膠原蛋白Ⅴ型2鏈對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲及腫瘤生長的調控作用

仇建玲，吳勝文，俞進友，朱正峰

作者單位：揚州大學建湖臨床醫學院，江蘇 鹽城 224700

胃癌（GC）是一種常見的消化道惡性腫瘤，其全球發病率排名第5 位，病死率排名第2 位［1-2］。隨著醫療技術的發展，該病通過手術切除聯合放療、化療治療，病人的生存期明顯得到延長。但是，晚期或轉移病人的預后仍不令人滿意。由于早期胃癌的癥狀不明顯，缺乏特異的診斷方法，大多數病人確診時已中晚期，錯失手術切除的機會。因此，鑒別胃癌中異常表達的關鍵基因是早期診斷、治療胃癌病人的重要途徑。膠原蛋白是細胞外基質的主要成分，膠原Ⅴ型α2 鏈（COL5A2）則為膠原蛋白家族的重要成員［3-4］。COL5A2 參與免疫系統調節、血管生成和腫瘤轉移，在結直腸癌、乳腺癌和骨肉瘤的發生發展中具有一定作用［5-7］。近兩年，COL5A2在胃癌中的功能不斷被挖掘，但是其對胃癌細胞的惡性細胞表型變化的作用尚未清楚。本研究推測，COL5A2 可能是胃癌的潛在生物標志物和治療靶點，于2022 年1—3 月開展研究COL5A2 對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲及腫瘤生長的調控作用，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料15只SPF雄性裸鼠［BALB/c-nu，5～6周，（18±2）g］購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

正常人胃黏膜上皮細胞GES-1、胃癌細胞MGC-803 、MKN-45 、SGC7901 均購自中國科學研究院上海細胞庫；慢病毒表達載體pHBLV-U6-MCS-CMVZsGreen-PGK-PURO、慢病毒包裝載體均購自漢恒生物科技（上海）有限公司；碘化丙啶（PI）染液購自美國Sigma 公司；熒光定量聚合酶鏈式反應（qRTPCR）試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；CCK8 試劑盒、5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（EdU）細胞增殖檢測試劑盒均購自日本TAKERA 公司；實時熒光定量 PCR 系統購自美國ABI 公司；多功能凝膠成像系統購自美國BIO-RAD；Beckman Lab Quanta SC 型流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1細胞的培養 GES-1、MGC-803、MKN-45、SGC7901 細胞在37 ℃的飽和濕度5%二氧化碳的恒溫細胞培養箱中培養，所有培養液為DMEM 培養基（含有10%胎牛血清+1%雙抗）。常規檢測支原體污染評估，每2天更換一次培養基。

1.2.2細胞分組與處理 根據Gene ID： 1290，NCBI參考序列：NC_000002.12的COL5A2基因的SD 序列在siDirect 2.0 中設計、篩選COL5A2 的干擾序列（CAGAAGAATGGTACAAATCCAAG），正向序列：5′UGGAUUUGUACCAUUCUUCUG3′反向序列5′GAAGAAUGGUACAA AUCCAAG3′。將酶切后的干擾載體pHBLV-U6-MCS-CMV- ZsGreen-PGKPURO 與干擾COL5A2 連接，插入感受態，菌液鑒定后擴大培養，抽提質粒。然后進行慢病毒的包裝，將質粒與慢病毒包裝輔助質粒（psPAX2 載體和pMD2G 載體）進行高度提取，轉染至293T 細胞，培養48 h 后，收集上清濃縮純化，獲得高滴度的慢病毒溶液。將沉默COL5A2 的慢病毒轉染至MKN-45細胞，在37 ℃，5%二氧化碳細胞培養箱中培養8 h，更換新培養基繼續培養48 h，RT-qPCR、WB 實驗驗證沉默效率，設為shRNA 組、shRNA-COL5A2 組。未轉染的MKN-45 細胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中培養，設為NC組。

1.2.3COL5A2 在胃癌中的數據挖掘 在starbase中的panGene Diff Exp 搜索COL5A2 在胃癌STAD 中的表達。GEPIA 檢索COL5A2 在胃癌“STAD”中的表達及對胃癌分期、生存的預測。

1.2.4COL5A2 表達檢測 qRT-PCR 實驗、WB 實驗檢測不同組細胞中COL5A2 的mRNA 和蛋白表達水平。qRT-PCR 實驗：對數期的細胞用0.25%胰酶消化，收集，用TRIzol液提取總RNA。在RNA 分離后，將10 μg 總RNA 與2 U/μg RNase R 在37 ℃下培養45 min。隨后使用RNA 濃縮、回收試劑盒對產品進行純化，并以純化的產物為底物合成cDNA。用RT-qPCR 試劑盒檢測cDNA 中COL5A2 的表達。GAPDH 做內源內參，2-ΔΔCt法計算結果。COL5A2：正向，AACATCAGTTGGGTGGAG，反向，CTTGAAATCGGTGTAGGC；GAPDH：正向，ATCCGATT ACCGATACCTAGACC，反向，ATGGACTATATCCGACGACGA。

蛋白質印跡實驗：胰酶消化對數生長期細胞，收集。用RIPA 裂解液、超聲裂解充分裂解細胞，提取總蛋白。DC 蛋白測定檢測蛋白濃度，加樣前100 ℃變性5 min。分離凝膠、濃縮凝膠使用6%～15%濃度的聚丙烯酰胺配置，灌膠。電泳時，開始用80 V電壓10 min，然后繼續使用120 V電壓1.5 h，最后用25 V 電壓電泳2 h。結束后，用轉膜儀濕轉至PVDF 膜，再用5%的脫脂乳封閉液室溫封閉2 h。在4°C 的低溫條件下將膜與一抗溶液（兔抗COL5A2多抗，1∶1 000；兔抗CyclinD1、CDK4 多抗，1∶1 500）孵育過夜。在室溫下與500倍稀釋的HRP標記的二抗孵育1 h。Image Lab 圖像采集和分析軟件分析條帶強度。

1.2.5細胞增殖檢測 克隆形成實驗、CCK8 實驗、EdU染色檢測細胞的增殖情況。

克隆形成實驗：將各組細胞以1 000 個細胞/孔的密度接種6孔細胞培養皿。細胞培養15 d，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定20 min，1%結晶紫染色30 min。在顯微鏡視野內隨機選擇的5 個區域進行菌落計數。

CCK8實驗：將各組細胞以5×103個細胞/孔的濃度接種到96 孔板中。然后在490 nm 處檢測光密度（OD490）。

EdU 染色細胞增殖檢測：使用EdU 檢測試劑盒檢測細胞的增殖能力。將大約105個細胞接種到24孔培養皿，并與DMEM 培養基孵育24 h。每個孔加入400 μL 的EdU 培養液（50 μmol/L），37 °C 培養4 h。用PBS 洗滌2 次，將細胞用150 μL 的4%多聚甲醛固定30 min，用150 μL 的甘氨酸（2 g/L）脫色5 min，并在脫色搖床中用0.5%Triton X-100 滲透10 min。將每個孔中的細胞依次與400 μL 1×Apollo 染色溶液和400 μL 1×Hoechst3342 溶液在黑暗中反應30 min。最后，熒光顯微鏡下捕獲細胞圖像，并使用Image J軟件計算EdU陽性率。

1.2.6細胞周期分布檢測 PI 染色檢測細胞周期分布：0.25%的胰酶消化細胞，用4 ℃的PBS 溶液懸浮，制成單細胞懸液。用70%乙醇溶液4 ℃固定 30min，避免細胞成塊，需保持單懸液。RNase A 去除多余的RNA。加入PI 染色（50 mg/L），避光染色30 min。上流式細胞儀進行細胞周期的分布檢測，Summit 4.0分析實驗結果。

1.2.7細胞遷移侵襲檢測 Transwell 實驗、傷口愈合實驗檢測細胞的遷移、侵襲能力。

Transwell 法檢測細胞遷移、侵襲。將各組細胞用無血清培養基饑餓培養12 h，按照每孔1×104個細胞（100 μL）的密度，將細胞接種在Transwell 小室（8 μm 孔徑）上室。將600 μL 含有20%胎牛血清的培養基放入下室，把細胞放在培養箱中培養24 h。取出培養箱，用棉簽擦拭未穿膜的細胞，將附著于膜下表面的細胞用90%乙醇固定10 min，0.1%結晶紫染色5 min，PBS 沖洗3 次，倒置顯微鏡下拍照，隨機選擇5個區域進行細胞計數。

傷口愈合實驗：將各組細胞接種在6孔培養板，每孔1×105個細胞，用不含血清的培養基在37 ℃，5%二氧化碳的條件下培養24 h。然后，在每個孔的底部用200 μL 的無菌槍頭垂直底部直徑劃線。測量劃痕寬度，并記錄為0 h（mm）。將培養液更換為新鮮的無血清培養基，繼續培養24 h，再次測量，并記錄劃痕寬度24 h（mm）。劃痕愈合率的公式為（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.8裸鼠成瘤實驗 將裸鼠采用隨機數字表法分為3 組，每組5 只，標記為NC 組、shRNA 組、shRNA-COL5A2 組。將各組細胞用PBS 溶液收集，皮下注射至小鼠左腋窩下，每只106個細胞（1 mL）。第7、14、21、28 d 測量一次腫瘤體積（最長直徑mm×最短直徑mm）。實驗結束時處死所有小鼠，解剖并稱腫瘤質量（g）。該方案符合一般動物實驗倫理學原則。腫瘤組織用4%多聚甲醛保存。

1.2.9免疫組織化學實驗檢測腫瘤組織PCNA 蛋白 取出固定12 h 的腫瘤組織，制作石蠟切片。石蠟切片在二甲苯中脫蠟，然后依次用無水乙醇、90%乙醇、70%乙醇各處理5 min。置于95 ℃的3%EDTA（pH 8.0）溶液中加熱10 min 進行抗原熱修復。然后用20%的山羊血清室溫封閉30 min，再與500倍稀釋的鼠PCNA單抗37 ℃孵育1 h，HRP標記的山羊抗鼠二抗（含0.05%的吐溫-20）37 ℃孵育1 h，DAB 顯色，蘇木精復染。流水沖洗后，脫水、透明、封片，200倍顯微鏡下觀察、拍照。

1.3 統計學方法SPSS26.0、Graphpad Prism 8.0 分析實驗數據、繪制圖片。每個實驗重復3次，每次做3 個平行復孔。實驗中的數據均為計量資料，±s表示，行單因素方差分析F檢驗和獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 COL5A2在胃癌中的表達與正常組織相比，胃腺癌組織中COL5A2 表達水平明顯升高（P＜0.05）見表1；STADⅡ～Ⅳ期胃腺癌組織COL5A2表達水平顯著高于Ⅰ期（P＜0.05）；見表2，TCGA 數據庫分析散點圖顯示胃腺癌組織中COL5A2表達水平明顯高于正常組織（圖1A）。與COL5A2 高表達組相比，COL5A2 低表達組的STAD 病人其總生存率［LogrankP=0.0074，HR=2，P=0.009 5］顯著升高，見圖1B。與GES-1 細胞相比，MGC-803、MKN-45、SGC7901 細胞中COL5A2 的mRNA 和蛋白表達均顯著升高（P＜0.05），見圖2和表3。

圖1 COL5A2在胃癌組織中的表達：A為TCGA數據庫分析COL5A2在STAD中的表達；B為COL5A2水平與存活率的相關性

圖2 胃癌細胞COL5A2蛋白表達

表1 胃腺癌組織與正常組織COL5A2表達情況/± s

表1 胃腺癌組織與正常組織COL5A2表達情況/± s

組別胃腺癌組織正常組織t值P值組織數/個375 32 COL5A2表達4.74±0.45 2.53±0.26 27.37＜0.001

表2 不同STAD分期胃腺癌組織COL5A2表達比較/± s

表2 不同STAD分期胃腺癌組織COL5A2表達比較/± s

STAD分期Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期Ⅳ期F值P值例數34 100 188 53 COL5A2表達4.26±0.38 4.80±0.46 4.78±0.44 4.78±0.45 14.64＜0.001

表3 COL5A2在胃癌細胞MGC-803、MKN-45 、SGC7901中的表達/± s

表3 COL5A2在胃癌細胞MGC-803、MKN-45 、SGC7901中的表達/± s

注：①與GES-1組相比，P＜0.05。

組別GES-1 MGC-803 MKN-45 SGC7901 F值P值COL5A2 0.25±0.04 0.47±0.05①0.72±0.08①0.54±0.04①112.36＜0.001重復次數9 9 9 9 COL5A2 mRNA 1.03±0.20 2.38±0.48①5.17±0.36①4.86±0.44①240.88＜0.001

2.2 沉默COL5A2 穩轉MKN-45 細胞模型構建及對細胞增殖的影響與shRNA 組細胞相比，shRNACOL5A2 組細胞COL5A2 的mRNA 和蛋白表達均顯著降低，克隆形成細胞數顯著降低，細胞在48、72 h的活性顯著降低，EdU 陽性率顯著降低（P＜0.05），見表4，圖3。

圖3 5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（EdU）染色細胞圖(×200)

表4 沉默COL5A2的MKN-45細胞活性檢測/± s

表4 沉默COL5A2的MKN-45細胞活性檢測/± s

注：①與shRNA組相比，P＜0.05。

組別NC組shRNA組shRNA-COL5A2組F值P值重復次數COL5A2 mRNA 1.05±0.16 1.05±0.12 0.46±0.06①71.86＜0.001 COL5A2 0.64±0.06 0.63±0.05 0.21±0.07①147.85＜0.001克隆形成細胞數/個227.09±14.87 224.34±22.60 82.81±7.42①233.63＜0.001細胞活性（OD490）24 h 0.24±0.05 0.25±0.04 0.24±0.05 0.14 0.873 48 h 0.46±0.04 0.46±0.03 0.32±0.06①29.92＜0.001 72 h 0.94±0.06 0.96±0.07 0.53±0.05①144.57＜0.001 EdU陽性率/%68.81±6.07 59.57±6.50 36.36±2.89①86.30＜0.001 9 9 9

2.3 沉默COL5A2 基因表達胃癌細胞周期和周期相關蛋白表達的影響與shRNA 組細胞相比，shRNA-COL5A2 組細胞在G1 期明顯降低，S 期明顯升高，CyclinD1 和CDK4 的表達蛋白均顯著降低（P＜0.05），見圖4和表5。

圖4 CyclinD1、CDK4的蛋白表達

表5 沉默COL5A2誘導胃癌細胞周期阻滯和抑制CyclinD1和CDK4蛋白表達/± s

表5 沉默COL5A2誘導胃癌細胞周期阻滯和抑制CyclinD1和CDK4蛋白表達/± s

注：①與shRNA組相比，P＜0.05。

組別NC組shRNA組shRNA-COL5A2組F值P值重復次數細胞周期CDK4 0.46±0.05 0.46±0.05 0.23±0.04①72.14＜0.001 S G1 68.47±2.18 69.12±2.51 55.79±1.87①104.82＜0.001 G2 18.71±1.79 17.72±2.11 18.10±2.12 0.55 0.582 9 9 9 12.25±1.99 12.27±2.05 21.59±3.71①35.73＜0.001 CyclinD1 0.52±0.07 0.54±0.05 0.25±0.03①85.34＜0.001

2.4 沉默COL5A2 對胃癌細胞遷移和侵襲的影響與shRNA 組細胞相比，shRNA-COL5A2 組細胞遷移數量和侵襲數量均顯著降低，劃痕愈合率也顯著降低（P＜0.05），見表6。

表6 沉默COL5A2對胃癌細胞遷移和侵襲的影響/± s

表6 沉默COL5A2對胃癌細胞遷移和侵襲的影響/± s

注：①與shRNA組相比，P＜0.05。

組別NC組shRNA組shRNA-COL5A2組F值P值重復次數9 9 9遷移數/個230.70±17.01 217.74±34.76 112.03±12.80①68.86＜0.001侵襲數/個124.26±11.57 116.16±6.30 41.51±11.18①188.20＜0.001劃痕愈合率/%83.16±3.16 83.81±5.97 66.07±3.94①44.68＜0.001

2.5 沉默COL5A2 基因表達對胃癌細胞移植瘤大小的影響與shRNA 組細胞相比，shRNA-COL5A2組裸鼠成瘤在14、21、28 d 的體積明顯降低，腫瘤的重量也顯著降低，組織中PCNA 蛋白顯著降低（P＜0.05），見表7，圖5。

圖5 裸鼠成瘤圖

表7 沉默COL5A2基因對胃癌細胞體內移植瘤的影響/± s

表7 沉默COL5A2基因對胃癌細胞體內移植瘤的影響/± s

注：①與shRNA組相比，P＜0.05。

組別NC組shRNA組shRNA-COL5A2組F值P值體積/mm3 PCNA 0.74±0.05 0.72±0.08 0.29±0.05①153.08＜0.001重復次數5 5 5 7 d 30.42±1.84 27.41±3.15 29.48±2.89 2.96 0.071 14 d 178.63±13.33 177.40±16.43 148.65±7.62①15.37＜0.001 21 d 433.57±31.38 411.74±31.01 320.99±17.63①42.64＜0.001 28 d 604.92±93.81 648.84±70.21 415.94±32.82①27.93＜0.001質量/g 0.82±0.05 0.83±0.08 0.34±0.07①153.46＜0.001

3 討論

細胞外基質是人體組織微環境中分布最廣泛的組成部分，其各成分的失調在腫瘤微環境的生成、維持中起至關重要的作用［8］。細胞外基質包括基底膜和間質基質兩種基質，基底膜是位于上皮細胞、內皮細胞基底部的膜；間質基質是細胞外基質的主要成分，在細胞遷移、細胞黏附、血管生成、組織發育和修復中發揮重要作用［9］。腫瘤相關細胞外基質是腫瘤微環境失調的主要參與者，其在癌癥的惡化、臨床基因治療效果及病人預后中具有很大的研究價值。

膠原蛋白是構成細胞外基質的骨架，它占人體總蛋白質質量的30%。基底膜的破壞、上皮細胞的間質轉化是癌癥發生、發展、轉移的微環境信號。基底膜的主要成分是形成網絡的膠原，如Ⅳ型和Ⅷ型膠原，而間質膜的主要是形成纖維的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型、Ⅺ型等膠原和由基質中退行的成纖維細胞合成的珠狀纖維狀Ⅵ型膠原［10］。而關于膠原在腫瘤中的功能研究仍在進行，目前學者認為膠原與腫瘤的生長、轉移及維持腫瘤微環境有關［11-12］。本研究基于TCGA數據庫發現，COL5A2在胃腺癌組織中高表達，并且與病人的分期、低存活率相關。

COL5A2 是COL5 家族成員，在腫瘤中的異常表達，影響腫瘤的惡性程度和進展［13］，但COL5A2在胃癌中的臨床作用及功能機制尚不清楚。Tan 等［14］發現，在胃癌細胞中，COL5A2 敲除能夠抑制癌細胞的遷移能力，減少肝臟轉移小鼠的肝結節數量，揭示在COL5 家族成員中，COL5A2 與晚期胃癌的關系最密切，COL5A2 高表達與不良預后相關。Ding 等［15］通過免疫組織化學法檢測胃癌組織中COL5A2的表達與病理分級、轉移、分期顯著相關，是胃癌的獨立預后因素。本研究結果顯示：COL5A2 在胃癌中高表達，與病人預后差有關；體外細胞研究發現，敲減COL5A2 抑制癌細胞的增殖、遷移、侵襲，阻滯G1/S，體內裸鼠成瘤發現，敲減COL5A2后，腫瘤的生長得到控制，瘤子中PCNA 也降低。這些研究充分說明了COL5A2 在胃癌中發揮致癌作用，這也與Tan、Ding 的研究結果相吻合。同時，該研究結果還暗示了COL5A2 抑制劑在胃癌治療中的前景。COL3A1/FBN1/COL5A2/SPARC-miR-29a-3p-H19 ceRNA 網絡在胃癌中具有很高的預后價值［16-17］，而本研究并未對COL5A2 在整個腫瘤環境中的調控網絡進行研究，因此，本課題組計劃開展COL5A2的腫瘤微環境調控機制探究，為COL5A2 在胃癌中的應用提供更充分的作用機制理論依據。

綜上所述，COL5A2 在胃癌中高表達，促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲，有利于裸鼠成瘤的生長，為胃癌的基因治療提供新依據。