西瓜ClPP2C3克隆及表達分析

朱毅 柳唐鏡 宮國義 張潔 王晉芳 張海英

（1. 中國農業大學園藝學院，北京 100193；2. 北京市農林科學院蔬菜研究所，北京 100097；3. 廣西壯族自治區農業科學院園藝研究所，南寧 530007）

脫落酸（abscisic acid, ABA）是一種重要的植物激素，已被證實參與植物響應環境脅迫及多種植物生長發育過程，如胚胎和種子發育、種子休眠和萌發、幼苗生長和營養器官發育等［1-2］。外源施加ABA，能夠促進番茄［3］、葡萄［4］、西瓜［5］等作物果實的糖酸比提高、可溶性固形物積累、果實軟化、果實色澤形成等，顯示ABA在果實成熟和品質形成中發揮重要調控作用［2］。目前，眾多學者對ABA響應逆境脅迫、調節植物生長發育等分子機制進行深入研究，但關于ABA調控果實成熟（尤其是呼吸非躍變型果實成熟）機制研究還相對缺乏［2］。2C型蛋白磷酸酶（protein phosphatase 2C, PP2C）是ABA信號轉導途徑中的重要成員，參與ABA信號轉導［6］。ABA能夠誘導編碼PP2C基因表達，PP2C蛋白活性降低會增強植物對ABA的響應能力。目前，已在擬南芥、草莓、番茄、棉花、小麥、油菜和水稻等多種植物中鑒定出PP2C成員，如編碼草莓PP2C的FaABI1表達水平在草莓果實發育過程中迅速下降，過表達FaABI1抑制草莓果實成熟［7-8］。干擾編碼番茄PP2C家族成員的SlPP2C1可以促進番茄果實成熟，表明PP2C蛋白負調控ABA信號轉導［9］。

西瓜［Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum. et Nakai］是一年生草本園藝作物，屬非呼吸躍變型果實，揭示其果實成熟及品質形成機理是目前研究熱點，但PP2C基因家族成員在西瓜果實成熟中的作用尚不明確。

前期通過生物信息學手段結合轉錄組學分析，在西瓜基因組中共鑒定出5個PP2C基因家族成員［10］。隨著果實成熟，Cla021986、Cla012597、Cla006546、Cla006233的表達量顯著降低，而Cla-008212的表達量卻逐漸提高，且在栽培品種和野生品種中表達差異較大［11］。結合重測序數據分析，Cla008212在西瓜基因組馴化階段受到選擇［11-12］。因此，推測Cla008212對西瓜果實成熟及品質形成起重要作用。

本研究以‘97103’西瓜果實為材料，克隆獲得Cla008212（ClPP2C3），對其進行生物信息學分析、不同果實發育階段和組織中表達分析和亞細胞定位，為進一步研究ClPP2C3的生物學功能和對非呼吸躍變型果實成熟及品質進化機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料包括栽培西瓜類型CL（C. lanatus.cultivar）6種：‘97103’‘WDM’‘ZZJM’‘JMT’‘MG72 8’‘JX1M’；半野生西瓜類型CM（C. mucosospermus）3種：‘PI595203’‘PI248178’‘PI254740’；野生西瓜類型CC（C. colocvynthis）5種：‘PI220778’‘PI63 2755’‘PI549161’‘PI296337’‘PI296341-FR’。均由北京市農林科學院蔬菜研究所西瓜遺傳育種課題組保存并提供。篩選上述14份西瓜種質用于分析不同含糖量品種中ClPP2C3的相對表達量，其中，選取‘ZZJM’授粉10 d果實作為對照。

試驗材料種植于北京市農林科學院蔬菜研究所四季青農場。授粉26 d采集西瓜果肉，取樣后立即用液氮冷凍，置于-80℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 西瓜總RNA提取和cDNA合成及熒光定量PCR 使用快速通用植物RNA提取試劑盒3.0（北京華越洋生物科技有限公司）提取西瓜果肉組織總RNA。采用北京康潤誠業生物科技有限公司（GenStar）StarScript III All-in-one RT Mix with gDNA Remove試劑盒進行cDNA合成。將cDNA鏈作為模板，西瓜Cla007792作為內參基因［5］，利用LightCycler 480型熒光定量PCR儀（Roche）進行定量PCR分析。PCR反應體系為2×Mix 10 μL（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）、cDNA模板1 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL和ddH2O 7 μL。PCR擴增程序為95℃ 30 s；95℃ 30 s，55℃ 20 s，72℃ 2 min，45個循環。比較C-T法計算相對表達量。利用Primer Premier 6軟件設計特異性引物（表1），引物合成和測序均在北京天一輝遠生物科技有限公司完成。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.2.2 ClPP2C3克隆 根據ClPP2C3（Gene ID: Cla-008212）基因序列設計特異性引物，引物序列見表1。PCR反應體系為2×Phanta Flash Master Mix 10 μL（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）、葉片模板cDNA 1 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL和ddH2O 7 μL。擴增程序為95℃ 5 min；95℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 1 min 30 s，35個循環；72℃ 5 min。PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳并回收目的條帶。

1.2.3 ClPP2C3生物信息學分析 運用DNAMAN 1.0軟件對不同序列進行多重比對分析。使用ExPASy軟件（https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/Protparam）進行蛋白質理化性質預測分析。用MEGA7.0軟件，采用鄰接法（neighbor-joining, NJ）將西瓜和其他植物PP2C蛋白氨基酸序列構建系統進化樹（1 000次重復）。

1.2.4 ClPP2C3亞細胞定位 構建pMDC87d-GFP克隆載體，轉入大腸桿菌DH5α對陽性克隆菌液進行測序并提取質粒。將GFP和ClPP2C3重組載體轉入農桿菌GV3103，涂板，48-72 h培養后，篩選陽性菌在液體培養基（含Kan和Rif抗性）中進行擴繁，28℃搖床培養至OD600為1.0。于4 000 r/min 5 min收集菌體，用終體積為2-3 mL的懸浮液進行懸浮，至OD600為0.6。黑暗孵育3 h，用1 mL無針頭注射器侵染煙草葉片，暗培養、光照培養各1 d后，用激光掃描共聚焦顯微鏡（蔡司LSM710）對煙草葉下表皮進行熒光信號檢測。

1.2.5 ClPP2C3啟動子活性比較 利用DNAMAN對西瓜栽培品種和野生品種的啟動子序列進行比對發現，SNP主要集中在啟動子序列1-2 kb范圍。為了探究SNP是否影響啟動子活性，將栽培品種和野生品種ClPP2C3的啟動子分成3個片段擴增，分別是0.5、1.0和2.0 kb，其中0.5 kb啟動子為對照。構建pGreenII 0800-LUC重組載體，轉化DH5α菌株，測序比對正確后提取質粒。將質粒轉入農桿菌中并配制煙草注射緩沖液重懸菌體至OD值為0.6。使用注射器將菌液注射至煙草葉片中，溫室正常光照培養48-60 h。隨后取樣和標號，液氮速凍，進行熒光素酶互補試驗。通過生物化學發光分析設備定性定量檢測熒光強度，分析不同片段長度的啟動子活性。

2 結果

2.1 ClPP2C3 CDS克隆

以‘97103’西瓜果肉cDNA為模板，通過特異性引物進行PCR擴增，獲得ClPP2C3的CDS序列（圖1）。ClPP2C3的cDNA序列長度為1 317 bp，編碼438個氨基酸，分子量大小為47.81 kD，蛋白質等電點為5.12。

圖1 西瓜ClPP2C3的CDS序列Fig. 1 CDS sequence of ClPP2C3 in watermelon

2.2 ClPP2C3同源性分析

使用NCBI網站BLAST工具搜索與ClPP2C3同源性較高的氨基酸序列發現，西瓜ClPP2C3與擬南芥AtAHG3和番茄SlPP2C3蛋白序列同源性達35.79%。DNAMAN軟件多序列比對結果（圖2）顯示，這些蛋白均具有PP2C基因家族中PP2C轉錄因子的典型特征，序列中均含有PP2C蛋白結構域，且在PP2C結構域保守性較高。使用MEGA 7.0中鄰接（neighbor-joining）法對篩選出的蛋白進行系統進化樹構建，結果（圖3）顯示，ClPP2C3與擬南芥AtAHG3、番茄SlPP2C3蛋白具有較高的一致性，其親緣關系最近，ClPP2C3可能同這些蛋白具有相似的功能。

2.3 ClPP2C3亞細胞定位分析

通過激光共聚焦顯微鏡觀察ClPP2C3蛋白在煙草葉片中亞細胞定位情況，結果（圖4）顯示，重組載體GFP熒光信號主要集中在細胞核中，而對照空載體GFP熒光信號分布于整個細胞，說明ClPP2C3蛋白均在細胞核中表達并發揮功能。

圖4 ClPP2C3亞細胞定位分析Fig. 4 Subcellular localization analysis of ClPP2C3

2.4 ClPP2C3表達量分析

對不同品種西瓜熒光定量PCR分析（表2），ClPP2C3在含糖量9-12的栽培型類型CL（C.lanatus. cultivar）中的表達量分別是含糖量為2-3的半野生類型CM（C. mucosospermus）、含糖量為1-2的野生類型CC（C. colocvynthis）的4倍和9倍，顯著高于半野生類型CM（C. mucosospermus）和野生類型CC（C. colocvynthis）（圖5）。表明ClPP2C3在含糖量高的類型中表達量高于含糖量低的類型，二者呈正相關關系。

圖5 西瓜ClPP2C3在不同含糖量品種中的表達量分析Fig. 5 Expressions of ClPP2C3 in watermelon varieties with different sugar contents

表2 西瓜ClPP2C3在不同含糖量品種中的表達量分析Table 2 Expressions of ClPP2C3 in watermelon varieties with different sugar contents

2.5 ClPP2C3啟動子活性差異分析

西瓜栽培品種和野生品種ClPP2C3表達量存在差異，推測可能是啟動子活性對其產生影響。對啟動子序列進行比對發現，SNP主要集中在1-2 kb范圍。將啟動子分成3段：0.5、1.0和2.0 kb，分別構建融合表達載體，進行熒光素酶互補試驗，并通過生物化學發光分析設備定性定量檢測熒光強度。結果顯示，西瓜栽培品種2 kb長度啟動子活性是野生品種2 kb長度啟動子活性的1.3倍，顯著強于野生品種2 kb長度啟動子活性，但二者1 kb長度啟動子活性以及0.5 kb長度啟動子活性無明顯差異。證明栽培品種和野生品種啟動子活性差異是由啟動子序列1-2 kb間SNP導致的，可能造成表達差異（圖6）。通過啟動子序列分析發現，栽培品種ClPP2C3啟動子序列上缺少了1個WRKY轉錄因子結合元件（圖7），可能影響了啟動子活性。

圖6 栽培和野生品種中西瓜ClPP2C3的3個片段長度啟動子活性差異分析Fig. 6 Difference analysis of promoter activities at three fragment lengths of ClPP2C3 between cultivated and wild watermelon

圖7 不同品種西瓜ClPP2C3的轉錄調控模型Fig. 7 Transcription regulation models of ClPP2C3 in different watermelon varieties

3 討論

PP2C是ABA信號轉導途徑中重要的負調節因子，參與調控植物生長發育，以及抵御逆境脅迫反應的生物學過程［13-15］。近年來，PP2C被報道負調控果實成熟，多集中在呼吸躍變果實番茄上，但PP2C多個家族成員調控果實成熟的分子機制仍不明確，需要進一步挖掘［13］。

由于大多數非呼吸躍變果實缺乏穩定高效的遺傳轉化體系，PP2C調控非呼吸躍變果實成熟機制一直未能有效探明。僅有研究發現在草莓瞬時沉默PP2C促進果實著色，但調控機制未得到深入挖掘［8］。西瓜作為重要的非呼吸躍變果實，ABA被證明是主導其果實成熟的關鍵激素，但ABA信號如何參與西瓜果實成熟調控仍不清晰［5］。本研究前期以能夠正常成熟的栽培西瓜和不能正常成熟的野生西瓜為研究對象，通過轉錄組分析發現，ClPP2C3在栽培品種和野生品種中的表達存在較大差異［12］。在此基礎上，本研究通過在14個代表性品種中分析ClPP2C3的表達，明確ClPP2C3表達量與果實含糖量呈正相關。然而，PP2C作為ABA信號途徑中的負調控因子，其表達卻隨著西瓜果實ABA和含糖量的積累逐漸提高，其作用機制仍不明確。前人研究顯示，ABA處理后，擬南芥中的ABRE類轉錄因子能夠激活PP2C表達，反饋調節ABA信號［16］。借鑒前人研究發現，ClPP2C3啟動子上確實存在ABRE結合元件。因此，推測在西瓜果實成熟過程中也存在關鍵ABRE轉錄因子激活ClPP2C3的表達，但其基因功能和作用機制亟待深入研究。

西瓜果實由不能正常成熟的野生西瓜進化為可以食用的栽培西瓜，經過了3個進化階段。Cla008212位于第2進化階段，即馴化階段，西瓜果實由完全不能成熟的野生西瓜進化為半野生西瓜［5,12］。通過單倍型分析，ClPP2C3的啟動子序列上具有8個SNP。結合啟動子活性分析推測，位于1-2 kb區間的（-1 216，A/G）變異位點可能是影響啟動子活性的關鍵SNP。通過啟動子結合元件分析發現，該位點變異導致栽培品種中WRKY轉錄因子的結合位點TGAC缺失。因此，推測野生品種中可能存在一個轉錄抑制的WRKY轉錄因子抑制ClPP2C3表達，而栽培品種中該轉錄因子不能結合ClPP2C3啟動子，緩解了其對ClPP2C3表達的抑制。WRKY轉錄因子可能介導ClPP2C3調控西瓜成熟及果實含糖量，但該假設仍需下一步研究確認。

4 結論

西瓜ClPP2C3編碼蛋白定位于細胞核，其基因表達與西瓜果實含糖量呈正相關，含糖量高的品種中表達高于含糖量低的品種。該基因可能是調控西瓜果實含糖量的關鍵候選基因。由1-2 kb區間SNP導致的啟動子活性差異對不同含糖量品種中ClPP2C3表達量存在影響。