調控多殺菌素生物合成重要功能基因的挖掘及其作用機制

摘 要：合成生物學在高效底盤細胞構建、活性天然產物挖掘以及代謝途徑優(yōu)化改造等方面能全力推進目標天然產物高效生物制造。然而，在刺糖多孢菌合成生物學研究中，由于對調控多殺菌素生物合成的重要功能基因及其作用機制了解甚少，難以通過“設計-構建-測試-學習”策略構建高效細胞工廠以大幅提高多殺菌素產量。為解決該問題，本研究在通過人工誘變獲得一株具有多殺菌素產量提高、生長速率增快以及胞外葡萄糖攝取能力增強的優(yōu)良底盤菌株CW-12基礎上，對其進行了比較蛋白質組學分析。研究結果發(fā)現(xiàn)，與細胞內碳代謝、脂肪酸代謝、氨基酸生物合成、三羧酸循環(huán)等相關的代謝途徑的增強是誘變株CW-12多殺菌素生物合成能力提高的重要原因，并篩選到668個表達水平上調的蛋白。隨后，我們選擇3-羥脂酰輔酶A脫氫酶（SS_2202）和乙酰輔酶A乙酰基轉移酶（SS_2203）進行了作用機制分析，明確其過表達能有效促進多殺菌素生物合成。該研究對如何挖掘調控多殺菌素生物合成的重要功能基因及其作用機制解析具有一定的指導意義，為后續(xù)通過合成生物學策略構建多殺菌素高效生物合成細胞工廠奠定了重要基礎。

關鍵詞：刺糖多孢菌；多殺菌素；合成生物學；比較蛋白質組分析；基因編輯

中圖分類號：Q93" " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.05.007

Abstract： Synthetic biology can fully promote the efficient bio-manufacturing of target natural products in the aspects of efficient chassis cell construction， active natural product mining and metabolic pathway optimization. However， in the study of synthetic biology of Saccharopolyspora spinosa， due to the limited understanding of the important functional genes regulating spinosyn biosynthesis and their action mechanisms， it is difficult to construct efficient cell factories to significantly increase the spinosyn production through the “design-build-test-learn” strategy. In order to solve this problem， an excellent chassis strain CW-12 with high spinosyn production， fast growth rate and strong extracellular glucose uptake ability was obtained by artificial mutagenesis， and comparative proteomic analysis was performed. The results showed that the enhancement of metabolic pathways related to intracellular carbon metabolism， fatty acid metabolism， amino acid biosynthesis， and TCA cycle was an important reason for the improvement of spinosyn biosynthesis of mutant CW-12， and 668 up-regulated proteins were screened. Subsequently， we selected 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase （SS_2202） and acetyl-CoA acetyltransferase （SS_2203） to analyze their action mechanisms， confirming that their overexpression can effectively promote the spinosyn biosynthesis. This study has certain guiding significance on how to explore the important functional genes regulating spinosyn biosynthesis and the analysis of their action mechanisms， and lays an important foundation for the subsequent construction of spinosyn efficient biosynthesis cell factories through synthetic biology strategies.

Key word： Saccharopolyspora spinosa; spinosyn; synthetic biology; comparative proteomic analysis; gene editing

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（5）： 450-460）

農作物病蟲害是現(xiàn)代農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要障礙之一，而長期依賴和大量使用有殘留的化學農藥帶來的農產品安全和生態(tài)環(huán)境污染，也成為了制約農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的技術瓶頸。因此，研制高效廣譜綠色安全的生物殺蟲劑對保障農業(yè)可持續(xù)發(fā)展、保護生態(tài)環(huán)境和增強農產品國際市場競爭力意義重大。多殺菌素（spinosyn）是由刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）經好氧發(fā)酵產生的具有快速觸殺及攝食毒性的大環(huán)內酯類次生代謝產物，在防治農林害蟲、儲糧害蟲、衛(wèi)生害蟲以及牲畜寄生蟲上面發(fā)揮著重要作用，是當前國際上能取代有殘留化學農藥最有發(fā)展前景的綠色生物殺蟲劑［1-2］。然而，由于野生型刺糖多孢菌多殺菌素合成量較低、發(fā)酵周期長，極大地限制了其在農業(yè)上的大規(guī)模推廣應用［3］。

隨著合成生物學的迅速發(fā)展，越來越多的研究專注于改造微生物細胞工廠以獲得目標天然產物高效生物合成的工程菌株。目前，利用合成生物學技術提高目標天然產物產量的經典方法是“開源節(jié)流”。“開源”主要包括增加前體物質和輔因子供應，過表達正調控基因和增加參與目標天然產物生物合成的酶活性；“節(jié)流”主要包括敲除負調控基因，減少前體物質分流和阻斷競爭代謝旁路等［4-5］。如在促升N-乙酰氨基葡萄糖（N-Acetyl-D-Glucosamine）產量研究中，通過提高正調控轉錄因子RamAM 表達、CRISPRi系統(tǒng)干擾負調控轉錄因子（RamB、LldR、FruR和AmtR）表達、定點突變甘油醛-3-磷酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶基因以及發(fā)酵罐放大生產，可使其效價達到117.10 g/L，為對照組的6.62倍［6］。同樣，通過在大腸桿菌 BL21（DE3）依次敲除基因tyrR、ptsG、crr、pykF及pheA，過表達galP、glk、tktA和ppsA，定向進化HpaB，最終使左旋多巴（L-DOPA）的發(fā)酵產量達到25.53 g/L［7］。為解決刺糖多孢菌合成多殺菌素能力低的瓶頸，近年來，研究人員也采取了合成生物學的策略對其進行改造以提高多殺菌素產量［3］。已有研究發(fā)現(xiàn)，提高合成前體供應能力是促進多殺菌素生物合成的重要策略。Cao等［9］對刺糖多孢菌中的兩個脂肪酶基因lip886和lip385進行共表達以優(yōu)化該菌株利用三酰甘油合成乙酰輔酶A的能力，可使多殺菌素產量提高5.5倍。在功能基因的定向改造與組合修飾研究中，如類Pirin家族蛋白基因（sspirin）、乙偶姻利用蛋白基因（acuC）、鼠李糖合成基因（gtt、gdh、epi和kre）等［9-11］，均可有效增強菌株基礎代謝能力，進而提高多殺菌素產量。此外，有研究團隊選擇通過異源生物合成的策略將多殺菌素生物合成基因簇分別置于紅色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea）、白色鏈霉菌（Streptomyces albus）、天藍色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）、變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans）等模式菌株中，實現(xiàn)了多殺菌素的異源表達，但產量極低，最高產量不足100 mg/L［3， 12-14］。雖然，上述研究有效促進了多殺菌素生物合成，但參與多殺菌素生物合成的關鍵功能基因未知，導致難以選擇合適的靶基因進行定向改造來大幅提高其產量進而限制它的廣泛應用。因此，現(xiàn)在研究的焦點還是在于如何挖掘影響多殺菌素高效生物合成的關鍵酶和調控因子及其作用機制解析。

本研究以刺糖多孢菌630為出發(fā)菌株，經多輪紫外誘變處理獲得了一株多殺菌素合成能力增強且產量穩(wěn)定的突變株CW-12。結合比較蛋白質組分析發(fā)現(xiàn)，該菌株通過脂肪酸降解代謝合成乙酰輔酶A等前體的能力增強是其多殺菌素產量提高的重要原因，并篩選到14個表達豐度顯著上調的蛋白。在此基礎上，我們選擇參與脂肪酸降解的兩個顯著上調蛋白3-羥脂酰輔酶A脫氫酶（SS_2202）和乙酰輔酶A乙酰基轉移酶（SS_2203）進行研究，明確其在出發(fā)菌株630中過表達后均能促進多殺菌素生物合成，同時對菌株的生長發(fā)育與胞外葡萄糖的攝取均有一定的影響。上述研究結果為進一步挖掘影響多殺菌素生物合成的關鍵功能蛋白提供了有價值的見解，也為后續(xù)利用合成生物學技術促進多殺菌素高效生物合成提供了重要的修飾基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒和引物

本研究所用的相關菌株和質粒見表1，所用引物見表2。

1.1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

使用細菌LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基用于大腸桿菌DH5α的活化與培養(yǎng)；使用完全補充培養(yǎng)基（complete supplement medium，CSM）用于刺糖多孢菌種子活化；使用半合成發(fā)酵培養(yǎng)基用于刺糖多孢菌多殺菌素產量、菌體密度、胞外葡萄糖含量測定以及菌絲體形態(tài)觀察；使用R5培養(yǎng)基用于刺糖多孢菌原生質體轉化試驗。上述培養(yǎng)基配方按照參考文獻［15］提供的配方進行配置，所使用抗生素為阿泊拉霉素（apramycin，Apr），終質量濃度為50.0 mg/mL。

1.1.3 主要試劑

PrimeSTAR HS DNA聚合酶、限制性內切酶Nde I、EcoR I、T4 DNA聚合酶、DL 5 000 DNA marker購自寶生物工程有限公司；細菌基因組DNA和質粒DNA提取試劑盒、PCR產物回收試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；抗生素等其他生化試劑均購自天恒生物科技有限公司。

1.2 刺糖多孢菌630紫外誘變

在超凈工作臺中取原始菌株孢子懸液20 μL，均勻涂布于固體平板上，打開培養(yǎng)皿蓋，進行紫外照射，參照文獻［16］的紫外處理方法選擇紫外照射時間30 s。將紫外照射后的平板立即用黑紙包裹避光并倒置30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d，觀察其生長情況。待平板長出單克隆后，隨機挑取多個單克隆進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，并使用高效液相色譜1290對發(fā)酵液中多殺菌素產量進行檢測，篩選獲得高產誘變株，同時作為后一輪紫外誘變的出發(fā)菌株。經3輪紫外誘變篩選后，最終獲得多殺菌素高產誘變株CW-12。

1.3 誘變株多殺菌素產量分析

按5%接種量將誘變株與出發(fā)菌株接種于半合成發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵。由于多殺菌素在發(fā)酵至240 h時，其產量會趨于穩(wěn)定，因此取該時間點的發(fā)酵液用于多殺菌素產量測定［17］。樣品處理及檢測步驟如下：取0.5 mL發(fā)酵液和等體積乙酸乙酯于1.5 mL EP管中混勻，在經過70℃水浴鍋中水浴1 h以及超聲破碎99次后，12 000 g離心10 min，取上清液轉移至新的EP管內并用冷凍濃縮儀進行濃縮至管中僅剩淡黃色固體，隨后加入0.1 mL甲醇進行溶解，12 000 g離心10 min，取上清用于檢測樣品中多殺菌素含量。本研究利用高效液相色譜1290檢測分析多殺菌素含量，其檢測條件如下：色譜柱型號為ZORBOX SB-C18，規(guī)格為柱長150 mm，柱內徑4.6 mm，柱溫40℃；以乙腈：水體積比為1：9和9：1分別配制流動相A和流動相B，上樣體積為10.0 μL，流速為1.0 mL/min，檢測波長為250 nm。同時，收集目的峰進行質譜鑒定，檢測條件如文獻［9］所述。

1.4 高產誘變株CW-12比較蛋白質組分析

按5%接種量將高產誘變株CW-12與出發(fā)菌株接種于半合成發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵，取培養(yǎng)至96 h的發(fā)酵液用于比較蛋白質組分析。聯(lián)合液氮研磨和超聲破碎的方法提取菌體全蛋白，詳細提取方法見文獻［18］。對提取好的菌體全蛋白采用考馬斯亮藍（Bradford）法進行定量分析和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，確定提取樣品是否合格，隨后，對菌體全蛋白進行胰蛋白酶酶解，酶解肽段脫鹽后進行同位素標記和肽段質譜解析。獲得的各樣品質譜原始圖譜使用 SCIEX公司的ProteinPilot軟件（v4.5）加工處理，進行數(shù)據(jù)庫檢索鑒定蛋白和相對定量分析，所用蛋白庫為Saccharopolyspora，來自于NCBI；將差異倍數(shù)（fold change） gt;1.5或lt;0.67，Plt;0.05為篩選顯著差異表達蛋白的域值。在獲得差異表達蛋白的基礎上，進行基因本體（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）代謝途經分析，篩選與多殺菌素生物合成相關的重要酶等。

1.5 SS_2202和SS_2203基因過表達載體構建

以刺糖多孢菌基因組為模板，設計引物對SS_2202-F/SS_2202-R和SS_2203-F/SS_2203-R，分別擴增出SS_2202和SS_2203基因片段。然后將純化后的SS_2202和SS_2203與pIB139載體同時經Nde I/EcoR I雙酶切以及T4 DNA連接酶連接，最后將連接產物通過熱激轉化轉入大腸桿菌DH5α中，并涂布于含有阿泊拉霉素的LB固體板上。待平板長出轉化子后，隨機挑取6～8個單克隆進行培養(yǎng)和質粒提取，提取的重組質粒經PCR鑒定和測序驗證，最終獲得過表達載體pIB139-SS_2202和pIB139-SS_2203。

1.6 SS_2202和SS_2203基因過表達工程菌構建

采用原生質體轉化的方法來構建工程菌株S. spinosa：：SS_2202和S. spinosa：：SS_2203。分別將構建成功的過表達載體pIB139-SS_2202和pIB139-SS_2203在PEG2000的介導下與刺糖多孢菌630原生質體進行混合，并涂布于R5固體板上，經阿泊拉霉素覆抗后在恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待平板上長出轉化子，隨機挑取6～8個單克隆進行培養(yǎng)和基因組提取，通過對轉化子進行PCR驗證，最終獲得過表達菌株S. spinosa：：SS_2202和S. spinosa：：SS_2203。

1.7 SS_2202和SS_2203基因過表達工程菌生理生化特征分析

按5%接種量將過表達菌株S. spinosa：：SS_2202和S. spinosa：：SS_2203與出發(fā)菌株630接種于半合成發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵。取發(fā)酵至240 h的發(fā)酵液用于多殺菌素產量分析，分析方法同1.3。每24 h取一次發(fā)酵液用于菌體密度和胞外葡萄糖含量測定，采用分光光度計法來測定菌體含量，測定波長為600 nm，采用葡萄糖測定試劑盒測定胞外葡萄糖含量，測定波長為540 nm。取發(fā)酵至48 h和96 h的發(fā)酵液經戊二醛固定和乙醇脫水后，使用冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡SU8010對其進行菌絲體形態(tài)觀察。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用單因素方差分析方法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，Plt;0.05即差異有統(tǒng)計學意義；使用GraphPad Prism 8軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 高產多殺菌素紫外誘變菌株篩選

本研究使用紫外照射時間30 s作為誘變篩選條件，經多輪誘變篩選，獲得一株多殺菌素產量提高5.2倍的紫外誘變菌CW-12（圖1a）。多次傳代培養(yǎng)證實，誘變株CW-12多殺菌素產量穩(wěn)定。對該菌株生長曲線和葡萄消耗曲線進行測定，結果顯示，誘變株CW-12的生長速率與最大菌體密度均要高于出發(fā)菌株630（圖1b）。葡萄糖消耗曲線顯示，兩種菌株葡萄糖消耗趨勢基本相同，但誘變株CW-12胞外葡萄糖濃度的下降幅度明顯要強于出發(fā)菌株630，且在發(fā)酵至第10天時，發(fā)酵液中幾乎檢測不到葡萄糖，而出發(fā)菌株630在發(fā)酵至第8天，發(fā)酵液中葡萄糖含量幾乎不再變化（圖1c）。上述分析結果表明，誘變株CW-12具有高產多殺菌素、生長速率快且利用胞外葡萄糖能力強的特點。

2.2 高產誘變株CW-12與出發(fā)菌株630比較

蛋白質組分析

本研究利用定量蛋白質組學分析技術分別對高產誘變株CW-12與出發(fā)菌株630培養(yǎng)至96 h的菌體全蛋白進行比較分析。經質譜鑒定，共鑒定出3 436個特征性蛋白，并對這些蛋白進行KEGG通路分析，以便從通路上展示這些蛋白之間的關聯(lián)。結果如圖2a所示，這些蛋白參與的代謝通路涵蓋次生代謝產物生物合成（biosynthesis of secondary metabolites）、脂肪酸生物合成（fatty acid biosynthesis）和脂肪酸代謝（fatty acid metabolism）等，說明本次研究所選擇的時間點的代謝途徑較為活躍，尤其是與脂肪酸代謝相關的途徑。一般來說，蛋白表達豐度變化與細胞特定生理生化過程發(fā)生相關。為揭示誘變株CW-12特定生理生化過程變化的原因，我們對該菌株存在的差異表達蛋白進行統(tǒng)計，取 fold change gt;1.5 或 lt;0.67，P value lt;0.05的蛋白為差異表達蛋白。結果如圖2b顯示，在誘變株CW-12中共鑒定到992個差異表達蛋白，其中上調蛋白668個，下調蛋白324個。隨后，本研究對上調蛋白進行KEGG通路分析，結果如表3所示，這些蛋白大多富集在與細胞內碳代謝（carbon metabolism）、脂肪酸代謝（fatty acid metabolism）、氨基酸生物合成（biosynthesis of amino acids）、三羧酸循環(huán)（TCA cycle）等相關的代謝途徑中，上述代謝途徑增強很可能為誘變株CW-12多殺菌素生物合成提供更多的前體和能量，最終提高多殺菌素產量。

2.3 高產誘變株CW-12脂肪酸降解途徑分析

乙酰輔酶A作為大多數(shù)聚酮化合物生物合成的前體，可以通過β-氧化途徑使脂肪酸降解來增加細胞內濃度。本研究繼續(xù)對誘變株CW-12中參與脂肪酸降解途徑的差異表達蛋白進行了分析，結果如圖3和表4所示。共有14個上調蛋白參與脂肪酸降解途徑，包括脂酰輔酶A合成酶（4個）、脂酰輔酶A氧化酶（2個）、脂酰輔酶A脫氫酶（6個）、3-羥脂酰輔酶A脫氫酶（1個）、乙酰輔酶A乙酰基轉移酶（1個），推測上述蛋白的上調很可能促進出發(fā)菌株630脂肪酸高效轉化生成乙酰輔酶A，滿足了多殺菌素生物合成前體的供應。為驗證該猜想，本研究選擇3-羥脂酰輔酶A脫氫酶（SS_2202）和乙酰輔酶A乙酰基轉移酶（SS_2203）進行驗證，編碼上述兩個酶的基因在基因組中的表達受同一個啟動子控制。

2.4 SS_2202和SS_2203基因過表達工程菌構建

過表達載體pIB139-SS_2202和pIB139-SS_2203的構建流程如圖4a所示。以刺糖多孢菌基因組為模板進行擴增，得到大小分別為1 215 bp的SS_2202基因和2 217 bp的SS_2203基因，經酶切和酶連后，轉入大腸桿菌DH5α中。對從平板挑取的轉化子進行Nde I和EcoR I雙酶切驗證，結果如圖4b所示，所挑取的轉化子分別可切出大小為1 215 bp和2 217 bp的目標條帶，經測序驗證無突變后，得到過表達載體pIB139-SS_2202和pIB139-SS_2203。

分別將構建成功的過表達質粒pIB139-SS_2202和pIB139-SS_2203通過原生質體轉化轉入出發(fā)菌株630中。以能否在阿泊拉抗性平板上長出轉化子來初步判斷過表達質粒是否轉化成功，然后，提取轉化子基因組，以apr-F/apr-R為引物對，對轉化子基因組進行PCR驗證，結果如圖4c所示。所挑取的轉化子基因組可擴增得到大小約為1.2 kb的apr基因，而對照組未擴增出相應條帶，說明過表達質粒已轉入出發(fā)菌株630中，SS_2202和SS_2203基因過表達工程菌構建成功。

2.5 SS_2202和SS_2203基因過表達對刺糖多孢菌多殺菌素生物合成的影響

利用超高效液相色譜安捷倫1290（HPLC1290）檢測分析出發(fā)菌株630與過表達菌株S. spinosa：：SS_2202和S. spinosa：：SS_2203發(fā)酵液中多殺菌素產量。結果顯示，出發(fā)菌株在保留時間為21.73 min處的色譜峰有明顯的多殺菌素色譜峰特征，經液相色譜-質譜聯(lián)用儀（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）鑒定，發(fā)現(xiàn)該時間點的色譜峰存在質荷比為732和746的質譜峰，分別為多殺菌素A和多殺菌素D（圖5）。經比較發(fā)現(xiàn)，出發(fā)菌株630多殺菌素峰面積為6 115.4 mAU，過表達菌株S. spinosa：：SS_2202和S. spinosa：：SS_2203在該時間點的峰面積分別達21 086.3 mAU和14 390.1 mAU，為出發(fā)菌株630的3.45倍和2.35倍，表明SS_2202和SS_2203基因過表達均能促使出發(fā)菌株630多殺菌素產量的提高。

2.6 SS_2202和SS_2203基因過表達對刺糖多孢菌生長與胞外葡萄糖攝取的影響

生長曲線測定結果顯示：過表達菌株S. spinosa：：SS_2202和S. spinosa：：SS_2203從發(fā)酵開始，其生長速率就要高于出發(fā)菌株630，與出發(fā)菌株在生長對數(shù)期早期（前48 h）的變化基本同步；但從48 h開始，過表達菌株S. spinosa：：SS_2202的生長速率要明顯弱于出發(fā)菌株，出現(xiàn)了一個相對較長的對數(shù)生長期，維持約120 h，于168 h進入穩(wěn)定期，而出發(fā)菌株則在96 h就已進入穩(wěn)定期；此外，過表達菌株S. spinosa：：SS_2202的菌體最高密度要略高于出發(fā)菌株。葡萄糖消耗曲線顯示，兩株過表達工程菌與出發(fā)菌株630葡萄糖消耗趨勢基本相同，均在生長對數(shù)期快速下降直至濃度不再變化，但過表達工程菌胞外葡萄糖濃度的下降幅度明顯要強于出發(fā)菌株630，其對培養(yǎng)基中葡萄糖的攝取能力與它們的生長模式相一致。

2.7 SS_2202和SS_2203基因過表達對刺糖多孢菌菌絲體形態(tài)的影響

使用冷場掃描電鏡觀察出發(fā)菌株630、過表達菌株S. spinosa：：SS_2202和S. spinosa：：SS_2203的菌絲體形態(tài)。結果如圖7所示，三株菌株在發(fā)酵第2天的菌絲體形態(tài)均為分枝絲狀，但過表達菌株S. spinosa：：SS_2202和S. spinosa：：SS_2203的菌絲體明顯比出發(fā)菌株更為密集。在發(fā)酵第4天，兩株過表達菌株菌絲體密集程度相差不大，但過表達菌株S. spinosa：：SS_2202和S. spinosa：：SS_2203的菌絲體形態(tài)多為短桿狀和圓球狀，而出發(fā)菌株630僅觀察到短桿狀，說明SS_2202和SS_2203基因過表達在生長對數(shù)期能促進菌絲體的生長，隨著發(fā)酵的繼續(xù)進行，菌絲體形態(tài)由短桿狀繼續(xù)分裂為圓球狀。

3 討論

多殺菌素是由刺糖多孢菌產生的具有更高效殺蟲活性和更寬廣殺蟲譜的次生代謝產物。近年來，多殺菌素生物合成基因簇、生物合成途徑以及衍生物結構都已得到清晰的闡述，同時，基于合成生物學策略促進多殺菌素生物合成的研究也已取得初步進展［3］。然而，由于對影響刺糖多孢菌多殺菌素生物合成的重要功能基因了解甚少，使得無法選擇合適的靶基因對刺糖多孢菌進行定向改造來促進多殺菌素高效生物合成。

基于合成生物學“設計-構建-測試-學習”策略，通過設計最優(yōu)代謝途徑、模塊組裝適配等調控代謝通量，是構建優(yōu)良細胞工廠、促進目標天然產物高效生物合成的重要手段，其在多個模式菌株中得到了非常廣泛的應用［19］。Zhu等［20］在白色鏈霉菌中，通過優(yōu)化L-lysine合成途徑使其更多地用于ε-Poly-L-lysine合成，最終使ε-Poly-L-lysine發(fā)酵產量達到（81.4±5.2）g/L。近年來，在刺糖多孢菌合成生物學研究中面臨的最大挑戰(zhàn)是如何根據(jù)多殺菌素和底盤細胞的代謝特點合理設計合成路徑，從而構建出具有高效合成多殺菌素的人工制造體系，而調控多殺菌素生物合成的重要功能基因挖掘及其作用機制解析對于上述問題的解決顯得尤為重要。蛋白質作為基因表達的最終產物在不同生長階段或受某一特定條件影響后，其表達情況會有所差異，因此，在整體蛋白質組水平上通過蛋白質的差異表達分析細胞的特定生物學過程，可為揭示相關表型、生理生化變化機制及挖掘重要功能基因提供重要數(shù)據(jù)支撐［21］。Luo等［22］對野生型刺糖多孢菌與多殺菌素高產菌PR2進行了比較蛋白質組學研究，在共同鑒定到的140個蛋白質中，發(fā)現(xiàn)與初級代謝相關的酶如琥珀酰輔酶A合酶、丙酮酸激酶、6-磷酸果糖激酶等在高產菌PR2中存在過表達，說明其與多殺菌素生物合成存在密切聯(lián)系，為揭示多殺菌素生物合成代謝途徑提供重要線索。Yang等［23］對4個不同生長階段的野生型刺糖多孢菌進行了差異蛋白質組學研究，發(fā)現(xiàn)與初級代謝相關的蛋白在不同生長階段的變化較為明顯，揭示了初級代謝與多殺菌素生物合成之間的特定聯(lián)系，并指出5-甲基四氫蝶呤-三谷氨酸-同型半胱氨酸-甲基轉移酶、谷氨酰胺合成酶和環(huán)核苷酸結合域蛋白在促進多殺菌素生物合成中發(fā)揮重要作用。為了挖掘影響刺糖多孢菌多殺菌素生物合成的新的重要功能基因及其作用機制解析，本研究首先通過紫外誘變獲得一株誘變株CW-12，該菌株不僅多殺菌素產量是出發(fā)菌株630的5.2倍，其生長速率、最大菌體密度和對胞外葡萄糖的攝取效率也均高于出發(fā)菌株630，展示出優(yōu)良的底盤細胞特征。隨后，我們對誘變株CW-12和出發(fā)菌株630進行了蛋白質組測定，以確定它們的蛋白質譜并鑒定差異表達蛋白以及多殺菌素生物合成涉及的關鍵初級、次級代謝通路。結果顯示，與出發(fā)菌株630相比，在誘變株CW-12中有668個上調的表達蛋白（差異倍數(shù)在1.5倍及以上，Plt;0.05），包括454個注解蛋白和214個假想蛋白。標注蛋白主要包括轉錄因子、酶、ABC轉運蛋白、氧化還原酶、細胞色素P450、核糖體蛋白等。KEGG代謝途徑分析顯示，誘變株CW-12中碳代謝、脂肪酸代謝、氨基酸代謝和TCA循環(huán)等多個代謝通路被顯著激活，上述代謝途徑作為細胞的初級代謝，可為多殺菌素的生物合成提供前體、輔因子和能量，此為誘變株CW-12多殺菌素產量高于出發(fā)菌株的重要原因，與上述代謝途徑相關的功能基因就是調控多殺菌素生物合成的重要節(jié)點。

多殺菌素作為I型聚酮類化合物，主要是在生長穩(wěn)定期大量合成，其合成過程主要是以不同類型的短鏈脂酰輔酶A為合成前體，經碳鏈縮合形成聚酮骨架，再經多級修飾合成最終產物［1］。它的合成底物直接或間接來自初級代謝，如糖酵解、脂肪酸降解和氨基酸降解途徑等，但菌株初級代謝能力在發(fā)酵生長穩(wěn)定階段已下降，導致聚酮骨架的合成往往受到這些必需合成底物的可用性限制。有研究顯示，對刺糖多孢菌上述代謝途徑進行優(yōu)化可極大提高多殺菌素產量［24-26］。因此，基于組學分析挖掘參與多殺菌素生物合成的重要功能基因可為后續(xù)對刺糖多孢菌進行合成生物學改造提供重要修飾靶標。通過比較蛋白質組分析發(fā)現(xiàn)，誘變株CW-12降解脂肪酸的能力明顯強于出發(fā)菌株630，共檢查到上調蛋白14個，推測這些蛋白表達水平上調是促進出發(fā)菌株630多殺菌素生物合成的重要功能基因。隨后，本研究選擇對3-羥脂酰輔酶A脫氫酶（SS_2202）和乙酰輔酶A乙酰基轉移酶（SS_2203）進行了驗證，此也為首次利用遺傳改造技術對刺糖多孢菌基因組中的SS_2202和SS_2203基因進行過表達研究。通過高效液相色譜檢測多殺菌素產量，發(fā)現(xiàn)過表達菌株S. spinosa：：SS_2202和S. spinosa：：SS_2203多殺菌素產量分別提高了3.45倍和2.35倍，不僅如此，這兩株過表達菌株在生長速率、最大菌體密度、胞外葡萄糖攝取效率和菌絲體量均要強于出發(fā)菌株630。這證實本研究篩選出的重要功能基因SS_2202和SS_2203對刺糖多孢菌中多殺菌素生物合成和菌株生長發(fā)育起正調控作用。

綜上所述，本研究不僅通過紫外誘變獲得了一株多殺菌素合成能力增強的誘變株CW-12，還基于比較蛋白質組學分析揭示了該誘變株多殺菌素產量提高的重要原因，并篩選出多個影響多殺菌素生物合成的重要功能基因以及對SS_2202和SS_2203基因進行了作用機制研究，為后續(xù)利用合成生物學技術對多殺菌素生物合成途徑進行優(yōu)化選擇合適靶標奠定了重要基礎。

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