一種缺失去泛素化功能的RHD1突變體保留特異性結合線性泛素鏈活性

摘 要：線性泛素鏈連接方式特殊且被發現時間較短，目前商用的線性泛素鏈特異性抗體種類少且特異性仍有待提高。RHD1是一種木瓜蛋白酶樣去泛素化酶，僅特異性識別線性泛素鏈。其主要酶活位點殘基的第13位半胱氨酸（C13）突變，使得RHD1突變體失去去泛素化功能，但是與線性泛素鏈的結合活性水平仍不高。本研究在此突變體的基礎上繼續優化互作界面點突變，期望實現提升特異性結合活性。為此，本研究利用RHD1和線性雙泛素蛋白復合物結構模型分析蛋白質間互作界面上氨基酸的理化性質，設計了RHD1突變體文庫。本研究通過重疊延伸PCR法定點突變RHD1多肽鏈氨基酸，使用大腸桿菌BL21（DE3）菌株表達突變體重組蛋白，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）成功篩選到與線性四泛素蛋白結合活性顯著提升的RHD1突變體，該突變體包含C13A與A92T點突變。該RHD1突變體有望被開發成為一種有助于研究線性泛素鏈的蛋白質配體工具，并且有巨大的潛力應用于臨床診斷和開發相關治療藥物。

關鍵詞：RHD1去泛素化酶；線性泛素鏈；定點突變；原核表達；酶聯免疫吸附法

中圖分類號：Q81" " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.05.006

Abstract： The special connection approaches of linear ubiquitin chain have been elucidated in recent years. Currently， the types of commercial linear ubiquitin chain specific antibodies are limited and their specificity still needs to be improved. RHD1 is a papain-like deubiquitinating enzyme that specifically recognizes and cleaves linear ubiquitin chains. The mutation at C13 in its enzymatic activity site results in the loss of deubiquitination function for the RHD1. Meanwhile， the RHD1 with this mutation still exhibits low binding activity towards linear ubiquitin chain. On the basis of this mutant， we optimized the mutations at interaction interface between RHD1 and Di-Ub （M1-linked） in order to enhance the specific binding activity of RHD1. In this study， we utilized the structural model of RHD1 and Di-Ub （M1-linked） complex to analyze the physical and chemical properties of all amino acids at the interaction interface and subsequently designed a RHD1 mutant library. The site-mutations in RHD1 variant polypeptides were generated by using overlap extension PCR method， and all recombinant variant proteins were expressed by using E. coli BL21 （DE3） strain. By employing the enzyme-linked immune sorbent assay （ELISA ） method for screening， we successfully identified a RHD1 variant harboring C13A and A92T mutations， which showed significantly increased affinity to Tetra-Ub （M1-linked）. This RHD1 variant holds great potential as a valuable tool for studying linear ubiquitin chains， and exhibits promising application in clinical diagnostics and the development of related therapeutic agents.

Key words： RHD1 deubiquitinating enzymes; Tetra-Ub （M1-linked）; site-specific mutation; prokaryotic expression; ELISA

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（5）： 439-449）

泛素化修飾（ubiquitination modification）是細胞內普遍存在的蛋白翻譯后修飾，在蛋白質降解和細胞信號轉導中起著重要作用［1-3］。泛素化修飾由76個氨基酸（amino acids，aa）組成的泛素蛋白（ubiquitin protein）介導產生。泛素蛋白通過共價連接到靶蛋白上，形成單泛素化或多聚泛素化修飾，通過不同的連接方式可以形成8種鏈型，包括K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63以及最后發現的線性泛素鏈M1［4］。線性泛素鏈由上一個泛素蛋白的N端甲硫氨酸與下一個泛素蛋白的C端甘氨酸首尾連接產生［5］，在細胞信號傳遞中扮演著關鍵角色，包括影響免疫受體信號傳導、激活NF-κB信號通路和參與抗病毒反應等［6-8］。由于泛素蛋白在多個生物活性調控過程中具有重要作用，因此深入研究線性泛素化修飾將為治療各種相關的炎癥性疾病和免疫缺陷提供新的策略和靶點［9-11］。在研究過程中，獲得一種具備高結合活性、高特異性結合線性泛素鏈的配體工具尤為重要。

泛素化是一個可逆的過程，去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUBs）介導泛素化修飾的去除和加工［12］，對維持蛋白質的穩態、調節蛋白質的降解和調控泛素蛋白介導的信號傳遞非常關鍵［13］。目前已經確認的能夠水解線性泛素鏈的去泛素酶有CYLD、OTULIN以及RavD等［14-17］。其中，RavD來自于嗜肺軍團菌（Legionella pneumophila），含有324個氨基酸殘基，對線性泛素鏈的水解活性具有特異性［18］。RHD1是其同源蛋白，與RavD具有83%的序列同源性，同樣對線性泛素鏈表現出高效的去泛素化酶活性。Wan等［17］通過解析RHD1（1～200 aa）與線性雙泛素蛋白［Di-Ub（M1-linked）］的復合物結構發現，RHD1的主要酶活位點為第13位半胱氨酸殘基（C13）。

線性化泛素鏈因其連接方式獨特，且被關注的時間較短，目前商業線性泛素鏈抗體很少并且特異性有待改進［19］。Sasaki等［20］使用單克隆抗體（LUB9）檢測了CD40誘導的NEMO線性泛素化，隨后被德國默克公司發展為商業化抗體：LUB9|MABS451。在實際應用過程中人們發現，該抗體雖能高效結合線性泛素鏈但仍保留了對其他泛素鏈類型如K48、K63泛素鏈的結合能力，因此認為該抗體識別并結合線性泛素鏈的特異性不高。隨著對線性鏈生物學功能的深入研究，對應的線性泛素鏈抗體研發成為了領域內關注的焦點之一。獲得高效且高特異性的線性鏈抗體/配體工具不但能保證線性鏈相關功能研究的質量，而且在臨床診斷和開發治療劑方面也具有巨大潛力。

RHD1作為能夠特異性識別并切割線性泛素鏈的蛋白，具有改造成特異性結合線性泛素鏈的蛋白質工具的潛力。本試驗前期研究發現，通過突變消除酶切活性的RHD1突變體結合線性泛素鏈的結合活性不強。為了提高結合活性，本試驗利用蛋白質結構分析軟件對RHD1（1～200 aa）和Di-Ub（M1-linked）結合界面上的氨基酸位點逐個分析，選取C13、D44、A92、S112、S114和V175六個潛在位點，構建RHD1突變體文庫。利用酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）對突變體重組蛋白的結合活性和特異性進行檢測，最終成功篩選出結合活性顯著提高的突變體——RHD1-C13A-A92T。該RHD1突變體可作為一種研究線性泛素鏈特異性結合的蛋白質工具，有助于線性泛素化相關的科學研究。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

主要試劑及耗材：5 000 bp DNA marker和DH5α感受態（北京擎科生物科技有限公司）；Tetra-Ub（K48-linked）和Tetra-Ub（K63-linked）（美國Ramp;D公司）；Bam HI限制性內切酶、Asc I限制性內切酶、Q5高保真酶和T4 DNA連接酶（美國NEW ENGLAND BioLabs公司）；96孔ELISA包被板和50 mL離心管（廣州潔特生物股份有限公司）；10 kD超濾管、聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）和線性泛素鏈抗體LUB9|MABS451（德國默克公司）；3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB）單組分顯色液、凝血酶、考馬斯亮藍R250、氨芐青霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）和二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）（北京索萊寶科技有限公司）；苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonylfluoride，PMSF）、ECL（enhanced chemiluminescence）化學發光底物、谷胱甘肽S-轉移酶（glutathione S-transferase，GST）蛋白標簽蛋白純化樹脂和脂質體2 000（北京碧云天生物科技有限公司）；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）-conjugated Mouse anti-GST-Tag mAb、HRP標記山羊抗小鼠二抗和HRP標記山羊抗人二抗（武漢愛博泰克生物科技有限公司）；三色預染蛋白Marker 10～250 kD（上海雅酶生物公司）；三色預染蛋白Marker 8～180 kD（上海翌圣生物科技）；線性泛素鏈單克隆抗體（該單抗未被商業化，美國基因泰克公司）。本試驗所使用的化學試劑均為分析純。

主要儀器：冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；PCR儀（美國伯樂生物醫學產品有限公司）；AKTA PURE層析系統（美國思拓凡公司）；酶標分析儀（南京迪樂嘉生物科技有限公司）；立式恒溫振蕩器（美國精騏有限公司）；軌道搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 構建重組質粒

圖1a所示為RHD1（1～200 aa）和RavD（1～200 aa）的同源性分析。圖1b所示為RHD1（1～200 aa）及Tetra-Ub（M1-linked）的重組質粒圖譜。圖1c所示為RHD1（1～200 aa）和Di-Ub（M1-linked）復合物結構圖（PDB：6njd）。如圖2所示，構建RHD1突變體重組質粒采用重疊延伸PCR法［21］（gene splicing by overlap extension polymerase chain reaction，SOE-PCR）。所有點突變引物序列見表1所示。SOE-PCR需進行兩次簡單PCR，第一次PCR，以RHD1（1～200 aa）或其突變體為模板，分別采用F1和R2、F2和R1兩對引物獲得兩段目的基因片段。第二次PCR，則以兩段目的基因片段為模板，采用F1和R1引物獲得完整的目的基因片段。之后用雙酶切法處理目的片段及載體pGEX-6P-2，再用T4 DNA連接酶連接二者獲得重組質粒。最后，將其轉入DH5α感受態，挑取單克隆并測序鑒定，獲得新的RHD1突變體重組質粒文庫。

1.3 表達純化GST-RHD1突變體蛋白

將獲得的RHD1突變體重組質粒轉入大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞后，37℃過夜培養。第二天挑菌轉入LB（Luria-Bertani）液體培養基，37℃培養，直至菌液生長達到對數期，此時加入0.4 mmol/L IPTG，20℃過夜培養。第二天離心菌液（6 000 g，15 min）并保留沉淀。之后，用超聲波破碎儀破碎沉淀，再對菌液進行離心（11 000 g，30 min）。將上清與其體積為1/20的GST標簽蛋白純化樹脂混合，4℃搖轉1 h。之后，利用GST親和層析法和重力純化柱純化重組蛋白。大量洗雜緩沖液（300 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris，pH 8.0，2 mmol/L DTT，5%甘油）洗去未吸附蛋白，適量洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，洗脫緩沖液為添加15 mmol/L 還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）的洗雜緩沖液。然后，利用10 kD超濾管濃縮蛋白，并用100倍體積磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）在4℃條件下透析10 h。最后，在GST-RHD1突變體融合蛋白樣品中加入20%體積的甘油后，于-20℃保存。

1.4 表達純化GST-Tetra-Ub（M1-linked）

GST-Tetra-Ub（M1-linked）純化過程如步驟1.3所述。將重組蛋白與凝血酶混合，在37℃條件下孵育30 min，酶切后重組蛋白被切割為GST和Tetra-Ub（M1-linked）。利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法分析切割后的重組蛋白條帶，直至被完全切割。隨后，再利用安裝了HiTrap Q HP陰離子交換層析柱的AKTA-PURE系統分離Tetra-Ub（M1-linked）和GST。這兩種蛋白在Tris緩沖液環境中所帶電荷不同，可通過改變洗脫液的鹽離子濃度進行梯度洗脫。洗脫液A含有50 mmol/L Tris（pH 8.0），而洗脫液B含有50 mmol/L Tris和1 mol/L NaCl（pH 8.0）用于線性梯度洗脫。收集各洗脫峰，測蛋白質濃度以及含量，使用10 kD超濾管濃縮Tetra-Ub（M1-linked），并用100倍體積PBS在4℃條件下透析10 h。最后在蛋白樣品中加入20%體積的甘油后，于-20℃保存。

1.5 檢測RHD1突變體文庫與線性泛素鏈結合活性以及特異性

將200 ng每孔的Tetra-Ub（M1-linked）蛋白包被到96孔ELISA反應板內，4℃放置過夜。每孔加入200 μL含吐溫20的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline with tween20，PBST）洗滌孔板，重復3次。再在每孔添加300 μL的封閉液（PBS 含10%脫脂牛奶）室溫封閉2 h。用PBST洗滌1次后，再加入用PBS緩沖液4倍梯度稀釋的RHD1野生型或突變體蛋白（初始濃度為100 μg/mL），每個樣品共8個稀釋梯度，室溫孵育2 h。用PBST洗滌3次后，每孔加入100 μL1：5 000 稀釋的HRP-conjugated Mouse anti GST-Tag mAb，室溫孵育1 h。再用PBST洗滌3次后，每孔加入100 μL TMB單組份顯色液，37℃孵育15 min后加入等體積的2 mol/L硫酸終止反應。最后，用酶標儀讀取450 nm波長處的光密度（optical density，OD）值。

為檢測RHD1突變體文庫特異性，在96孔ELISA反應板的每孔內包被50 ng的Tetra-Ub（M1/K48/K63-linked）蛋白，并挑選一些與線性泛素鏈結合活性較高的RHD1突變體蛋白進行特異性分析。利用RHD1野生型蛋白作為陰性對照，線性泛素鏈抗體LUB9|MABS451作為陽性對照，二抗使用HRP標記的山羊抗小鼠二抗。

1.6 GST pull-down

我們將GST-RHD1突變體融合蛋白親和固化在GST親和樹脂上，作為與目的蛋白親和的支撐物，充當一種誘餌蛋白來捕獲線性泛素鏈。將100 μg包含GST標簽的RHD1-C13A-A92T突變體融合蛋白和100 μg作為陰性對照的GST蛋白分別與100 μL GST親和樹脂在4℃混合孵育3 h。使用500 μL PBS緩沖液洗滌樹脂，離心（1 500 r/min，5 min）后棄去上清液，并重復3次洗滌過程，將樣品于-20℃保存。取少量包含樹脂的混合蛋白樣品制樣進行SDS-PAGE鑒定，分析結合在樹脂上的目的融合蛋白的含量，以確定誘餌蛋白已成功連接到樹脂上。

之后，我們設計試驗檢驗RHD1突變體結合哺乳動物細胞內表達的線性泛素鏈。使用脂質體2 000包裹3種分別表達HOIP、HOIL-1和SHARPIN的重組質粒，轉染HEK239T細胞進行表達線性泛素鏈。轉染空脂質體2 000的細胞作為陰性對照。轉染24 h后，使用含100 mmol/L PMSF的RIPA（radio immunoprecipitation assay lysis）裂解液裂解細胞并離心（11 000 r/min，15 min），將收集的上清與10 μg 上述制備的帶有誘餌蛋白的樹脂混合，在4℃條件下孵育1 h。使用500 μL PBS緩沖液洗滌樹脂，離心（1 500 r/min，5 min）后棄去上清液，并重復3次洗滌過程。將樹脂樣品制樣后進行蛋白免疫印跡試驗，轉PVDF膜后，使用基因泰克公司的線性泛素鏈抗體（1：1 000稀釋）作為一抗結合目的蛋白，二抗使用HRP標記山羊抗人二抗（1：5 000稀釋），之后加入ECL化學發光底物顯影。完成上述試驗后，繼續對PVDF膜進行考馬斯亮藍染色分析，以確定各組誘餌蛋白量是基本一致。

1.7 統計學方法

應用GraphPad Prism 10.0等軟件對數據進行統計學分析與作圖。各組數據用平均值±標準差（x±s）來表示。

2 結果與分析

2.1 獲得73個RHD1突變體重組質粒

如表1所示，本試驗選取C13、D44、A92、S112、S114和V175共6個氨基酸位點進行點突變。利用SOE-PCR，獲得RHD1重組質粒共計73個。在已確定突變位點范圍的前提下，我們隨機選擇了如表2所示的突變點組合。

2.2 純化與鑒定RHD1蛋白突變體

依照方法1.3獲得的73個重組質粒經大腸桿菌BL21（DE3）菌株表達，并利用GST樹脂親和層析純化重組蛋白。經12% SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色分析，如圖3所示，重組GST-RHD1蛋白突變體均成功表達，目的蛋白條帶稍大于43 kD 標準蛋白。

2.3 RHD1突變體和Tetra-Ub（M1-linked）結合活性顯著增強

由于RHD1和Tetra-Ub（M1-linked）均為融合表達，需切割Tetra-Ub（M1-linked）上的GST標簽蛋白以便后續進行ELISA試驗來分析RHD1突變體的結合活性。如圖4a所示，用凝血酶處理RHD1-Tetra-Ub（M1-linked）后，經12% SDS-PAGE鑒定凝血酶酶切完全，Tetra-Ub（M1-linked）上的GST標簽蛋白被全部切割下來。如圖4b所示，為了獲得高純度Tetra-Ub（M1-linked），我們使用HiTrap Q HP柱和AKTA-PURE系統進一步分離泛素鏈和GST，未被陰離子柱結合的RHD1-Tetra-Ub（M1-linked）蛋白的流穿峰出現在～6 mL處，隨著鹽濃度提升而被洗脫的GST標簽蛋白的洗脫峰出現在～80 mL處。

如圖5所示，在RHD1突變體文庫中，與Tetra-Ub（M1-linked）結合活性大幅度提升的有10號、20號、24號、39號、47號、52號、67號和71號突變體。我們也選用這些RHD1突變體進一步評價其與線性泛素鏈結合的特異性。

2.4 突變體RHD1-C13A-A92T與線性泛素鏈的結合活性與特異性最強

如圖6所示：RHD1-C13A-A92T突變體在較低質量濃度時仍表現出對Tetra-Ub（M1-linked）的高結合活性和特異性，是研究線性泛素化的有力工具；本試驗獲得的其他RHD1突變體喪失特異性識別結合Tetra-Ub（M1-linked）的能力。線性泛素鏈抗體LUB9|MABS451在較低質量濃度下與Tetra-Ub（M1/K48/K63-linked）都表現出高結合活性，展現出非特異性。野生型RHD1在較高質量濃度時與Tetra-Ub（K48-linked）有較低結合活性，而RHD1-C13A-A92T突變體與Tetra-Ub（M1-linked）間的特異性結合活性更強。

2.5 突變體RHD1-C13A-A92T可富集線性泛素鏈

如圖7所示，在轉染LUBAC復合物到HEK293T細胞的組中，標簽蛋白GST不能與HEK293T中的線性泛素鏈高效結合，而突變體RHD1-C13A-A92T可與HEK293T中的線性泛素鏈高效結合，這說明RHD1-C13A-A92T可作為特異性蛋白質工具在細胞內富集線性泛素鏈。

3 討論

本研究通過氨基酸點突變方法改造蛋白質相互作用界面殘基，在消除RHD1去泛素化酶活性的同時提升其與線性泛素鏈特異性結合活性。該RHD1突變體將有望作為一種研究細胞內線性泛素鏈含量及其活性變化的蛋白質配體檢測工具。本文利用已有的RHD1和線性雙泛素蛋白復合物結構作為改造分析模型，通過Coot蛋白質結構分析軟件分析蛋白質界面上相互作用的殘基，基于相關氨基酸的理化性質推測出RHD1互作界面上可能的增強相互作用的氨基酸點突變，分別包括C13、D44、A92、S112、S114和V175。基于這些位點作組合突變生成突變體文庫，成功篩選到與Tetra-Ub（M1-linked）具有高結合活性和特異性的突變體RHD1-C13A-A92T。本試驗的結果說明，從蛋白質功能需求出發，通過篩選合適的點突變組合來改造蛋白質的策略是行之有效的。

最近蛋白質工程研究領域中報道了大量關于理性設計蛋白質結構的相關研究。這些研究大多是利用蛋白質結構關鍵拓撲信息推測蛋白質高級結構以達到定向改造其功能的目的，相關研究方法對本課題的改造工作具有一定的借鑒意義。Yang等［22］開發了GT-Predict生物信息學預測模型并鑒定出白藜蘆醇的糖基轉移酶1（glycosyltransferase superfamily 1，GT1）家族蛋白酶的新作用底物，再通過體外試驗驗證了對相關底物的有效催化作用。Taft等［23］開發了一種機器學習指導的深度突變學習方式，分析了大量包含組合突變的新型冠狀病毒S蛋白的RBD序列，準確預測了各種組合突變對ACE2結合活性和抗體逃逸的影響。Ye等［24］用Rosetta技術對呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）的F蛋白胞外域序列進行了結構計算分析，構建了近400個編碼F蛋白的重組質粒，最終獲得了優化的融合前構象的F蛋白疫苗抗原，其抗原的穩定性及免疫原性均顯著增強。

隨著計算機科學和人工智能輔助技術的發展，蛋白質工程正在由定向進化轉為理性計算設計。理性設計蛋白質靠的是選擇關鍵氨基酸位點并縮小構建突變文庫范圍，在短時間內能有效篩選突變文庫。實現該目標需要深入了解蛋白質的結構、功能和理化性質。以前的相關研究主要根據氨基酸序列預測蛋白質的三維結構，準確度偏低阻礙了蛋白質工程發展。近年來，AlphaFold2軟件技術顯著提升了預測精度，AlphaFold2［25］從端到端的蛋白質結構預測算法打破了在沒有類似結構的情況下可以規則地以原子精度預測蛋白質結構的束縛。尤其是近期成功開發的AlphaFold3［26］，能夠更準確地預測包含更廣泛的蛋白質以及其他生物分子的復合物結構，這為我們深入優化改造相關去泛素化酶提供了結構模型和理論支持。Rosetta通過多肽鏈間接觸或者是氨基酸殘基相互作用預測來構建復合蛋白質結構，包含一個打分函數計算由L-氨基酸組成的球狀蛋白質中各原子間相互作用的能量以及自由能變化［27］。本研究分別利用相關技術預測了RHD1和不同長度線性泛素鏈蛋白的復合結構，分析了界面上可能的突變點作為參考，并圍繞綜合分析出的潛在突變位點，依據原子間潛在的電荷吸引排斥力、氫鍵、范德華力和疏水作用力等指標，同時考慮到避免破壞已有關鍵氨基酸結合，最終確定了點突變。

成功篩選到與線性泛素鏈特異性結合活性更高的RHD1突變體可為進一步優化開發蛋白配體工具提供研究經驗，并助力線性泛素化修飾在受體信號傳導、激活NF-κB信號通路和抗病毒細胞反應方面的研究。

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