神經生長因子及其受體在高原牦牛與平原黃牛端腦中的比較分析

吳亞娟 杜曉華，* 劉 霞 鄭麗平 劉珊珊

（1甘肅農業大學動物醫學院，甘肅 蘭州 730070；2甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070）

神經生長因子（nerve growth factor，NGF）是神經營養因子家族中最早被發現的成員之一［1］，是一種分泌型糖蛋白，主要通過與高親和力受體酪氨酸蛋白激酶A（tyrosine protein kinase A，TrkA）結合調節神經元的生長發育、存活及再生［2］。有研究表明，當中樞神經系統發生缺血性腦損傷時，NGF 與其受體TrkA 可通過表達上調對受損組織或細胞進行修復，對機體發揮神經保護作用，同時也在維持神經系統的動態平衡中發揮著重要作用［3-4］，此外，NGF 可通過刺激血管內皮生長因子和其他血管活性因子促進血管生成，增加供氧量對缺氧神經元進行保護［5-6］。有研究顯示，當NGF 及其受體TrkA 異常表達時，在臨床上常引發糖尿病［7-9］、抑郁癥［10］以及阿爾茨海默癥［11-12］等疾病。

端腦又稱大腦，是腦組織中占比最大、結構最復雜的部分［13］。其大腦皮質在機體認知、情緒、感覺及運動方面發揮著重要作用，海馬則在情緒處理及記憶方面起著重要作用。有研究證實，哺乳動物大腦中的皮層和海馬，功能一旦受損，就會出現癲癇、抑郁以及精神分裂癥等多種神經系統疾病［14］。牦牛（Bosgrunniens）因生存環境的特殊性形成了獨有的低氧適應機制，研究發現，因缺氧引起腦功能紊亂時，NGF可促進神經膠質細胞增殖對缺氧進行抵抗［14］。同時，NGF 通過表達上調激活受體TrkA，構成NGF-TrkA 調控系統，在大腦缺血缺氧方面發揮內源性神經保護作用［15］。目前，有關NGF 及其受體TrkA 在牛屬動物體內的研究仍局限于水牛和牦牛的生殖器官，以及牦牛的心、肝、脾、肺、腎等部位［16-17］，而在牦牛中樞神經系統器官和組織中的研究尚鮮見報道。

鑒于此，本研究以高原牦牛腦組織為研究對象，針對其端腦部位，采用免疫組織化學技術（immunohistochemistry，IHC）、實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）以及蛋白免疫印跡技術（Western Blot，WB）對NGF 及其受體TrkA 在牦牛端腦各區的分布及表達特征進行研究，并與平原黃牛比較，旨在探討NGF和TrkA在牦牛端腦不同區域分布規律、表達水平與低氧環境之間的關聯，為進一步探究牦牛適應高原低氧環境提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品的選取

于甘肅省甘南藏族自治州合作市及河南省鄭州市某屠宰場，分別隨機選取5 頭健康的成年甘南牦牛與南陽黃牛，其中牦牛所處區域平均海拔高度為2 960 m，黃牛所處區域平均海拔高度為108 m，待屠宰后迅速開顱取出完整的腦組織，并分區采集端腦組織樣品，包括大腦皮質（額葉皮質、顳葉皮質、頂葉皮質及枕葉皮質）、大腦白質、海馬及胼胝體等組織，分別投入液氮和4%多聚甲醛中保存備用。

1.2 主要試劑與儀器

TriQuick Reagent 總RNA 提取試劑，蘭州科寶生物科技有限公司；Evo M-MLV 反轉錄試劑盒，湖南艾科瑞生物工程有限公司；神經生長因子多克隆抗體（rabbit anti-NGF polyclonal antibody，DF6061），江蘇親科生物研究中心有限公司；酪氨酸蛋白激酶受體A多克隆抗體（rabbit anti-TrkA polyclonal antibody，bs-0193R）、β-肌動蛋白（內參對照）多克隆抗體［rabbit anti-β-Actin（Loading Control）polyclonal antibody，bs-0061R］、二抗辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG HRP（goat anti-rabbit Ig G/HRP，bs-0295G-HRP），北京博奧森生物技術有限公司；鏈霉卵白素—生物素法檢測（streptavidin peroxidase，SP）試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司；增強型HRP-二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）底物顯色試劑盒，北京天根生化科技有限公司；增強型化學超敏發光液（enhanced-chemiluminescence，ECL），北京索萊寶科技有限公司。LightCycler96 PCR 儀，德國瑞士Roche 公司；冷凍型高通量組織研磨儀，寧波新芝生物公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 IHC 染色定位 將包埋好的石蠟塊用切片機切成厚度為4 μm的切片，經展片、捻片及烘片處理后，放置于切片架上依次經二甲苯、苯酒（二甲苯與無水酒精配比為1∶1）、無水酒精、95%酒精、80%酒精進行脫蠟復水，后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）沖洗，再將切片架放入已沸騰的檸檬酸鹽緩沖液中進行抗原修復處理，并依次滴加內源性過氧化物酶阻斷劑和山羊血清工作液進行阻斷封閉，隨后滴加以1∶100 稀釋好的NGF 與TrkA 一抗，置于4 ℃冰箱過夜孵育，其中部分組織用PBS 以代替一抗，作為陰性對照，再依次滴加生物素標記山羊抗兔IgG 和辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育，洗滌后滴加現配的DAB 顯色液進行顯色觀察，待出現黃棕色時立即終止，后經常規脫水透明后用中性樹膠封片，晾干后用光學顯微鏡觀察拍照并留存備用。

1.3.2 qRT-PCR 檢測 將凍存于液氮中的端腦組織迅速取出置于冰盒上，分別稱取約0.2 g左右的組織樣品于5 mL 離心管中，加入TriQuick Reagent 總RNA 提取試劑后置于提前預冷的高通量組織研磨儀中充分研磨后，進行常規的分離沉淀操作。將提取得到的總RNA經測濃度后依次進行定量，根據Evo M-MLV 反轉錄試劑盒的操作步驟進行cDNA 反轉錄，并進行qRTPCR，反應體系20 μL：SYBR High-Sensitivy qPCR SuperMix 10 μL、0.2 μmol·mL-1上下游引物各1 μL、300 ng·μL-1模板cDNA 1 μL、ddH2O 7 μL。反應程序：50 ℃預熱2 min；95 ℃預變性1 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火45 s，40個循環。每個樣品重復3次，結果取平均值，采用2-ΔΔCt定量分析法計算NGF和TrkA基因的相對表達量。根據NCBI 已有的牦牛NGF（NM_001099362.1）、牦牛TrkA（XM_024989929.1）、牦牛β-actin內參基因（NM_173979.3）序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設計引物，由上海生物工程股份有限公司合成，引物信息見表1。

表1 qRT-PCR引物信息Table 1 Information for qRT-PCR primers

1.3.3 WB 檢測 將凍存于液氮中的端腦組織迅速取出置于冰盒上，分別稱取約0.2 g的組織樣品于5 mL離心管中，加入RIPA 組織快速裂解液（RIPA lysis buffer）置于已預冷的高通量組織研磨儀中充分研磨，經冰浴裂解及離心后，取120 μL上清液，與40 μL 4×蛋白上樣緩沖液混合，放置于金屬浴中95 ℃變性10 min，冷卻至室溫，經聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）后根據指示標記（marker）切膠轉膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，接著加入以1∶700 稀釋的NGF 與TrkA 一抗，β-actin 則以1∶3 000 稀釋，4 ℃過夜孵育，磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffered solution+Tween-20，PBST）洗滌后加入以1∶5 000 稀釋的二抗，室溫孵育2 h，PBST緩沖液充分洗滌，用ECL 在化學發光成像系統中曝光，獲取蛋白條帶。

1.4 數據統計分析

使用SPSS 20.0 軟件對NGF和TrkA基因與其蛋白相對表達結果進行單因素方差分析（ANOVA），所有數據均采用“平均值±標準差（Mean ± SD）”表示，并采用GraphPad Prism 5.0進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 IHC染色定位結果

2.1.1 NGF 及其受體TrkA 蛋白在牦牛端腦不同區域中的表達與分布 經免疫組織化學染色檢測發現（圖1），NGF 和TrkA 陽性細胞在牦牛端腦中的分布及定位趨勢一致。在額葉皮質、顳葉皮質、頂葉皮質及枕葉皮質構成的大腦皮質區域中，NGF 和TrkA 蛋白主要在馬丁諾提（Martinotti）細胞、顆粒細胞的胞質以及神經膠質細胞中表達；大腦白質中，NGF 和TrkA 蛋白主要在神經膠質細胞中表達；海馬中，NGF 和TrkA 蛋白主要在錐體細胞層中表達，在多型細胞層和分子細胞層少量表達；胼胝體中，NGF 和TrkA 蛋白主要定位于多型細胞胞質和神經膠質細胞。其中，陰性對照均無免疫陽性表達。

圖1 牦牛端腦不同區域中NGF和TrkA蛋白分布Fig.1 Distribution of NGF and TrkA proteins in different regions of the yaks telencephalon

圖2 黃牛端腦不同區域中NGF和TrkA蛋白分布Fig.2 Distribution of NGF and TrkA proteins in different regions of the cattles telencephalon

2.1.2 NGF 及其受體TrkA 蛋白在黃牛端腦不同區域中的表達與分布 經免疫組織化學染色檢測發現，與牦牛相似，NGF 和TrkA 陽性細胞在黃牛端腦中的分布及定位趨勢一致。大腦皮質各區域中，NGF 和TrkA 蛋白主要在Martinotti 細胞、顆粒細胞胞質以及神經膠質細胞中表達；大腦白質中，NGF 和TrkA 蛋白則主要在神經膠質細胞中表達；海馬中，NGF 和TrkA 蛋白主要在錐體細胞層中表達，在多型細胞層和分子細胞層少量表達；胼胝體中，NGF 和TrkA 蛋白主要定位于多型細胞胞質和神經膠質細胞。其中，陰性對照均無免疫陽性表達。

2.1.3 NGF 及其受體TrkA 蛋白在牦牛與黃牛端腦中表達與分布的比較結果 NGF 和TrkA 蛋白在牦牛端腦各區域中的分布及定位趨勢與黃牛基本一致，但二者在端腦各區域中的免疫陽性反應強度整體為牦牛強于黃牛（圖1、2）。

2.2 qRT-PCR檢測結果

經qRT-PCR 檢測發現，牦牛端腦內NGFmRNA在頂葉皮質和顳葉皮質中表達量最高，且顯著高于其他組織（P＜0.05），其次分別為枕葉皮質、額葉皮質、海馬、胼胝體和大腦白質，除頂葉皮質與顳葉皮質差異不顯著外，其余區域間表達差異顯著（P＜0.05，圖3）；黃牛端腦內NGFmRNA 在額葉皮質中表達量最高，顯著高于其他組織（P＜0.05），其次分別為頂葉皮質、枕葉皮質、顳葉皮質、海馬、大腦白質、胼胝體，其中海馬與大腦白質之間差異不顯著，其余區域間表達差異顯著（P＜0.05，圖3）。NGFmRNA 僅在額葉皮質、枕葉皮質及大腦白質中的表達量為牦牛低于黃牛或與黃牛無顯著差異，而在其余區域中表達量均為牦牛顯著高于黃牛。

圖3 牦牛與黃牛端腦不同區域中NGF基因的表達情況Fig.3 The expression of NGF gene in different regions of the yaks and cattles telencephalon

牦牛端腦內TrkAmRNA 在海馬中表達量最高，且顯著高于其他組織（P＜0.05），其次分別為頂葉皮質、枕葉皮質、胼胝體、顳葉皮質、額葉皮質和大腦白質，其中除胼胝體與顳葉皮質之間表達不顯著外，其余區域間表達差異均顯著（P＜0.05，圖4）；在黃牛頂葉皮質和海馬中表達量最高，顯著高于其他組織（P＜0.05），其次分別為枕葉皮質、胼胝體、顳葉皮質、額葉皮質、大腦白質，其中頂葉皮質和海馬之間差異不顯著，其余區域間表達差異顯著（P＜0.05，圖4）。TrkAmRNA 僅在大腦白質中表達量為牦牛與黃牛無顯著差異，其余區域中表達量均為牦牛顯著高于黃牛。

圖4 牦牛與黃牛端腦不同區域中TrkA基因表達情況Fig.4 The expression of TrkA gene in different regions of the yaks and cattles telencephalon

2.3 WB檢測結果

經WB 檢測發現，牦牛端腦內NGF 蛋白在頂葉皮質中表達量最高，且顯著高于其他組織（P＜0.05），其次為顳葉皮質、枕葉皮質、額葉皮質、海馬、胼胝體、大腦白質，其中胼胝體和大腦白質之間差異不顯著，其余區域間表達差異顯著（P＜0.05，圖5）；在黃牛額葉皮質和頂葉皮質中表達量最高，顯著高于其他組織（P＜0.05），其次分別為枕葉皮質、顳葉皮質、海馬、大腦白質、胼胝體，其中額葉皮質與頂葉皮質、顳葉皮質與海馬之間表達差異不顯著，其余區域間表達差異均顯著（P＜0.05，圖5）。與黃牛相比，NGF 蛋白在大腦白質中的表達量為牦牛低于黃牛，其他區域中表達量均為牦牛顯著高于黃牛。

圖5 牦牛與黃牛端腦不同區域中NGF蛋白表達情況Fig.5 Expression of NGF protein in different regions of the yaks and cattles telencephalon

牦牛端腦內TrkA 蛋白在海馬中表達量最高，且顯著高于其他組織（P＜0.05），其次分別為頂葉皮質、枕葉皮質、胼胝體、顳葉皮質、額葉皮質、大腦白質，且彼此之間表達差異顯著（P＜0.05，圖6）；在黃牛海馬中表達量亦為最高，也顯著高于其他組織（P＜0.05），其次依次為額葉皮質、頂葉皮質、枕葉皮質、大腦白質、胼胝體、顳葉皮質，其中枕葉皮質與大腦白質之間無顯著差異，其余區域間表達差異顯著（P＜0.05，圖6）。與黃牛相比，TrkA 蛋白在額葉皮質和大腦白質表達量為牦牛低于黃牛，在枕葉皮質中表達量與黃牛間差異不顯著，其余區域中表達量均為牦牛顯著高于黃牛。

圖6 牦牛與黃牛端腦不同區域中TrkA蛋白表達情況Fig.6 Expression of TrkA protein in different regions of the yaks and cattles telencephalon

3 討論

NGF 存在于中樞神經系統中，通過結合高親和力受體TrkA 可激活與神經元存活和分化相關的下游通路［18］，參與協調神經內分泌及晝夜節律性活動［16，19-20］，且廣泛分布在中樞神經系統的基底前腦、皮質及海馬區域［21-22］，這與本研究中NGF和TrkAmRNA 及蛋白在牦牛與黃牛端腦不同區域均有表達的結果一致，表明NGF 和TrkA 在端腦各區域對睡眠及覺醒等生理活動具有重要的調控作用。此外，Liu 等［23］通過研究發現，NGF 在正常大腦各區域中廣泛分布，但在大腦皮質和海馬中明顯高表達，與本研究NGF 在牦牛與黃牛大腦皮質和海馬中高表達的結果一致，由此推測其高表達與NGF 自分泌途徑激活有關，通過上調NGF 的表達量去維持大腦皮質和海馬涉及情緒認知及學習記憶相關功能的正常運行。Sofroniew 等［3］研究發現，NGF 表達受缺血缺氧影響而上調。本研究結果發現，除了大腦白質外，NGF 在牦牛端腦其他區域中表達水平顯著高于黃牛，推測上述結果與牦牛的低氧適應性有關，即牦牛能夠通過上調NGF 表達量以增強端腦組織對低氧的耐受性。此外，本研究發現NGF 在牦牛端腦的皮質區域中表達量最高，其次為海馬，這與黃英［24］對I125-NGF在缺氧新生鼠腦內的吸收分布研究中的描述不一致，推測這種差異與動物機體缺氧周期有關，對于長期處于低氧狀態的牦牛，內源性NGF 可能在其端腦各部的神經通路中相互聯動，以維持端腦各區域的穩態平衡。

TrkA 是由原癌基因酪氨酸蛋白激酶編碼的一種可跨膜蛋白，是NGF 的功能性受體［25］，NGF 通過與膜受體TrkA 結合在胞內磷酸化，繼而激活并發揮生物學活性［26］。有研究表明，NGF及其受體TrkA的表達在中樞神經系統中同步升高，可以有效改善機體的記憶和認知功能［27］，結合本研究結果發現，兩種因子在端腦部分區域中表達的同步性可能也與改善機體記憶及認知有關。此外，本研究發現，NGF在牦牛端腦的皮質區域中表達量最高，TrkA 在牦牛海馬中表達量最高；而楊傳紅等［28］關于內源性NGF 在缺血性老年大鼠部分腦區及小腦中的表達研究中發現，在中樞神經系統中對缺血敏感的區域是海馬、大腦皮質以及小腦蒲肯野細胞，提示大腦皮質和海馬是牦牛端腦組織中對低氧最為敏感的區域。牦牛與黃牛相比，TrkAmRNA 除了在牦牛大腦白質中表達量與黃牛無差異之外，在其他區域中表達量均顯著高于黃牛；TrkA 蛋白則在枕葉皮質中表達量與黃牛無差異，在額葉皮質和大腦白質中表達量均低于黃牛，在其他區域表達量顯著高于黃牛，推測這可能與TrkA 受體膜表面運輸通路有關，以網絡蛋白依賴的內吞途徑進入胞質的TrkA 蛋白與溶酶體結合后被降解［29］，進而導致TrkAmRNA 和蛋白表達具有差異。

免疫組化結果顯示，NGF在大腦皮質、海馬及胼胝體各區域主要分布在神經元胞質中，大腦白質中NGF主要分布在神經膠質細胞中，這與前人的研究結果一致［30-31］，說明NGF和TrkA對端腦的神經保護作用主要依賴于以上神經元及神經膠質細胞的存活去維持中樞神經系統的內環境穩定，同時也參與神經系統抗損傷過程。TrkA 蛋白在牦牛與黃牛端腦中的分布與定位特征與NGF 蛋白相似，提示二者可能在功能上具有協同性。此外，有研究表明，NGF陽性表達隨腦缺血時長而增強［32］，本研究發現，牦牛端腦各區中NGF 和TrkA蛋白免疫陽性反應強度整體強于黃牛，推測這一現象可能與牦牛低氧適應性有關，在長期的低氧刺激下，上述細胞被激活并大量產生NGF，進而誘導受體TrkA 磷酸化，及時糾正因低氧所導致的腦功能紊亂，協同對端腦各區域進行神經保護作用。

4 結論

本研究在成年牦牛與黃牛端腦組織中檢測了NGF及其受體TrkA的表達和分布。結果表明，NGF和TrkA主要依賴于端腦組織中的神經元及神經膠質細胞發揮內源性神經保護作用同時經牦牛與黃牛對比研究發現，NGF 和TrkA 除了共同參與調控動物機體正常的生理活動之外，在受到低氧刺激時，也可通過表達上調以增強牦牛端腦組織對低氧的耐受性。