根莖、莖、葉中化學成分種類相似、含量差異較大，川芎根莖中氮類化合物、酚類和其他類（糖類、內酯類）化合物高于莖與葉；莖中醇、胺類和醚類高于根莖與葉；葉中萜類、黃酮類、酮類、木質素和香豆素類、酚酸類高于根莖與莖。

在中藥材的生產加工中產生的非藥用部位大多被丟棄，而中藥生產過程的副產物及非藥用部位廢棄物多富含具有增強免疫力、抗菌消炎、助消化及具有營養功能的資源性物質，因此對其進行科學分級管理和精細化利用，已經成為現代研究的迫切問題［28-29］。在川芎各產地均以根莖為主產物，且川芎地上部分產業化程度低、藥用利用較少，造成較大資源浪費。目前，已有研究報道表明，川芎地上部分不具有毒性，安全性高，具有活血、鎮咳、舒張心腦血管、抗氧化等作用［30-31］，本研究結果表明，川芎的地上部分（莖、葉）含有川芎嗪、阿魏酸、藁本內酯等成分，且萜類、黃酮類等活性成分含量高于根莖，具有開發為保健品、飼料添加劑等產品的利用潛力，能夠進一步提高川芎資源的精細化利用率，以促進川芎產業的多元化綠色發展。

4 結論

本研究采用LC-MS 和GC-MS 的全譜非靶向代謝組學，對川芎不同部位的代謝物進行研究，并探究了其積累規律及差異性。結果表明，相較于單一平臺的代謝組學，全譜非靶向代謝組學能更全面地反映出川芎中不同種類的代謝物。川芎的根莖、莖、葉中均含有不同的高豐度化合物種類，根莖中富集含氮化合物、酚類、其他類，莖中的醇、胺類、醚類高度富集，葉中的萜類、酮類、黃酮類高度富集，且上述化學成分差異與次生代謝產物的生物合成等途徑密切相關。

電子附表1 LC-MS檢測根莖、莖、葉中代謝物中高豐度的代謝物質Electronic Tables 1 Metabolites with high abundances in rhizomes，stems and leaves detected by LC-MS