合成微生物與水污染治理應用

摘 要：水污染是當今世界面臨的嚴峻環境問題之一，影響人們的生活質量和經濟的可持續發展。利用微生物的降解能力以及與之相應的生物修復技術是去除環境污染物以及修復水環境的重要手段。但是，由于水污染環境的復雜現狀，傳統微生物學治理方法受到了限制。運用合成生物學“設計-構建-測試-學習”的理念，對目標微生物底盤進行從頭設計、改造，從而獲得對污染物具有高效、廣譜降解能力的合成微生物，不僅可滿足現在復雜污水環境的治理要求，還能實現綠色、高效的循環治理，是未來合成生物學的發展應用方向之一。本文簡要介紹了水污染的現狀、常用的治理技術以及當今合成微生物在水污染治理中的應用，重點介紹了合成微生物底盤的種類以及通過底盤改造構建的合成微生物在水污染治理中的優勢，以期通過合成生物學手段不斷完善和優化污染物降解和水污染治理技術，為實現水環境污染的高效治理提供參考。

關鍵詞：合成微生物；底盤細胞；水污染；生物修復技術；環境治理

中圖分類號：X52" " " " " " " " " " " " " "文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.05.004

Abstract： Water pollution is one of the most serious environment problems that affect people′s life quality and sustainable economic development worldwide. The degradation capability of microorganisms endows them advantages in environmental pollutants elimination and water environments repairment， with the utilization of diverse bioremediation technologies. However， due to the complex situation of water pollution environment， traditional microbiological treatment methodology is restricted and limited. With the engineering principle Design-Build-Test-Learn in synthetic biology， the designed and modified synthetic microorganisms with efficient and broad-spectrum degradation ability for pollutants has attracted the researchers′ attention. The synthetic microorganisms could not only meet the wastewater treatment requirements within complex pollutants， but also could achieve the green， efficient circular treatment goal. Therefore， design and construction of synthetic microorganisms for water pollution control has becoming one of the future development and application direction of synthetic biology. Herein， we introduced the current situation of water pollution， the treatment technologies classically utilized， and the synthetic microorganisms′ application in water pollution control. This review focuses on different types of microbial chassis in synthetic biology and the merits of application of synthetic microorganisms in water pollution control. This review will facilitate the performance optimization of pollutant degradation and wastewater treatment via synthetic biology and provide reference for the efficient treatment of wastewater environment.

Key words： synthetic microorganisms; microbial chassis; water pollution; bioremediation technology; environmental governance

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（5）： 418-431）

水是生命的起源，是生命賴以生存的根本，是經濟生產不可替代的基礎，是維護生態環境的要素。但隨著科技的發展，大量環境污染物被排放，水環境急速惡化，缺水已經成為人類日常生活面臨的主要問題之一［1］。據推斷，到2050年，全球一半人口將面臨嚴重的水資源短缺［1］。當前，我國生態文明建設以降碳為重點戰略方向，污水治理既是污染防治的重要組成，也是溫室氣體減排的重要領域。推進減污降碳協同增效已成為我國新發展階段經濟社會發展全面綠色轉型的必然選擇。所以，為了地球生態健康，也為了實現經濟的可循環發展，對水污染的治理刻不容緩。

針對不同的水污染情況，可應用物理法、化學法和生物法等治理方法，其中基于微生物降解轉化能力進行的生物法在實際治理中發揮著關鍵作用，但是由于單一微生物降解易受多重環境因素影響等限制，其作用范圍和應用場景極其有限。隨著合成生物學作為“第三次生物科學革命”的發展，有目的地設計、改造甚至重新合成構建生物體成為可能，從而加速了特定污染物從無法降解到能夠降解、從低效降解到高效降解的轉變［2］，為污水的高效治理帶來了新方向。

采用合成生物學使能技術，以工程化設計為理念，對底盤微生物進行定向設計、改造、從頭合成和構建，最終構建可感知、報告并降解特定污染物的合成微生物，是實現高效、綠色、經濟、智能化治理污水目標的未來方向。本文簡述了水污染的不同來源、現有的不同治理方案，并介紹了可用于水污染治理的代表性合成微生物底盤種類及對其底盤的改造構建方法，最后對合成微生物在水污染治理中的優勢進行了評述。

1 水污染的現狀

水是我們日常生活中最重要的一類資源。地球上大約71%的面積被水覆蓋，其中97.5%是海水，只有2.5%的淡水可供人類直接使用［3］。隨著全球經濟和人口的快速增長，工業化、城市化步伐加快，多種有害污染物進入環境中，由于環境污染物的排放和水環境的惡化，水污染已成為全球面臨并且日益嚴峻的挑戰［4］。污水中的大量重金屬和有機污染物，不僅嚴重威脅環境和生態平衡，而且危害了人類健康，對經濟增長和社會發展產生了顯著的負面影響［4-5］。目前水污染的主要來源有工業污染、農業污染、醫療污染以及生活污染等（圖1）。

1.1 工業污水

隨著全球工業化和城市化速度的加快，工業部門用水增加，其用水量約占全球的22%，污水排放量約占全球污水排放總量的28%［6-7］。常見的工業水污染物包括汞（Hg）、鎘（Cd）、砷（As）等有毒重金屬，石油以及氯化物等，根據化學性質可分為無機污染物和有機污染物［5-6］。在眾多的工業機構中，來自造紙業、煤炭制造業、石油化工業、紡織業和制藥業的廢水基本上是劇毒的，已被證實對周圍環境存在最高程度的危害性［8］。

1.2 農業污水

全球人口正在以驚人的速度增長，預計到2050年，全球糧食產量需要增加50%［9］。為了滿足全球的糧食需要，在農作物種植階段，大量農藥被采用以提高農作物的產量和質量。基于不同的作用目的，農藥可分為除草劑、殺蟲劑、滅鼠劑、殺菌劑等，主要成分有硫磺、有毒重金屬、生物堿和有機磷等［9-10］。雖然是為了滿足糧食需要，但是過度使用農藥會破壞生態系統、損害水質并造成人體損傷［11］。農藥可通過與土壤吸附結合，破壞土壤團粒結構，并從中滲入地下水，造成地下水與地表水的污染。4，4′-二氯二苯基二氯乙烷、毒死蜱（chlorpyrifos，CP）和二嗪農等一些可溶性、揮發性農藥常在空氣中富集，在降雨時，會重新匯集并隨著地表水滲透到土壤、地下水之中，從而加劇水污染的嚴重程度［11-12］。

1.3 醫療廢水

醫療廢水主要來源于醫院，其成分十分復雜，包含各種病原微生物、抗生素、有毒有機化合物、放射性元素和離子污染物等［13］。根據科室不同，醫療系統產生的污水成分也不盡相同。如放射科污水中存在造影劑，手術室排出的污水含大量麻醉類藥物［14-16］。總體來說，醫療廢水具有成分復雜、難降解甚至傳染性等特點。值得強調的是，當今大多數醫療廢水往往沒有經過特殊處理就與生活污水一起排入了污水處理廠［17-18］，這就使許多藥物和微生物在不發生結構和毒性明顯變化的情況下，通過污水處理廠并進入了地表水［13］，從而進一步導致了抗生素耐藥細菌的產生和傳播［18］。

1.4 生活污水

生活污水由70%的有機物和30%的無機物組成，通常分為兩大類，即黑水和灰水［19-20］。黑水是廁所排放的富含有機物、氮和磷的污水，主要有糞便、尿液和食物殘渣等；灰水是用于洗滌或洗澡的廢水，包括來自廚房水槽、淋浴間和洗衣機的廢水［19， 21-22］，主要含有酸堿性化合物、脂肪、重金屬、硝酸鹽和異生化合物等［22］。生活中，灰水產量可達黑水產量的1～7倍［19-20］。鑒于當今許多污水處理廠的處理能力欠缺，大量生活廢水流入地下水和地表水中，導致水質惡化，影響水生生物的生存。

2 現有水污染治理技術

目前用于治理水污染的方法主要可分為物理方法、化學方法、生物學方法（圖1），可根據污染物濃度、污水組成、工藝成本或污水中存在的額外雜質，選擇合適的治理方法［23］。

2.1 物理法

物理法是指借助物理作用來處理、回收水體中的污染物質，通常需要在不影響污染物生化特性的情況下進行。常用的方法包括吸附、過濾和溶氣浮選。其中吸附法因其靈活性、廣泛的適用性、成本效益高和實用性，成為污水治理中最有利的方法［24］。常見的吸附劑有生物吸附劑、二氧化硅、氧化鋁、活性炭、黏土、金屬氧化物、二氧化鈦等［23］。由于吸附劑飽合能力有限、難以再生，且某些污染物難以通過吸附被去除［4］，限制了吸附法的實際應用。但是，已有研究通過合成新型納米復合吸附劑，成功去除污水中的苯并吡啶、氧氟沙星等污染物［25-26］。

2.2 化學法

化學法是指在進行污水治理時，借助化學反應來治理留存于水體中污染物質的方法。化學處理方法主要有氧化還原法、化學沉淀法、混凝和離子交換等，通常用來處理一些無機物質和部分難以降解的有機污染物。生活中常常通過化學法，如臭氧和氯、次氯酸鈉等來初步消除醫院污水中的細菌和病毒［13，27］。采用氧化還原原理的高級氧化工藝（advanced oxidation process，AOP）是去除頑固有機污染物并滅活傳統技術無法處理的病原微生物的一種極具潛力的技術，其作用方式有氫提取、自由基的組合或加成以及電子轉移［28-29］。已有研究通過電化學氧化-硫酸鹽AOP成功降解了化工企業高濃度含氰有機廢水中的有機物和氰化物［30］。

2.3 生物法

生物法是利用微生物的代謝能力對污水中的有機物質進行分解的方法。由于成本效益高和環境相容性好，生物修復具有極好的未來發展潛力［3，31］。生物法通過使用細菌、真菌、微藻、酵母和其他微生物菌群進行，由于體積小、比表面積大，它們已成為當今理想的生物修復制劑［32］。生物法可通過吸附或積累來降解污水中的各種污染物［28］。目前，已有研究使用微生物單一培養法對污水中的染料進行降解和脫色［33］，以及采用高效藻類塘去除污水中的抗高血壓藥、抗抑郁藥和消炎藥等［34］。

以上污水治理方法各有千秋，現有的許多廢水處理研究采用組合生物、化學和/或物理處理的技術來應對傳統單一處理技術的局限性［5］。物理和化學方法治理的缺點是價格昂貴、效率低、易產生副產物，如污泥和次級代謝物等［3，35］。在某些情況下，吸附、化學沉淀或電化學沉淀等方法不能從廢水中去除染料或其代謝物等化合物，只能將污染物從一相轉移到另一相，并未從根本上解決污染問題［35］。與物理和化學方法相比，生物處理方法雖具有環境友好、高效且可行性高等優勢［5］，但易受溫度和pH值等環境因素的影響，導致污染物處理速度變慢［4，32］。組合處理方法在實施時也存在多個限制，諸如缺乏技術知識和數據的可行性，處理材料的效率隨著時間的推移而降低等［5］，且大多數研究都是使用模擬或稀釋的廢水進行的，并不能代表實際污水的發生情況［35］，所以在水污染治理中，應該結合實際情況具體分析。

3 合成微生物在水污染治理中的應用

合成生物學是一門集合了生物化學、分子生物學和計算機等多學科的新興學科，通過分子生物學工具，對生物體的遺傳信息重新編輯使其具有特定的功能［2，36］。近年來，隨著合成生物學的發展，現有技術已可將復雜的外源性代謝途徑引入特定的微生物宿主，并進行特定的人為改造，以實現特定的目標。合成生物學方法在一定程度上解決了微生物中只含有單一化合物的分解代謝基因這一缺陷，并使微生物可以監測、聚集和降解環境污染物［2，37］，從而使合成生物學在水污染治理中受到廣泛應用。

采用合成生物學“設計-構建-測試-學習”的理念，對生物元件挖掘、分析，設計構建而成的具有特定功能的微生物，稱為合成微生物（圖2）。底盤作為引入具有不同代謝途徑元件的宿主，其開發和構建是合成生物學領域的一個關鍵，也是構建合成微生物的基礎［38］。底盤細胞的普遍含義是改善了細菌、古細菌或植物細胞中遺傳信息的宿主，也是將合成的功能化元件、線路和途徑等體系置入其中以達到設計目標的重要合成生物學反應平臺［39］。

在合成生物學中，底盤為運行合成系統提供能量，被認為是合成生物學的“硬件”，而生物部件和生物設備則被認為是“軟件”在底盤中“加載并運行”。合成生物學被認為是實現在“硬件”底盤中“即插即用”的模塊化“軟件”的生物學［40］（圖2）。

在對一個底盤操作前，應了解其基因組序列，并具有先進的遺傳工具可對其進行深度編輯。這些遺傳工具包括表達載體、啟動子和先進的基因組編輯技術。同時一個合格的底盤應具有遺傳和進化穩定性、在目的環境中的可用性等特征［39］。目前應用在水污染治理中的底盤細胞主要有大腸桿菌、惡臭假單胞菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母等模式微生物，以及鹽單胞菌（Halomonas spp.）、拜氏不動桿菌和需鈉弧菌等非模式微生物［38，41］（圖3）（表1）。

3.1 基于大腸桿菌

大腸桿菌（Escherichia coli）是一種革蘭氏陰性桿狀細菌，被歸類為腸桿菌科，該菌主要寄生在哺乳動物腸道中，可通過糞便和廢水在環境中傳播，造成污染［42］。由于大腸桿菌具有生長快速、培養基簡單和經濟效應高等優勢，在合成生物學中常作為模式微生物底盤被研究和使用［38， 40］。

鑒于已有多個基因編輯技術可在大腸桿菌中高效實施，如鋅指核酸酶技術（zinc finger nuclease，ZFN）、轉錄激活因子樣效應因子核酸酶技術（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）、同源重組和成簇的規則間隔短回文重復序列系統［clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR）/CRISPR-associated （Cas） protein，CRISPR-Cas］等［43］，目前大量研究以大腸桿菌為底盤進行蛋白質和代謝物的生物合成，如血紅素蛋白和5-氨基乙酰丙酸的合成等［44-46］。CRISPR-Cas系統是一種天然免疫系統，廣泛分布于細菌和古細菌中［47-48］。與傳統的低通量ZFN和TALEN相比，CRISPR是一種可編程的下一代高通量基因編輯技術，可以直接將一組首選指令傳輸到微生物的基因組中，大量水污染相關研究采用該體系構建合成微生物。Li等［47］基于CRISPR-Cas9構建的pEcCas/pEcgRNA系統可以實現E. coli BL21（DE3）的高效基因組編輯，并將此系統用于更廣泛的大腸桿菌和其他腸桿菌科物種中。Zhu等［49］基于CRISPR-Cas12a系統實現了精確的DNA靶向和切割功能，成功建立了RAA-CRISPR-Cas12a檢測系統，實現了對食源性和水源性大腸桿菌病原體E. coli O157：H7的快速、特異和高靈敏檢測。

在污染物降解方面，Wang等［50］通過對從苯酚降解細菌紅球菌（Rhodococcus）和惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）中提取的pheA1、catA和pcaI等基因，進行一系列優化（密碼子優化、GC含量平衡、去除不必要的切割位點等）和整合操作，使其在E. coli BL221-AI內表達，構建的重組菌株能迅速降解廢水中的苯酚。對來源于紅球菌的tfdA、pcaJ和pcaF等9個2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）降解基因，進行上述類似的優化整合操作，Wang等［51］構建的重組E. coli BL-3164可以實現以2，4-D為唯一碳源的生長，降低環境中2，4-D含量的有效目標。

3.2 基于惡臭假單胞菌

惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）是一種革蘭氏陰性桿狀細菌，屬假單胞菌屬（Pseudomonas），作為模式底盤在工業和環境生物技術中都得到了廣泛應用［52-54］。惡臭假單胞菌具有強大的氧化還原代謝能力，對許多不同類型的物理化學損傷具有耐受性，能在惡劣的環境中生長且具有異種生物降解的能力，且能從受污染的地區被分離與培養［53， 55］，這激發了研究人員對惡臭假單胞菌作為底盤降解污染物的研究興趣。

目前已經有大量分子工具可用于惡臭假單胞菌遺傳操作和代謝編程［53，55］，如反選擇標記（counterselectable marker，CSM）、異源重組酶和自殺載體，這些分子工具已被驗證可促進該屬細菌的等位基因交換［54］。Aparicio等［56］將ssDNA重組與CRISPR-Cas9聯合應用在惡臭假單胞菌中，開發了一種高效、快速的基因編輯方案。Liang等［57］構建并優化了惡臭假單胞菌中的T7樣表達系統，提供了一套適用的底盤和相應的質粒提高重組表達水平，可用于表達其他底盤中難以表達的蛋白質。此外，各種組成型啟動子，多種天然及合成的誘導啟動子也已經在惡臭假單胞菌中被發現［53］。

在污染物降解方面，采用基于upp基因作為CSM的基因組編輯方法，Gong等［58］將多個降解基因整合到P. putida KT2440染色體中，構建的合成菌株具有降解農藥甲基對硫磷（methyl parathion，MP）和γ-六氯環己烷（γ-hexachlorocyclohexane，γ-HCH）的能力。Liang等［59］通過自殺質粒pK18mobsacB構建刪除了GIs的P. putida KT2440，所產生的突變體KTU-U13不僅表現出較高的質粒轉化效率和異源蛋白表達能力，且作為受體細胞時，對γ-HCH和1，2，3-三氯丙烷（1，2，3-trichloropropane，TCP）的降解效率也顯著增強。

3.3 基于枯草芽孢桿菌

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是革蘭氏陽性芽孢桿菌，其外源蛋白具有分泌能力強、遺傳可操作性強和易培養等優勢，已被廣泛用作底盤生產生物聚合物、工業酶制劑等［52， 60-61］。同時，枯草牙孢桿菌主要分布于土壤及腐敗的有機物中，具備作為合成微生物底盤應用于污染物治理的潛在應用價值。

常應用于枯草牙孢桿菌的基因編輯手段有CSM，位點特異性重組系統、CRISPR-Cas9及其衍生的CRISPRi和CRISPR-Cpf1系統［62］。CRISPR-Cas9可用于枯草牙孢桿菌的基因突變、缺失和插入等，是枯草牙孢桿菌基因遺傳操作中最強大的工具之一。近期，Ferrando等［60］基于CRISPR-Cas9的新型基因組編輯開發了一種簡單、快速、方便的方法，可在枯草牙孢桿菌中同時插入三個基因，這為枯草牙孢桿菌作為微生物底盤的未來發展提供了良好的前景。Zhu等［63］通過敲除枯草牙孢桿菌突變株ZN0871v11中的yqfY和spo0A基因，所獲得的菌株GEBS可同時吸附廢水中的有機物、陽離子和陰離子，并在幾分鐘內實現共沉淀，從而達到凈化水質、廢水回收的目標。Ghataora等［61］通過整合源自革蘭氏陰性菌的可變金屬結合域與在枯草牙孢桿菌中起作用的DNA結合結構域，并輔以結構引導設計，在枯草牙孢桿菌中生成了具有金屬敏感性的生物傳感器模塊。

此外，枯草牙孢桿菌的另一特性是能形成復雜而強大的生物膜［62， 64］。生物膜是一種由緊密結合的細菌組成的結構群落，被自身產生的細胞外基質包裹，這種基質允許細菌附著在表面，使生物膜可抵抗氧化應激等環境條件，因此生物膜可應用于生物修復技術［65-66］。合成生物學的進步使人們能夠對生物膜進行重新編程，以改善其功能或提高增值產品的產量［65］。利用含有枯草牙孢桿菌的生物膜或多物種生物膜組合的生物反應器，可以實現廢水和周圍環境中有毒污染物降解的目標。Li等［67］將有機腈降解過程中發揮關鍵作用的腈水合酶和酰胺酶的編碼基因nha、ami整合至B. subtilis N4中，構建了B. subtilis N4/pHTnha-ami，可實現廢水中有機腈的降解，同時，聯合使用帶正電荷的改性聚乙烯載體移動床生物膜反應器，促進了細菌的黏附和生物膜的形成。Zhu等［68］通過整合型質粒pDG1730構建了能傳感和吸附重金屬離子的基因回路，并轉至B. subtilis 1935ΔepsΔbslA底盤中，所形成的菌株不僅能實時感應三種金屬離子［Pb（II）、Hg（II）和Cu（II）］且形成的生物膜能實現對這些金屬離子的特異性吸附。

3.4 基于釀酒酵母

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一種真核模式生物，具有遺傳背景明確、生長迅速、操作簡單等優點［69-70］。釀酒酵母與原核模式微生物相比有許多獨特的優勢，如可增加特異性酶的表達和翻譯后修飾能力，為特異性酶的表達提供優越的環境，以及具有細胞器，可以分隔產物的合成，減輕產物積累導致的細胞代謝負擔等［52］。因此，釀酒酵母成為了用于生產燃料、食品添加劑和生物制藥方面的優質底盤候選物［70-71］。此外，基于酵母細胞對pH值和溫度變化的高適應性，釀酒酵母也成為有毒污染物生物傳感器應用中的合適底盤［72］。

但是，釀酒酵母和非生產性程序的內源性因素常常損害外源基因的表達和插入，因此，目前開發了多種技術用來增強和提高其細胞內基因轉錄的強度和效率并促進基因編輯的程序［69］。其中CRISPR-Cas9系統已成功應用于多種酵母細胞的基因編輯中，如刪除細胞特定代謝過程中的相關基因，以及在一步反應中同時進行多基因敲除、下調和過表達等［73］。釀酒酵母中單一向導RNA（sgRNA）的最廣泛利用提高了CRISPR-Cas9系統基因編輯的效率［69］。Fan等［74］通過優化半乳糖誘導系統的關鍵元件Gal4和Gal80，并利用CRISPR-Cas9介導的基因組編輯技術將其分別連接至銅誘導啟動子CUP1和銅抑制啟動子CTR1中，合成的酵母細胞可用于高效檢測環境中的Cu（II）。

在污染物降解方面，通過把細菌lacZ報告基因與含酵母JLP1啟動子的質粒相連，Ito-Harashima等［75］構建了一個攜帶高拷貝數pESC-JLP1-lacZ報告質粒的菌株，并將其用于高效、快速監測水和土壤中的Cd污染。Ruta等［76］將多種植物金屬硫蛋白分別靶向酵母質膜的內表面，改造后的釀酒酵母可在低濃度下吸附Cu（II），且表達myrGFP-NcMT3的菌株可在高濃度Cu（II）、Ni（II）和Mn（II）等金屬離子條件下表現出強勁的生長力、金屬耐受性和高累積能力。Mashangoane等［77］將鈀結合肽（4R-PdBP）連接至pYD5質粒上，形成重組質粒pYD5/4R-PdBP并轉化至S. cerevisiae EBY100中，構建的重組菌株可從水溶液中生物吸附鈀［Pd（II）］。

3.5 基于非模式底盤

模式底盤微生物研究時間長，研究人員多，遺傳工具豐富，目前已經得到了大量的研究和應用，在微生物遺傳與合成生物學的基礎理論研究以及應用中發揮著舉足輕重的作用。但在實際應用中，模式底盤受環境影響較大，往往不能達到預期效果，這時，具備底盤所需特性的一些非模式底盤微生物吸引了研究學者的目光。在水污染治理中，能用于降解污染物的非模式底盤有鹽單胞菌、不動桿菌和需鈉弧菌等。

3.5.1 鹽單胞菌

鹽單胞菌是革蘭氏陰性需氧細菌，屬于嗜鹽菌家族，常見于鹽湖、沼澤及海洋等高鹽環境中。該菌不僅能夠耐受含3%～15% NaCl的高鹽環境，而且能在50℃的高溫以及pH為10的高堿性環境下存活［2， 78］。高鹽環境也更有利于鹽單胞菌降解合成染料廢水中的污染物［79］。由于其培養簡單、生長快速和污染抵抗性高等優勢，目前鹽單胞菌已被用作底盤生產聚羥基烷酸、某些蛋白質以及小分子有機化合物等［78， 80］。

隨著對鹽單胞菌研究興趣的增加，多株鹽單胞菌的全基因信息已被揭示，如Halomonas spp. MS1、Halomonas 11-S5、Halomonas 25-S5、Halomonas spp. SpR1和SpR8等［81-83］。鹽單胞菌株基因組測序的完成和注釋信息完善促進了學者對鹽單胞菌內源基因功能挖掘、代謝通路鑒定、代謝網絡構建等方面的研究，為構建鹽單胞菌底盤提供了理論支持［78］。目前，針對鹽單胞菌還開發了一系列工具和元件，如pSEVA系列質粒、pUCpHAw和pHA1AT_32等穿梭載體、多種組成型和誘導型啟動子、不依賴于Rho的固有終止子以及一種新型的類T7表達系統等，奠定了開展鹽單胞菌使能技術的基礎［78， 84-86］。另外，上述在模式底盤中建立的大部分基因編輯技術，包括同源重組、CRISPR-Cas9和CRISPRi等，在鹽單胞菌中也同樣適用［85］。最近，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術與非同源末端連接修復系統相結合，Liu等［80］開發了一種快速、高效刪除鹽單胞菌中大片段DNA的方法。以上元件和技術為鹽單胞菌應用于合成生物學底盤構建奠定了基礎。

在污染物降解方面，Ji等［87］通過在高拷貝質粒pSEVA241-sgRNA上組裝phaCAB基因表達模塊，構建的合成菌株H. bluephagenesis WZY278可以降解食物垃圾水解物并生產聚3-羥基丁酸酯（poly-3-hydroxybutyrate，PHB）。Kleinsteuber等［88］將攜帶有2，4-D、2-甲基-4-氯苯氧乙酸（2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid，MCPA）和3-氯苯甲酸（3-chlorobenzoic acid）降解基因的pJP4質粒在Halomonas sp. EF43中表達，菌株可實現在堿性條件對2，4-D和3-氯苯甲酸酯的降解。

3.5.2 拜氏不動桿菌

拜氏不動桿菌（Acinetobacter baylyi）是一種革蘭氏陰性需氧細菌，由于其具有高自然轉化率以及高重組效率，被認為是下一代合成生物學的理想底盤［89-90］。A. baylyi ADP1的無害性、代謝多樣性和高適應能力，使其已被用于各種生物技術中，如降解有機污染物、生產各種生化產品和不同種類的生物聚合物［89， 91］。

隨著合成生物學的發展，非模式底盤研究的深入，A. baylyi ADP1常被用于研究細菌遺傳和代謝機制［92］。可利用無痕同源重組技術和CRISPR-Cas9系統在A. baylyi ADP1中進行基因的插入與刪除。同時基于已建立的CRISPR-Cas9系統，Suárez等［92］開發了一個“CRISPR-Lock”技術，用以促進簡單的多組分DNA組裝和快速可靠的基因組編輯。目前，一系列調控生物元件已在A. baylyi ADP1中得到成功應用。近期，Biggs等［90］構建了一個全面的A. baylyi ADP1基因工具集，包括合成的組成啟動子和核糖體結合位點文庫。唐慧等［93］通過在pWH1274質粒上插入發光基因片段luxCDABE，將重組質粒轉化至A. baylyi ADP1中，合成的菌株可用于對Be（II）、Ba（II）、Cu（II）、Ni（II）等急性毒物的檢測。Huang等［94］將luxCDABE插入pGEM-T質粒中，重組的ADPWH_lux可作為生物傳感器對水楊酸鹽進行快速和特異性的檢測。

3.5.3 需鈉弧菌

需鈉弧菌（Vibrio natriegens）為桿狀海洋細菌，pH耐受范圍為5.5～9.5，具有無致病性、生長迅速、遺傳可操作性強、可接收環境DNA和利用多種碳源生長的能力，被認為是合成生物學未來最有潛力的底盤［85， 95］。弧菌在質粒轉化和蛋白異源表達方面表現良好，電穿孔、熱休克轉化和結合等方法均可成功地將質粒DNA轉入其中，包括p15A、pMB1和pUC及其衍生質粒等［2， 96-97］。最近，多項研究表明，在大腸桿菌中適用的生物元件和基因編輯技術也適用于弧菌，如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、同源重組和CRISPR-Cas9系統等［95， 97-98］。基于弧菌從環境中吸收DNA的能力，一種自然轉化多重基因組編輯（multiplex genome editing by natural transformation，MuGENT）技術已經被開發，Dalia等［99］成功地將MuGENT應用于弧菌中，即可一步同時將多個基因無痕共編輯至基因組中。在此基礎上，Stukenberg等［100］將其與CRISPR-Cas9反選擇相結合開發了一種高效基因組編輯技術NT-CRISPR，幾乎可在100%的效率下進行多數基因組修飾，如敲除、整合和點突變。

在污染物降解方面，Huang等［101］利用V. natriegens Vmax在鹽脅迫環境下降解環境污染物，分析并鑒定了其耐鹽機制和相關的鹽誘導啟動子，并在V. natriegens Vmax菌株上構建了對CP、六溴環十二烷（hexabromocyclododecane，HBCD）和聚對苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）三種鹽的誘導降解模型，實現了對相應底物的有效降解，最終將該菌株與甲殼素材料結合，實現了菌株的回收利用。

除了上述提到的重要模式細胞以及具有特殊性狀的非模式細胞外，還有許多細菌可被開發用于水污染治理，如用于廢水硝酸鹽檢測的藍藻內生物傳感器［102］，體內含有降解染料廢水中污染物酸性蘭113關鍵酶編碼基因的鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）等［103］。對于底盤細胞及降解相關元件的進一步挖掘與開發有助于深化研究人員設計與構建合成微生物的進程，并推動合成微生物在水污染治理中的應用。

4 合成微生物在水污染治理應用的優勢

4.1 高效降解力與廣泛降解譜

污水不僅來源多樣，而且其中污染物數量多而復雜。傳統的物理、化學方法通常只能對特定的污染物發揮作用，不僅作用時間長，而且易受到環境因素的影響，從而導致治理效果不盡如人意。生物修復雖然較物理化學方法更高效，但直接將具有較高降解力或代謝力的微生物投入污水中很可能被環境中原有生物侵蝕，從而限制了其污水治理的效率。

合成生物學可根據特定目標污染物，系統地研究微生物降解污染物過程的本質、規律和互作網絡等，深度挖掘各類污染物的相關降解元件，針對性地構建高效穩定的合成微生物［104］。例如，Zhao等［105］將γ-HCH和TCP的生物降解途徑整合到P. putida KT2440中，構建的合成菌株可完全降解γ-HCH和TCP。Zhang等［106］對來源于伯克霍爾德氏菌（Burkholderia sp.）的2，4-二硝基甲苯（2，4-dinitrotoluene，2，4-DNT）降解途徑的DntAa、DntAb和DntAc等8個基因進行合成、優化，并在E. coli上組裝，所構建的E. coli BL-4174能夠完全降解2，4-DNT。

因此，合成生物學不僅可以針對某一特定污染物對底盤細胞進行設計和改造，還可根據治理目標選擇性地開發和利用多重降解相關元件，如轉運元件、趨化元件和抗逆元件等，通過對不同微生物來源的元件進行設計和組合，構建具備復合代謝網絡的合成微生物，從而提升對污染物的降解能力、環境適應能力以及拓展其污染物降解譜。Gong等［107］通過合成生物學的方法將4個農藥降解基因mpd、pytH、mcd和cehA整合至P. putida KT2440上，所得菌株可實現對有機磷、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯3種農藥的同時降解。

4.2 環境友好和可持續

傳統的污水治理方法可能會破壞水中的生態系統、生物群落和生態鏈等。以合成生物學技術為基礎的合成微生物可針對污染物降解及其在環境應用中的適應性和安全性技術開展工作。通過探究微生物與微生物之間、微生物與環境之間的相互作用機制，與生態學、計算生物學等學科結合，設計構建高效智能的人工微生物降解體系，協調多重元件在代謝水平上的相互作用。這不僅可增強合成菌株的環境適應性，使其能夠在高鹽、酸堿、高滲等極端條件下保持降解活性［108］，并且有利于實現復雜污染條件下的環境修復。合成微生物可通過多重降解元件，建立能響應污染物的條件自毀基因線路和遺傳物質清除線路，使其能在自然條件下持續主動安全的降解污染物，不產生二次污染，具有可持續凈化水環境并修復生態的特性。例如，Liu等［109］將感應模塊、降解模塊、自殺系統整合至E. coli TOP10中并進行優化，所獲得的菌株Pfic-TAT（2）-P100-RBS35在無外源誘導劑的情況下，可對水楊酸（salicylicacid，SA）進行傳感并降解，最后當環境中無SA時菌株會自主激活自殺系統，且能長期穩定存在于水環境中發揮功能。

4.3 作用形式多樣化

合成生物學的發展為合成微生物的多樣化應用提供了新的契機（圖3）。為避免單一菌株的過度工程化及增加其代謝負擔，研究者們通過構建合成微生物群落的方式，讓菌群成員間通過信號交換、檢測及相互響應等方式進行交流，并通過相關基因表達調控協調群體行為。合成微生物群落不僅比傳統菌群及單一微生物具有更多的復雜功能，而且具有更高的穩定性與魯棒性，可適用于復雜環境和極端環境的生長及維持平穩的代謝狀態［104］，因此在水環境修復中發揮著不可替代的作用。Zhang等［110］構建了一個由鞘氨醇單胞菌屬和假單胞菌屬微生物組成的合成微生物群落，該群落可有效地利用菲或二苯并噻吩作為唯一的碳源生長，同時還可代謝其他多種多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）和雜環衍生物。在模擬廢水試驗中，該合成群落5 d內去除了100%的PAHs，且在多次循環后依舊保持穩定的降解力。Zhang等［111］構建了一個由類節桿菌屬、根瘤菌屬、紅球菌屬、代爾夫特菌屬和硝酸鹽還原菌屬微生物組成的耐鹽微生物群落，該合成群落對模擬乙酰乙酰苯胺（acetoacetanilide，AAA）廢水和實際AAA母液有良好的降解能力，且處理后AAA母液的綜合毒性顯著降低。

除了降解污染物外，合成微生物在污染物檢測方面也起著舉足輕重的作用。運用合成生物學的模塊化和可編程性，將待測物質的感應元件（轉錄因子和核糖開關等）與信號輸出的報告元件（熒光素酶、熒光蛋白和熒光適配體等）通過基因表達調控的方式在微生物底盤上偶聯［112］，即可形成簡單的生物傳感器，識別單一目標物質并改善信號識別、處理和輸出等傳感過程。Hui等［113］利用Cd（II）感應元件與靛藍生物合成基因簇融合在E. coli中成功構建了一個視覺生物傳感器。該傳感器僅對Cd（II）有選擇性響應，且適用于水環境的分析。將底盤與其他功能元件或由幾個相關功能元件組成的完成某一任務的功能模塊連接，還可構建復雜的生物傳感器，用于環境中存在多種污染物時的檢測。Hui等［114］通過將兩種熒光報告元件分別置于Hg（II）傳感元件或Cd（II）感應元件的控制下，并將兩種感應元件從不同方向整合至E. coli TOP10中，成功構建了一個雙傳感生物傳感器。由于生物傳感器對環境的抗干擾能力通常較強，且傳感器細胞內部所有基因元件可以通過基因復制和細胞增殖而自動擴增，因此，生物傳感器在生產和環境監測應用中都具有明顯優勢。

5 總結與展望

隨著人類社會的發展，以及工業、生活、農業、醫療活動的進行，各種污染物如重金屬、有毒有機化合物和致病微生物等進入水環境，造成了本就脆弱的生態系統的進一步惡化。盡管人們對污水治理的關注日益增加，但現階段的污水實際治理仍然缺乏科學性和全面性，很難根據污水的具體情況制定科學的治理方案，且沒有完善的污水排放管理體系，在一定程度上加大了水污染治理工作的難度。

合成生物學將工程、科學和技術結合應用于編輯生物體的遺傳信息，使其能夠執行新的功能。應用合成生物學開發新興污染物降解菌株，已成為合成生物學和微生物學領域的研究前沿。不同于以從環境中篩選能夠代謝特定污染物的天然微生物為重點的傳統環境生物技術，合成微生物是通過在底盤細胞中插入天然或非天然功能元件、構建底盤中原本不存在的合成代謝途徑，形成全新的可感知、降解污染物的微生物。研究者們可根據目的定向改造微生物，使其具有降解目標污染物、提高降解效率和增強環境適應性等能力。近年來，國內外研究人員開展了各種有關合成微生物的鑒定、篩選、關鍵元件挖掘和改造等方面的工作，目前已獲得眾多重要突破，如開發了由多種微生物參與的污染物傳感器，構建了合成微生物降解群落以及復合材料等［115-117］。因此，合成微生物在環境修復領域中的地位愈發重要。

但目前合成微生物的具體實施仍存在一些挑戰。例如：1）污水情況復雜、難以估計，多種污染物分解代謝途徑和關鍵降解酶編碼基因不清晰；

2）微生物具有物種和基因多樣性、生態網絡復雜性，使其難以標準化，無法確保搭建的功能元件和模塊在不同系統中可擁有同樣高效的工作方式和結果；3）在特定底盤中加載和運行的合成DNA數量有明顯限制，添加合成生物元件無疑會給底盤帶來非自然的額外負擔，產生生長速度減慢、基因變異等副作用；4）目前，合成微生物的構建及應用研究多處于實驗室研究階段，多采用模擬污水進行，要想運用合成微生物在實際污水環境中，需要進行更多的現場試驗以確保生物安全和效率。盡管合成微生物在污水治理應用方面面臨著諸多挑戰，但是，隨著合成生物學、系統生物學和基因工程等學科的發展，學者們相信，在可預見的未來，在更多理論和實踐的支持下，合成微生物具有治理水污染、解決環境問題的巨大潛力。

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