一碳化合物非天然生物轉化的研究進展

摘 要：一碳化合物（C1）包括甲烷、甲酸、甲醇、一氧化碳和二氧化碳等，來源廣泛，價格低廉，是第三代生物煉制的理想原料。自然界中存在眾多天然利用C1的微生物，但C1天然途徑碳轉化速率較低，非模式生物工業應用難度較大。利用模式菌株構建C1代謝路徑，又稱合成型C1生物轉化體系，可以彌補C1天然利用微生物的缺點，降低工業生產對傳統化石資源的依賴。本文概述了C1種類、來源及天然利用途徑，著重綜述了合成型C1生物轉化體系的研究進展，強調合成型C1利用體系對于提高碳轉化率、擴展C1資源應用的重要性，最后分析了C1生物轉化面臨的挑戰，并對該領域的未來研究方向進行了展望。本文為未來合成型C1利用微生物的構建、提高異源C1代謝途徑效率提供了參考，對實現綠色、高效開發可持續資源具有重要意義。

關鍵詞：一碳化合物；生物轉化；二氧化碳；合成型一碳化合物生物利用體系；碳轉化率

中圖分類號：Q81" " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.05.001

Abstract： One-carbon compounds （C1）， including methane， formate， methanol， carbon monoxide and carbon dioxide， have been considered to be the ideal raw materials for the third generation of biorefining， due to their abundance and low cost. Microbes that can naturally utilize C1 have been widely studied with low carbon conversion rate and industrial difficulty. The transformation and heterologous expression of C1 utilization pathway described as synthetic one-carbon bio-utilization system can help overcome the obstacles of non-model organisms， which will reduce the dependence on traditional fossil fuels. This review briefly summarized the types， sources and natural pathways of C1. We mainly focused on the progress of C1 utilization in model organisms and emphasized the importance of synthetic C1 bio-utilization systems for improving carbon conversion rate and developing new application. In addition， we discussed the challenges and perspectives of the biotransformation of C1. This paper provided a reference for the construction of synthetic C1 utilization microorganisms and improving the efficiency of heterologous C1 metabolic pathway， which is of great significance for realizing green and efficient development of sustainable resources.

Key words： one-carbon compounds; biotransformation; carbon dioxide; synthetic one-carbon bio-utilization system; carbon conversion rate

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（5）： 385-399）

隨著人口增長和社會經濟的發展，全球年均能源消耗量已經超過百億噸（以石油當量計數），其中化石燃料消耗占總能源消耗的四分之三及以上［1］，隨之而來的全球變暖等氣候變化對環境造成了惡劣的影響，如干旱、洪澇、海平面上升、生物多樣性減少等，嚴重威脅著人類的生存和發展。因此，開發綠色可持續的資源，取代傳統化石資源成為21世紀人類面臨的重大難題。隨著生物技術的發展，對生物系統進行改造，已經實現了利用糖、淀粉、木質纖維素等可再生資源合成各種能源燃料、大宗化學品、藥物等高附加值化學品，部分緩解了對傳統化石資源的依賴［2］。

以糖類、植物油脂等為原料來合成生物燃料被稱作第一代生物煉制，但存在“與人爭糧，與糧爭地”的問題；第二代生物煉制改用木質纖維素等非糧食生物質為主要原料，然而木質纖維素結構復雜，需要經過預處理、酶解等步驟才能被微生物所利用；第三代生物煉制為了改善原料的局限性，使用二氧化碳（carbon dioxide，CO2）及綠色清潔能源（光、廢氣中的無機化合物、光電、風電等）進行綠色生物制造［3］。構建綠色高效的一碳化合物（one-carbon compounds，C1）細胞工廠已成為實現“碳中和、碳達峰”的重要途徑。

第三代生物煉制中，以CO2為代表的C1，是可持續原料的重要組成部分。C1包括氣態的甲烷、一氧化碳（carbon monoxide，CO）、CO2和液態的甲醇、甲酸。其中CO、CO2均為工業生產過程中產生的廢棄氣體，排入大氣中會造成環境污染、溫室效應等不利影響；甲烷在自然界中儲量豐富，可以通過化學催化有效地轉化為甲醇；隨著電化學的發展，CO2還原制取甲醇、甲酸大大降低了C1的生產成本。此外，與傳統碳源葡萄糖相比，C1中的碳原子具有更多可利用的電子，有利于實現化學品的增產［4］。然而，以C1作底物也存在著諸多問題，例如，C1缺乏C—C鍵，生物體中所有多碳代謝中間體需要從頭生成，且多數生物不具備這種天然的C1轉化能力，該過程涉及大量酶和能量消耗，容易造成胞內資源失衡。

近年來，C1逐漸被視為化學工業和生物技術的理想資源。自然界中存在眾多能夠天然利用C1的微生物，對天然途徑進行改造與優化，不僅可以進一步提高生物的C1利用效率，還能夠實現高附加值化學品的合成。但是此類微生物通常遺傳背景不清晰，缺乏完善的合成生物學工具，因此，大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，S. cerevisiae）等模式生物逐漸得到研究人員的關注，成為C1利用途徑異源構建的優良宿主。如表1所示，微生物作為細胞工廠被廣泛應用于C1利用途徑的構建和改造。這種非天然的C1利用途徑又被稱為“合成型C1途徑”，包含合成型C1途徑的工程菌被稱為“合成型C1利用微生物”。

構建策略如圖1所示，對合成型C1途徑進行設計、分析和體外測試，其中高效轉化C1的組合被用于構建合成型C1利用微生物。內外源途徑會競爭胞內有限的資源（共有中間體、能力、還原力等），出現途徑串擾；同時，不同物種最適生長條件存在差異，關鍵酶可能無法在新宿主中發揮作用。為了解決以上問題，研究者通過實驗室適應性進化（adaptive laboratory evolution，ALE）和計算機輔助的酶工程優化菌株性能，最終使工程菌獲得額外的C1利用能力，或構建增值化學品合成的新途徑［16］?？偟膩碚f，天然C1途徑已經得到了廣泛而深入的研究，計算機輔助的途徑設計手段也越發成熟，但C1途徑的異源構建依然需要繁雜的代謝工程步驟，關鍵酶難以在異養微生物中發揮與自然條件下類似的效果，合成型C1利用微生物有待進一步研究與優化。

C1作為微生物生長和增值產品合成的底物，具有具大的成本優勢，有助于緩解不可再生資源利用造成的環境污染問題，成為未來生物制造領域的熱門資源。本文章主要概述了C1的種類及來源，介紹了其天然利用途徑，并著重綜述了模式生物利用C1的研究進展，強調合成型C1利用體系對于提高碳轉化率、豐富C1應用的重要性，最后通過分析C1生物轉化面臨的挑戰，展望未來的研究方向，以期為未來合成型C1利用微生物的構建、提高異源C1代謝途徑效率提供參考。

1 甲烷的生物利用與轉化

甲烷在自然界中廣泛存在，主要由沼氣、天然氣和頁巖氣產生，是重要的碳基資源。甲烷是一種強效的溫室氣體，同時也是一種清潔型的生物燃料，具有豐度高、成本低和還原率高的優點，是最具吸引力的C1資源之一［17-18］。

甲烷營養體可以在有氧或厭氧條件下以甲烷為唯一碳源進行生長［19］。甲烷體內同化的第一步由甲烷單加氧酶（methane monooxygenase，MMO）催化，在氧氣的輔助下，甲烷被氧化為甲醇［20］。MMO包括兩類，分別為可溶性甲烷單加氧酶（soluble methane monooxygenase，sMMO）和膜相關甲烷單加氧酶（particulate methane monooxygenase，pMMO），其中pMMO幾乎存在于所有甲烷營養體中［21］。

在構建合成型C1生物利用體系過程中，MMO的活性是影響甲烷利用的重要因素，也是目前異養生物同化甲烷的主要難點，研究者在提高MMO酶活方面進行了諸多嘗試［22］。Balasubramanian等［23］初步實現了pMMO β-亞基在大腸桿菌中的異源表達，但測得的甲烷氧化效率較低；Kim等［24］將莢膜甲基球菌（Methylococcus capsulatus）來源的pMMO催化結構域在去鐵蛋白上重新組裝，達到天然pMMO的活性。鑒于MMO異源表達的生物活性低，研究者還開發了共培養體系，集成天然甲烷營養體與異養生物的優點，將甲烷營養體的分解代謝產物用作異養生物碳源，為甲烷的生物轉化提供了新策略。Lee等［25］使用莢膜甲基球菌作為高效的甲烷生物催化劑生產大量有機酸，隨后進化菌株E. coli SBA01將有機酸轉化為甲羥戊酸（mevalonatepathway，MVA），在僅添加甲烷的條件下，共培養48 h，檢測到61 mg/L MVA；Khanongnuch等［26］收集甲烷氧化菌廢棄培養基，用于培養貝氏不動桿菌（Acinetobacter baylyi ADP1），每摩爾底物最高可以得到（68.9±11.6） μmol 1-十一烯。

甲烷營養體多為古菌，生存條件往往較為極端，溫和的反應條件難以使MMO保持高催化活力。當前的研究雖然實現了MMO的異源表達及蛋白質結構優化，但依然無法成功構建新型甲烷營養體。另外，當甲烷呈現氣態形式時，其溶解度較低，具有一定的細胞毒性，這是異養生物以甲烷為碳源生長的又一障礙。因此，研究者提出避開甲烷途徑構建，轉而利用共培養體系，將甲烷營養體合成的有機物供給異養生物生長，合成高附加值產物。這種新的生物轉化策略雖然解決了構建甲烷營養體過程中存在的問題，但在工業生產中又將面臨著發酵成分復雜、調控困難等諸多挑戰。

2 甲醇的生物利用與轉化

在2018年，甲醇的全球產量達到1.1億噸，甲醇通常通過天然氣蒸汽重整、合成氣或CO2氫化得到［27-28］。作為一種非食用性替代碳源，甲醇具有廣泛的來源和靈活的生產工藝，在生物合成工藝中具備良好的價格優勢，是一種可再生、可持續的C1資源［29］。

以甲醇為唯一碳源進行生長代謝的生物又稱甲基營養體［30-31］，根據遺傳物質形態的不同，甲基營養體可進一步劃分為甲基營養原核生物和甲基營養真核生物。甲醇進入細胞后首先被氧化為甲醛，該過程由甲醇脫氫酶（methanol dehydrogenase，Mdh）或醇氧化酶（alcohol oxidase，AOX）催化［32-33］。隨后，甲醛經單磷酸核酮糖途徑（ribulose monophosphate pathway，RuMP）、絲氨酸途徑或還原型乙酰輔酶A途徑（Wood-Ljungdahl pathway，WLP）被進一步同化［34-36］。其中甲基營養型原核生物使用Mdh同化甲醇，革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的Mdh分別以吡咯喹啉醌和NAD+為電子受體［37-38］，該過程發生于周質空間，有效地降低了甲醛對細胞的毒害作用；甲基營養型酵母則使用AOX同化甲醇，得到的甲醛被二羥丙酮合成酶（dihydroxyacetone synthetase，DAS）固定在5-磷酸木酮糖（xylulose-5-phosphate，Xu5P）上，生成二羥基丙酮（dihydroxyacetone，DHA）和3-磷酸甘油醛（glyceraldehyde 3-phosphate，GAP）。AOX與DAS的催化反應定位于過氧化物酶體中，生成的甲醛、過氧化氫毒性中間體與細胞得到了良好的分隔［30， 39-40］。

在探究天然甲基營養體代謝機理的同時，研究者們還嘗試利用合成生物學工具，構建人工甲基營養體生物。主要策略如圖2所示，包括提高甲醇利用效率、增加共底物供應及構建新型甲醇同化途徑。首先，提高甲醇利用效率主要由關鍵酶的篩選和優化實現，Müller等［33］確定甲醇利用途徑的關鍵候選蛋白為Mdh、己酮糖6-磷酸合酶（hexulose-6-phosphate synthase，Hps）和6-磷酸-3-己酮糖異構酶（6-phospho-3-hexuloisomerase，Phi），發現甲醇芽孢桿菌（Bacillus methanolicus，B. methanolicus）來源的Mdh、Hps和Phi協同表達具有最高的甲醇同化效率，最終胞內40%的代謝中間體6-磷酸己糖來自甲醇。為了進一步提高甲醇同化效率，Price等［41］提出了一種無支架的蛋白質自組裝策略，使用SH3-配體相互作用對將Mdh、Hps和Phi組裝成一個超分子酶復合物，從而增強甲醇轉化為6-磷酸果糖的能力，同時通過過表達乳酸脫氫酶將NADH轉化為NAD+，阻止甲醛還原為甲醇，綜合以上策略，6-磷酸果糖產量提高了97倍，全細胞甲醇消耗率提高了9倍（圖2a）。

Woolston等［42］指出，限制甲醇利用的主要因素是共底物5-磷酸核酮糖（ribulose 5 phosphate，Ru5P）供應不足，在培養基中添加木糖可以顯著提高Ru5P的濃度，此外添加碘乙酸、過表達glpX抑制糖酵解途徑通量，可以進一步增加Ru5P的供應，最終在穩態下甲醛濃度降低為原來的1/3，甲醇攝入量增加了2倍。木糖或核糖可以分別進入RuMP和木酮糖單磷酸循環（xylulose monophosphate cycle，XuMP），這是Ru5P的重要來源。Chen等［43］通過敲除rpe或rpiAB促進甲基營養型工程菌的Ru5P合成，該菌株在甲醇：木糖底物摩爾比為1：1的情況下生長時，生長速率每小時可達到0.170±0.006，后續進一步將其設計為乙醇或1-丁醇生產菌，產量分別達到4.6 g/L和2.0 g/L。敲除葡萄糖-6-磷酸異構酶也是增強共底物供應的重要靶點，Guo等［44］在畢赤酵母（Pichia pastoris，P. pastoris）中敲除gpi后Xu5P通量增加，以甲醇為唯一碳源合成的蘋果酸增產36.5倍。加強磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）也可以提高共底物Ru5P的供應。Bennett等［45］將B. methanolicus來源的非氧化PPP引入大腸桿菌，通過敲除磷酸葡萄糖異構酶（phosphoglucose isomerase，Pgi）重排中心代謝途徑，將葡萄糖代謝路徑靶向到PPP，最后以丙酮產量表征甲醇利用效率，甲基營養型大腸桿菌工程菌在分批補料發酵過程中丙酮終產量達到（45.0±8.7） mmol。

此外，為了解除底物供應對甲醇同化的限制，研究者們還設計了新型替代途徑。例如，De Simone等［12］結合細菌來源Mdh和酵母來源Das的優點，在大腸桿菌中構建了一種“mixed and matched”的甲醇利用途徑，13C標記試驗結果顯示，磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）中22%的碳來自甲醇（圖2c）。Wang等［13］設計了一種線性的甲醇利用途徑，與RuMP不同，線性途徑只需要甲醇脫氫酶和縮醛酶即可將甲醇轉化為二羥基丙酮，并最終進入到生物質合成過程中（圖2d）。13C示蹤分析還輔助發現了釀酒酵母中存在一種未知的天然甲醇同化途徑，該途徑與畢赤酵母的XuMP具有高度相似性［46］。人工途徑可以有效地縮短反應步驟、簡化反應條件、避免有毒物質的產生和積累，甲醇的非天然生物轉化技術開發豐富了C1底物的可用性。

甲醇同化過程中產生的毒性物質以及途徑改造帶來的生長抑制問題限制了工程菌的生物轉化。ALE作為一種通用手段常被用于提高底盤細胞的途徑適應性、縮短代時、提高目的產品合成通量。例如，在將甲醇利用途徑引入谷氨酸棒狀桿菌的過程中，ALE使菌株的生長速度提高了20倍［14］。Zhan等［15］將甲醇利用途徑分為甲醇雙氧化、還原力供應、中間體循環和丙酮酸羧化4個模塊，釀酒酵母經過適應性進化，在以甲醇為唯一碳源的基本培養基中實現生長。多形漢遜酵母在以甲醇為唯一碳源合成游離脂肪酸的過程中，細胞磷脂水平降低導致細胞死亡，通過適應性實驗室進化細胞實現了起死回生，結合全基因組測序進而找到恢復磷脂代謝的關鍵基因。ALE在代謝失衡致死細胞的重生過程中發揮著至關重要的作用［47］。

甲醇是代謝工程和合成生物學領域C1利用的研究焦點，但構建以甲醇為唯一碳源的微生物還存在如下問題：在有氧條件下，甲醇被氧化為具有細胞毒性的甲醛［48］，甲醛使蛋白質和其他大分子發生交聯作用，從而導致蛋白質變性，影響其發揮正常的功能；微生物以甲醇為碳源的生長后期，細胞高密度生長使氧氣傳質速率降低，限制了生長及生理代謝活動，這種影響可以通過添加純氧予以抵消，但是該過程會散失大量的熱能，發酵過程中需要添加冷凝劑避免溫度上升損害細胞，一定程度上提高了甲醇的利用成本［49］。未來提高生物對毒性中間體的耐受將是甲基營養體構建的重點研究方向。

3 甲酸的生物利用與轉化

甲酸具有極好的水溶性和極性溶劑溶解性，同時具有一定的生物毒性。甲酸的生產成本較高，限制了其在早期研究中的使用［50］。隨著電學、光學與生物學學科的交叉應用，CO2制取甲酸降低了原料成本，甲酸逐漸成為具有巨大應用潛力的新型C1底物［51-54］。

微生物利用甲酸的方式主要有兩種：異化和同化。異化指甲酸完全分解代謝為CO2及能量；同化指甲酸作為碳源進入微生物分解代謝途徑，在此過程中，甲酸轉化為甲基四氫葉酸（formyl-tetrahydrofolate，THF、CH3-THF）、亞甲基四氫葉酸（methylene-tetrahydrofolate，methylene-THF、CH2-THF）等代謝中間體。甲酸天然途徑代謝機制復雜，酶和中間體不穩定，導致甲酸的同化效率較低［55-56］。甲酸同化途徑常用于提供還原力，與糖酵解途徑共建合成型葡萄糖/甲酸代謝（synergistically metabolize glucose and formate，SMGF）途徑時，可以提高小分子有機酸的產量。例如：在谷氨酸棒桿菌中過表達fdh基因幫助琥珀酸增產20%；在大腸桿菌中通過平衡還原力與能量可以使丙酮酸理論產率由2 mol/mol提高至3 mol/mol；進一步使用蘋果酸產量進行途徑評估，1 L發酵體系中蘋果酸終產量可達208 mmol，產率為1.65 mol/mol［57］。

研究人員試圖設計人工甲酸代謝途徑，以提高甲酸同化效率和提高目標產物產量。人工甲酸利用途徑基于絲氨酸循環、還原甘氨酸途徑（reductive glycine pathway，rGlyP）和卡爾文（Calvin-Benson-Bassham，CBB）循環進行改造。2018年，Yu等［58］優化扭脫甲基桿菌絲氨酸循環，并將其引入到大腸桿菌中，甲酸同化生成的CH2-THF將甘氨酸轉化為絲氨酸，繼而產生PEP、草酰乙酸、蘋果酸完成整個循環，該工程菌株能夠使用甲醇、甲酸和CO2合成多碳代謝物（圖3a）。

rGlyP最早發現于脫硫弧菌（Desulfovibrio desulfuricans D11）中，是一種高效的甲酸利用途徑，被廣泛應用于構建非天然甲酸利用生物［59-60］。Yishai等［61］首次在大腸桿菌中證實了rGlyP同化甲酸的可行性，使甘氨酸裂解/合成酶系統向還原方向運行。大腸桿菌通過同化甲酸和CO2來滿足其對甘氨酸和絲氨酸的所有需求，是第一個將甲酸同化與THF系統相結合的研究［10］。2018年，Tashiro等［62］以大腸桿菌為宿主，利用微生物電合成反應系統，通過rGlyP將甲酸和CO2轉化為丙酮酸，該混合系統提供了甲酸/CO2與電催化耦聯的研究范例。2020年，Kim等［9］將rGlyP的4個模塊引入到對絲氨酸、甘氨酸和C1營養缺陷的大腸桿菌中，證明了甲酸是可以作為工程菌的唯一碳源（圖3b）。除大腸桿菌外，釀酒酵母、鉤蟲貪銅菌也可以通過改造rGlyP途徑利用甲酸，構建C1利用平臺［8， 11］，改造后菌株與野生型菌株生長態勢相近。

相較于rGlyP，CBB循環利用甲酸的改造較少。2019年，Gleizer等［6］通過過表達甲酸脫氫酶、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，RuBisCO）和磷酸核糖激酶，首次在大腸桿菌中構建CBB循環，經過200 d的適應性進化，獲得了一株基于甲酸和CO2生長的自養型生物。Gassler等［7］在畢赤酵母過氧化物酶體中構建了類似CBB循環的途徑，這種自養型酵母可以以CO2為唯一碳源，以甲酸為唯一能量來源。上述工作證明了異養型生物完全自養的可行性，在此過程中代謝網絡重組和適應性進化是獲得合成型C1利用微生物的重要方法（圖4a）。

研究證明，在有氧條件下，rGlyP的同化能力最強，用rGlyP取代CBB循環有可能使生物質產量提高13%，丙酮酸和乙酰輔酶A關鍵中間體的產量分別提高25%和30%［63］。然而，異源構建的rGlyP效率往往與天然途徑差距較大，以ALE輔助菌株進化，可以提高甲酸利用效率，減少工程菌株生長代時［64-65］。rGlyP的中間產物，如CH2-THF等還參與微生物甲基轉移反應，內外源途徑的平衡可能是未來rGlyP改造需要解決的一大難點。

4 CO的生物利用與轉化

CO是大氣中的微量氣體，是工業生產過程中主要有毒廢氣之一［66］，可能損害生物體的氧運輸和線粒體功能［67-68］。部分細菌和古菌進化出了同化CO的能力，這些生物統稱為羧基營養體［69-70］。

CO同化的第一步由一氧化碳脫氫酶（carbon monoxide dehydrogenase，CODH）催化，生成CO2和還原力［70］。好氧羧基營養體通常使用CBB循環，厭氧菌則主要使用WLP［71］。其中WLP由羰基分支途徑和甲基分支途徑組成，是乙酸基物質的重要來源，該過程產生的乙酰輔酶A可以直接進入生命體的中心代謝途徑，因此，WLP在生物轉化領域引發了廣泛的研究［66］。

在異源宿主中重建WLP富有挑戰性。在前期研究中，Roberts等［72］在大腸桿菌中過表達5個來自Morella thermoacetica的基因，但未能在體內檢測到CODH/乙酰輔酶A合成酶（acetyl-COA synthase，ACS）的生物活性。研究證明，NiCl2孵育是ACS具有活性的必要條件，然而該操作在體內難以實現［66， 73］。2018年，Fast等［73］將一組真菌來源的CODH/ACS和大腸桿菌來源的亞甲基四氫葉酸還原酶引入丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum，C. acetobutylicum）中，重建出一個具有功能的WLP，并證明了金屬團簇在WLP重構過程中的重要作用。

WLP重構策略是賦予異養生物CO利用能力的關鍵，但是由于系統發育的差異性，CO天然利用途徑難以應用到親緣性遠的模式菌株當中。古菌生存環境極端，CO同化酶的最適溫度、pH都難以在真核、原核生物內重現。CO的生物利用還有很多研究內容的空缺，將異養生物轉化為羧基營養體具有巨大的研究前景。

5 CO2的生物利用與轉化

在所有C1中，CO2資源最為豐富，主要來源于大氣和化石資源廢氣，是造成全球變暖最主要的溫室效應氣體［2］。根據《全球逐日CO2排放報告2023》報道，2019―2022年，受疫情影響，全球CO2排放量呈現“V”字型，主要來自電力、供熱、交通運輸以及航天等行業，2022年排放量升高至360.7億噸，達到歷史峰值［74］。近年來，利用CO2加氫、光催化、電催化和生物合成等技術制備還原型C1（CO、甲醇、甲酸等）取得了重大進展，為CO2的功能拓展和C1資源可持續生產奠定了基礎［75］。

CO2生物利用與轉化技術涉及眾多物種，包括可以天然固定CO2的自養生物和經代謝工程改造獲得CO2固定能力的異養生物，異養生物中酵母和大腸桿菌的相關研究最為廣泛和深入。自然界中存在多種天然的CO2固定途徑，Liu等［76］對7條天然固碳途徑進行了詳細的總結和闡述。其中6條被人們熟知，分別為CBB循環、WLP、二羧酸/4-羥基丁酸（dicarboxylate/4-hydroxybutyrate，DC/4-HB）循環、3-羥基丙酸/4-羥基丁酸（3-hydroxypropionate/4-hydroxybutyrate，3-HP/4-HB）循環、3-羥基丙酸雙循環（3-HP bicycle）、還原型三羧酸（reductive tricarboxylic acid，rTCA）循環；第7條是近年發現的rGlyP［59］。植物、微藻和藍細菌等光能自養生物能夠通過光合作用利用光能，生產NADPH和ATP；通過最常用的CBB循環固定CO2，合成糖類等有機物。大部分植物和微藻缺乏成熟的遺傳操作系統，實驗室培養受限［77］。藍細菌由于其結構簡單，遺傳背景相對清晰，是熱門的光合微生物底盤細胞之一。對藍細菌的代謝途徑進行改造，已實現了利用光能和CO2合成多種能源物質和增值化學品，如乙醇、乙烯、丁醇、異丁醇、長鏈脂肪酸和脂肪醇等［78-79］。另外，鉤蟲貪銅菌能夠通過CBB循環固定CO2，利用氫氣、甲酸或有機碳源進行生長，是一種兼性化能無機自養微生物［2］。鉤蟲貪銅菌具有合成聚羥基丁酸的能力，是降解塑料的優良底盤［80］。通過代謝工程改造聚羥基丁酸合成途徑，可以將碳源引入其他增值產品的合成，如異丙醇、異丁醇、糖類和脂肪酸等［81-83］。除CBB循環外，其他固碳途徑幾乎均發源于古菌，古菌生長條件極端、遺傳操作相對困難，為了適應極端環境的惡劣條件，古菌進化出了各種在高溫、高滲透壓條件下發揮作用的核心酶，這對實驗室培養、途徑遷移提出了巨大考驗［84］。

天然固碳途徑中，核心酶的類型、氧敏感性、對能量和還原力的需求存在差異。光能自養微生物固碳的效率通常較低，光合作用過程中光能到生物質的最高能量利用效率理論值為8%～10%，實際效率則低于3%［85］。而古菌自養生物的固碳酶則常常對氧氣、溫度、滲透壓等條件要求苛刻，限制了其在工業生產中的應用［86-87］。與自然途徑相比，人工固碳途徑路徑更為靈活，可以人為地對能量與還原力進行計算與平衡，提高固碳效率，因此，構建新型人工固碳途徑得到了廣泛的關注。圖3展示了近年來以CO2為碳源的合成型C1利用微生物改造策略。

CO2的非天然生物利用技術開發主要集中在酵母、大腸桿菌等模式生物中。畢赤酵母是一種天然的甲基營養型生物，被廣泛應用于工業酶和藥品的生產。Gassler等［7］將其XuMP改造為CBB循環，利用真核生物氧化還原體分隔CO2利用模塊和甲醇利用模塊，使細胞的生物質均來自CO2。

目前7種天然固碳途徑均不同程度地在大腸桿菌中實現了異源表達［88-89］。在異養生物中引入人工CBB循環，實現了異養工程菌的半自養和完全自養改造（圖4a）［5-6］。利用CO2濃縮機制（CO2 concentrating mechanism，CCM），Flamholz等［90］在大腸桿菌中建立了一個具有功能的CCM，為提高CBB循環固碳效率提供了新的改造策略。以天然固碳途徑為基礎、以CO2為原料構建生物合成平臺逐漸成為熱點研究方向。例如：Liu等［91］在大腸桿菌中異源表達丙二酰輔酶A還原酶、丙二酸半醛還原酶和3-羥基丙酰A合成酶、脫水酶，該工程菌株最終合成（13.28±0.12） mg/L丙烯酸和（1 430±30） mg/L丙酸；Mattozzi等［92］將3-HP雙循環分為4個模塊，在大腸桿菌中分別表達并驗證活性，為異養宿主構建3-HP雙循環完整通路奠定了基礎；Liu等［93］則將3-HP循環中的部分酶異源表達在大腸桿菌中，利用循環中間體琥珀酰輔酶A為三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環中間體的特性，使用進化的丙酰輔酶A羧化酶提高固碳效率，最終合成了2.66 g/L琥珀酸［94］。rTCA循環與TCA循環反應步驟相同，但運行方向相反，Guo等［95］將rTCA通路成功構建在大腸桿菌中，并將其靶向表達于周質空間，實現了蘋果酸的增產。此外，2023年，Luo等［96］獨立于已有的天然固碳途徑，通過表達9個物種來源的17種酶將兩步羧化反應串聯起來，構建了一種新型的自養路徑，并在大腸桿菌中進行了模塊化嘗試（圖4b），該途徑被命名為還原三羧酸支鏈/4-羥基丁酰輔酶A/乙基丙二酰輔酶A/乙酰輔酶A（the reductive tricarboxylic acid branch/4-hydroxybutyryl-CoA/ethylmalonyl-CoA/acetyl-CoA，THETA）循環。THETA循環將CO2直接轉化為中心構建模塊乙酰輔酶A，使其成為從CO2中合成增值化合物的多功能平臺。

非模式生物的固碳研究也取得了一定進展。Keller等［97］將勤奮金屬球藻（Metallosphaera sedula）來源的5個基因在強烈火球菌（Pyrococcus furiosus）中異源表達，改造后的工程菌能夠利用氫氣和CO2合成3-羥基丙酸。類似在酵母和大腸桿菌中構建的CBB循環，研究者改造Methylobacterium extorquens AM1使其利用甲醇獲取能量，并通過異源CBB循環從CO2中生成生物質，雖然該設計未能實現M. extorquens AM1的完全自養生長，但該研究在非模式生物自養生長方面取得了創新性進展［98］。

CO2利用途徑是支持生物自養的基礎，為了避免天然固碳途徑異源表達的問題，研究者們還設計了上百種人工固碳途徑，表2羅列了最具代表性的研究成果。其中丙二酰-輔酶A-草酰乙酸-乙醛酸（malonyl-CoA-oxaloacetat-glyoxylate，MOG）途徑固碳效率預計比CBB循環快2～3倍［86］；丙烯基輔酶A-甘油酸酯（malyl-CoA-glycerate，MCG）途徑與乙醇脫氫酶結合后可以將乙醇酸轉化為乙酰輔酶A，碳利用率達100%［99］；Luo等［100］在此基礎上，將MCG途徑與還原型乙醛酸途徑、丙酮酸合成途徑串聯，以CO2為原料生產乙酰輔酶A、丙酮酸和蘋果酸等產物，建立了一種無細胞固碳體系；巴豆酰輔酶A-乙基丙二酰輔酶A-羥基丁酰輔酶A（crotonyl-CoA/ethylmalonyl-CoA/hydroxybutyryl-CoA，CETCH）循環包含來自9個物種的17種酶，通過消耗兩分子ATP和三分子NADPH固定兩分子CO2，并生成一分子乙醛酸，能耗比CBB循環少40%［101-102］。

此外，研究者們綜合計算機發掘的酶，設計了完全創新的CO2利用途徑。Siegel等［56］通過理性設計改造甲醛酶（formolase，Fls），催化三分子C1轉化為一分子的三碳化合物，構建了反應路徑短、熱力學參數適宜的甲醛酶途徑（formolase pathway）。為了進一步縮短固碳步驟，Xiao等［103］創建了一種最小固碳循環，該循環僅包含4步反應，分別由丙酮酸合酶、丙酮酸羧化酶、草酰乙酸?；饷负鸵阴］o酶A連接酶催化，根據英文縮寫又可簡稱為POAP途徑。該途徑雖然路徑短，但將CO2氧化為草酰乙酸的過程會消耗更多的能量和還原力，并且需要在50℃的無氧條件下進行，故暫不適用于胞內表達。隨后有研究者構建合成型乙酰輔酶A（synthetic acetyl-CoA，SACA）途徑，經過三步酶催化反應，甲醛被轉化為乙酰輔酶A，是目前合成乙酰輔酶A最短的生物路徑，克服了POAP高能耗、氧敏感的缺點，與聚羥基丁酸酯合成途徑耦聯實現了71.8%的CO2利用效率［104-105］。Cai等［106］報道了一種利用無細胞系統，以CO2為原料合成淀粉的化學-生化雜交途徑（artificial starch anabolic pathway，ASAP），該途徑包含11個核心反應，比玉米合成淀粉的速率高8.5倍，開創了淀粉生物合成新道路。

在所有C1底物中，CO2來源最為廣泛，最易獲得，CO2還可以作為合成其他C1的原料，因此CO2在未來的C1生物利用研究中具有巨大潛力和價值。總結已有研究可以發現，異源表達天然固碳途徑已經取得了階段性進展，其中CBB循環和rGlyP實現了完整通路的構建［5-6， 59-60］。大腸桿菌是最熱門的改造宿主，也有研究針對畢赤酵母、強烈火球菌等微生物提出改造策略。宿主的不同特性適用于不同的固碳途徑，如真核生物由于過氧化物酶體的存在可以分隔內源與外源途徑，減少代謝串擾；大腸桿菌可以在厭氧條件下生長，有利于氧氣敏感型固碳酶的異源表達。事實上，目前基于天然固碳途徑所取得的研究成果均未能實現以CO2為唯一碳源的細胞生長，所謂異養生物的完全自養僅限于從CO2生產生物質，生長代謝過程中所需能量與還原力則需要額外添加其他C1底物，如甲酸、甲醇等。

然而天然固碳途徑反應復雜、關鍵酶的反應條件嚴苛，計算機輔助的人工固碳途徑設計有助于彌補天然途徑的缺點，未來天然途徑與人工途徑相結合將是CO2作為C1底物的重要研究方向。研究者們對天然固碳途徑進行設計與重排，使模式、非模式菌株成為應用固碳途徑的增值產品生產平臺，為C1多場景應用奠定了堅實的基礎。對天然途徑的部分反應進行優化與組裝，有利于提高增值化學品的理論產率和產量。另外，雖然微生物的C1利用可以綠色、溫和地將C1轉化為有機生物質，但是細胞體系對酶聯反應速率還存在一定限制，無細胞CO2固定系統將為克服生物體系缺點提供新思路、新方法。

6 總結與展望

C1大多來自低成本的工業副產品和生物質廢料，開發C1作為生物制造的替代原料，可以減少溫室氣體排放、降低生產成本，并帶來持續性的環境收益，是實現“碳達峰、碳中和”目標的重要途徑。將天然或改造的C1代謝途徑引入高性能生物技術宿主，結合工業微生物的生產力，可以充分發揮C1作為原料的優勢。合成生物學、代謝工程和ALE的發展促進了非天然C1生物轉化的研究，但其在代謝途徑設計、菌株構建、體系優化等方面仍面臨眾多挑戰。

構建合成型C1利用途徑可能會造成微生物代謝物、能量和輔因子失衡。C1利用途徑被引入到異源菌株會引起內外源途徑的競爭作用。例如，構建甲基營養體過程中，甲醛同化過程所需的共底物Ru5P是PPP的中間體，兩途徑間的碳流量競爭會影響甲基營養物質的利用，進而造成代謝流失衡、菌株生長異常。另外C1代謝途徑往往涉及多步能量和輔因子的轉化，胞內資源失衡限制了工程菌株對C1的高效利用。對此，多種C1協同作用為平衡生物質、能量和還原力提供了新的策略［6］。

合成型C1利用途徑效率低下，關鍵酶的活力不高。構建合成型C1利用微生物通常需要篩選多種外源酶，如甲烷營養體代謝途徑中的MMO、CO2固定過程中的RuBisCO等。異源表達的酶活往往較低，進而直接影響C1的利用效率。同時，酶的異源表達還需要考慮反應條件的可遷移性，如古菌中C1利用酶常在極熱、高鹽等極端環境中發揮作用［21， 26］；DC/4-HB循環中CO2固定酶需要金屬離子輔助反應［108］。酶活低下嚴重限制了C1途徑的高效運行。

相較于內源的中心代謝途徑，C1的生物利用途徑競爭力較弱。部分C1利用途徑涉及有毒中間體反應，對異源宿主產生毒害，如甲醇的代謝中間體甲醛，會使蛋白質、DNA之間或內部形成交聯，且甲醛在胞內的積累量難以調控，極易影響細胞的生理代謝［109］。此外，以C1為碳源的工程菌生長速率遠低于以多碳有機物為碳源的工程菌［5， 8， 13， 109］。野生型大腸桿菌在葡萄糖為碳源的培養基中代時約為20 min［110］，而合成型甲基營養體大腸桿菌的倍增時間為8.5 h［111］，利用CO2作為唯一碳源的自養大腸桿菌的生長時間則為（18±4）h［6］。

為了解決這些問題，各種新興的生物技術、學科交叉策略被應用于C1途徑工程的研究當中（圖5）。計算機輔助的代謝途徑設計在C1利用研究中展現出明顯的優勢，例如：THETA循環計算機算法試驗中，理性設計結合機器學習引導方法優化，將循環的產量提高了兩個數量級［96］；Bar-Even等［107］通過機器學習，設計了近千種固碳路徑，分析所有途徑并找到代謝核心結構，將其命名為MOG并完成了體外測試。

除了途徑的理性設計，ALE在構建高效的C1利用微生物方面同樣發揮著重要作用［112］。ALE利用篩選壓力富集優勢菌株，從宏觀水平快速積累有效突變，實現代謝流的平衡。Chen等［111］在ALE輔助下，獲得能夠以甲醇為唯一碳源的大腸桿菌工程菌，倍增時間為8.5 h；Gleizer等［6］以木糖為輔助碳源，結合ALE獲得僅從CO2合成生物質的新型自養生物。

此外，計算機輔助的酶工程策略可以加速C1代謝路徑中關鍵酶酶活的提升；協調酶的表達、優化碳代謝流、減少中間體積累、反饋調節等可以使代謝通量合理化；利用細胞膜類物質將C1代謝途徑與內源途徑分隔，有助于避免途徑串擾，或防止有毒代謝物影響細胞生理代謝；微生物群落效應可以建立C1天然利用微生物與異養微生物的共生系統，共享C1代謝產物。以上策略對解決合成型C1利用生物構建過程中的難點具有重要意義。

總的來說，目前C1的生物轉化已經獲得了諸多研究進展，對甲醇、CO、CO2作為C1底物的研究更為廣泛和深入。模式生物具備更清晰的宿主背景和更完備的遺傳操作工具，為合成型C1生物轉化技術提供了平臺，但異源途徑的途徑串擾和毒性中間體的毒害作用，對構建合成型C1生物轉化體系提出了新的挑戰。合成型C1的生物轉化技術為合成生物學、計算機算法實踐、酶工程等多領域提供了嶄新的舞臺，是未來多學科交叉、人類與人工智能相結合的創新領域。人工C1途徑豐富了C1的應用，為解決化石資源不可再生、環境污染等問題帶來了新的解決思路，是未來能源和化學品綠色、可持續生產，“碳達峰、碳中和”目標得以實現的關鍵策略。

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