細菌中L-甲硫氨酸生物合成和調控機制

摘 要：L-甲硫氨酸是一種必需氨基酸，在食品、飼料、化妝品和藥品中具有廣泛的應用。目前，L-甲硫氨酸是唯一無法用微生物發酵法工業化生產的必需氨基酸，近年來，利用代謝工程提升L-甲硫氨酸產量受到國內外研究人員的普遍重視。本文主要分析了細菌中L-甲硫氨酸的生物合成途徑及調控機制，著重分析了從高絲氨酸生物合成甲硫氨酸的三個關鍵步驟（即酰化、硫化和甲基化），并進一步對L-甲硫氨酸的生物合成提出展望，以期為L-甲硫氨酸的工業化生產提供指導。

關鍵詞：L-甲硫氨酸；生物合成；調控機制

中圖分類號：Q81" " " " " " " " " " " " " " " "文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.05.003

Abstract： L-methionine is an essential amino acid with a wide range of applications in food， feed， cosmetics and pharmaceuticals. Currently， L-methionine is the only essential amino acid that cannot be industrially produced by microbial fermentation. In recent years， the use of metabolic engineering to enhance the yield of L-methionine has received widespread attention from researchers at home and abroad. In this paper， the biosynthetic pathway and regulatory mechanism of L-methionine in Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli are analysed; three key steps （i.e.， acylation， sulfurylation， and methylation） in the biosynthesis of methionine from hyper-serine are highlighted， and a further outlook on the biosynthesis of L-methionine is proposed with a view to providing guidance for the industrial production of L-methionine.

Key words： L-methionine; biosynthesis; regulatory mechanism

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（5）： 408-417）

甲硫氨酸又稱蛋氨酸（methionine，Met），包括L-Met和D-Met兩種構型，L-Met是生命體必需的含硫氨基酸，也是唯一含有硫醚（即 C—S—C 鍵）的氨基酸。L-Met是真核生物和原核生物大部分蛋白質合成中的起始氨基酸，但也是所有生物體蛋白質中含量較低的氨基酸之一［1］。L-Met是疏水性最強的氨基酸之一，因此大部分Met殘基都存在于蛋白質內部疏水核心中；在跨膜蛋白結構域中，L-Met經常被發現與脂質雙分子層相互作用［2］。蛋白質中L-Met側鏈中的硫原子可被活性氧、活性氯和活性氮氧化生成甲硫氨酸亞砜（Met-O），導致蛋白質功能失活或激活［3］。酶促甲硫氨酸亞砜還原酶（Msr）可將Met-O還原回Met［4］，發揮蛋白質的氧化還原傳感器的功能［5-6］。S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine， SAM）是L-Met代謝的關鍵中間體，為脂類、蛋白質、核酸、生物堿類等多種生物大分子的甲基化提供甲基供體［7］。除了作為甲基供體的作用外，SAM用于合成環丙基脂肪酸、多胺、乙烯和5′-脫氧腺苷自由基；SAM 還可作為合成生物素和硫辛酸的硫原子來源［8］。病原菌侵染植物后與植物進行硫元素的爭奪，因此L-Met在植物與病原菌互作中發揮重要作用［9］。L-Met的缺少會損害病原體形成生物膜的能力，降低其在宿主細胞上的黏附能力和抵抗力［10］。此外，在葡萄葉片噴施30 mmol/L L-Met能誘導植物產生過氧化氫，上調植物防御相關基因的表達［11］。

L-Met是人體必需氨基酸，人體自身不能合成，必須從外部獲得。L-Met缺乏導致人體抵抗力下降、血蛋白含量降低，同時會影響兒童精神與身體狀況，因此，L-Met在人類營養中占有重要地位［12］。近年來，在水稻、大豆、煙草等許多作物中已采用基因工程方法成功提高了L-Met含量，從而提高了作物營養價值［13-15］。L-Met是家禽飼料中的必需氨基酸，在飼料添加劑領域具有巨大的市場需求，其全球市場規模已達到約50億美元［16-17］。L-Met的生產方法主要包括化學合成法、生物酶催化法、微生物發酵法。常規化學合成在市場上占據主導地位；酶法合成一般不作為單獨的生產路線，其第一步是通過微生物發酵合成相應的甲硫氨酸前體，然后將去除菌體的發酵液用于體外酶催化生產L-Met。盡管這兩種技術成熟、成本低，但環境污染和產物提純存在問題，因此，環境友好且可持續發展的微生物發酵法具有廣闊的應用前景，但由于L-Met的生物合成途徑存在復雜的多級調控機制，因此，L-Met尚未實現大規模的發酵生產［7］。

L-Met由一個四碳骨架、硫原子和一個甲基構成（圖1a），幾乎所有細菌都攜帶L-Met生物合成途徑。谷氨酸棒狀桿菌最初作為產生谷氨酸的細菌分離出來，已被廣泛用于谷氨酸和賴氨酸等氨基酸的發酵生產［13］。模式菌株大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌中的生物合成途徑已被解析。本文綜述了近年來細菌中L-Met的生物合成及調控機制的研究進展，并進一步對L-Met的生物合成的關鍵酶進行分析，同時為L-Met的合成生物學提供思路。

1 L-Met的生物合成途徑與機理

1.1 L-Met的三個合成前體的生物合成

在大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌中，四碳骨架來自糖酵解、三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環和天冬氨酸代謝途徑產生的高絲氨酸；硫原子來自硫同化途徑產生的硫化氫或者半胱氨酸；甲基來自一碳循環中產生的5-甲基四氫葉酸（5-methyl-THF）［7］。

L-高絲氨酸的生物合成：葡萄糖首先通過糖酵解和三羧酸循環途徑合成L-天冬氨酸，進一步進入L-天冬氨酸代謝途徑。天冬氨酸在天冬氨酸激酶（aspartate kinase，LysC）的催化下形成天冬氨酰-4-磷酸，然后被天冬氨酸半醛脫氫酶（aspartaldehyde dehydrogenase，Asd）催化形成天冬氨酸-4-半醛。在高絲氨酸脫氫酶（homoserine dehydrogenase，Hom）的催化下天冬氨酸-4-半醛生成 L-高絲氨酸進入 L-Met的代謝途徑（圖1b）［7， 18］。

硫同化途徑合成硫化氫和半胱氨酸：L-Met包含 21.5% 的硫，即每生產1 g 的L-Met需要0.22 g 的硫，硫同化是L-Met合成途徑中硫的主要來源。硫的同化主要指SO42-的還原同化途徑（assimilatory sulfate reducting，ASR）。首先，SO42-在其轉運體的作用下轉運到細胞內，SO42-在硫酸腺苷酸轉移酶（ATP sulfurylase，CysDN）的作用下合成5-磷酸腺苷硫酸鹽（adenosine-5-phosphosulfate，APS），接著在腺苷硫酸鹽激酶（APS kinase，CysC）的作用下形成3-磷酸腺苷-5-磷酸硫酸鹽（3-phosphoadenosine-5-phosphosulfate，PAPS），PAPS 進一步經 PAPS 還原酶（PAPS reductase，CysH）和亞硫酸還原酶（sulfite reductase，CysIJ）還原形成 H2S，H2S 進一步在半胱氨酸合成酶（cysteine synthase，CysK）的作用下與O-乙酰絲氨酸反應生成半胱氨酸（圖1b）［7， 19-20］。

一碳循環產生甲基供體：L-Met的甲基在谷氨酸棒狀桿菌和大腸桿菌中來自一碳（C1）單元循環。絲氨酸羥甲基轉移酶（serine hydroxymethyltransferase，GlyA）催化 L-絲氨酸裂解形成 L-甘氨酸和 5，10-亞甲基四氫葉酸（5，10-methylene-THF）。隨后，5，10-亞甲基四氫葉酸被5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MetF）催化產生5-甲基四氫葉酸作為甲基供體參與L-Met的合成（圖1b）［7， 21］。

1.2 從L-高絲氨酸到L-Met的生物合成途徑

從高絲氨酸合成L-Met是細菌中L-Met的普遍合成途徑：1）酰化（acylation）：通過酰化高絲氨酸來激活高絲氨酸；2）硫化（sulfurylation）：用巰基取代側鏈羥基，得到同型半胱氨酸；3）甲基化（methylation）：將甲基轉移到硫醇上，產生L-Met［21］。

1.2.1 酰化

將L-高絲氨酸酰化為O-琥珀酰-L-高絲氨酸或O-乙酰-L-高絲氨酸，是L-Met生物合成中的第一個特異性反應，其中涉及了兩個酶：高絲氨酸O-琥珀酰轉移酶（HTS，MetA ）或高絲氨酸O-乙酰轉移酶（HTA，MetX）［21-22］（圖2）。大腸桿菌使用O-琥珀酰激活高絲氨酸，而其他許多細菌使用來自乙酰輔酶A的O-乙酰基團激活高絲氨酸［21］。盡管HTS和HTA催化相似的化學反應，但這些蛋白質在序列和三維結構上不存在相關性［22］。蠟樣芽孢桿菌 MetA 蛋白與 HTS 蛋白的氨基酸序列一致性超過50%，但發揮的仍是 HTA 酶功能［23］。Zubieta等［23］的研究表明：活性位點中的單個氨基酸決定了酰基轉移酶的類型，若MetA/X活性位點（第111位氨基酸）為谷氨酸（Glu111），發揮HTA活性；若活性位點為甘氨酸（Gly111）則發揮HTS 活性。然而，20%的MetA酶在這個位置既不是谷氨酸也不是甘氨酸。2017年，Ferla等［21］測定了100種來自不同物種的MetA和MetX酶活性，并基于蛋白質結構模型對活性位點進行分類，他們發現目前數據庫中存在的HTA或HTS的蛋白序列有大于60%被錯誤注釋。同時進化分析表明，乙酰輔酶A最初是這些同工酶的底物，而隨著細菌的進化，出現了僅使用琥珀酰輔酶A作為底物的HTS。

1.2.2 硫化

激活高絲氨酸后，下一步是將酰化羥基交換為硫醇基團，生成同型半胱氨酸，這一過程稱為硫化。反式硫化和直接硫化是細菌L-Met生物合成中硫化的兩種主要途徑（圖2）［7， 24］。在反式硫化中，O-琥珀酰-L-高絲氨酸或O-乙酰-L-高絲氨酸通過兩個步驟轉化為 L-同型半胱氨酸。首先，半胱氨酸和O-琥珀酰-L-高絲氨酸或O-乙酰-L-高絲氨酸在胱硫醚γ合成酶（MetB）催化下生成胱硫醚；然后，胱硫醚在胱硫醚β裂解酶（MetC）作用下轉化為 L-同型半胱氨酸（圖2）［25-26］。在該途徑中，硫化氫以無機硫形式通過半胱氨酸合成酶A（CysK）合成半胱氨酸，隨后半胱氨酸作為硫供體參與L-Met合成［27］。在直接硫化途徑中，O-琥珀酰-L-高絲氨酸（OSH）或O-乙酰-L-高絲氨酸（OAH）僅通過一步轉化為L-同型半胱氨酸。O-乙酰高絲氨酸硫化酶（MetY）或O-琥珀酰高絲氨酸硫化酶（MetZ）將O-乙酰-L-高絲氨酸或O-琥珀酰-L-高絲氨酸與硫化氫結合形成L-同型半胱氨酸（圖2），因此，該途徑不依賴半胱氨酸作為硫源［28］。Ferla等［21］分析發現，反式轉硫化途徑幾乎存在于所有γ-變形桿菌綱，但僅有少數α -變形菌綱物種存在該途徑。分離自硫化氫含量豐富環境中的物種，如來自熱泉的嗜熱菌具有直接硫化途徑［29］。此外，由metY編碼的O-乙酰高絲氨酸硫化酶在所有類別的細菌中普遍存在，說明這是同型半胱氨酸合成的主要途徑［21］。與metY相比，metZ在細菌基因組中很少被發現，在銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌中有相關報道［30-31］。反式硫化途徑和直接硫化途徑并不相互排斥，在許多物種中這兩種途徑同時存在（圖3）。使用半胱氨酸作為硫醇基團的來源在代謝上成本更高，但它通常比游離硫化物更容易獲得且與游離硫化物相比其揮發性相對較低［21］。

1.2.3 甲基化

甲硫氨酸合酶（甲基轉移酶）將甲基轉移到L-同型半胱氨酸生成L-Met是L-Met合成的最后一步。目前報道的大部分細菌使用甲硫氨酸合酶MetH、MetE合成L-Met（圖2）。根據甲基供體和催化活性的不同，甲硫氨酸合酶包括MetH、MetE、MesA、MesB、MesC、MesD、MmuM和Gbt/Bmt（表1）。

MetH和MetE 使用5-甲基四氫葉酸為甲基供體，但MetH 需要鈷胺素（維生素 B12）或其他鈷酰胺作為輔因子，而MetE 不需要任何有機輔因子［32］；Price等［33］通過分析不同細菌和古細菌基因組中潛在甲硫氨酸合酶的序列，鑒定了四個非葉酸依賴性甲硫氨酸合酶家族MesA、MesB、MesC和MesD。除此之外，MmuM以S-甲基甲硫氨酸（S-methylmethionine，SMM）為甲基供體，將L-同型半胱氨酸轉化為L-Met［34］。Gbt/Bmt將甲基從甘氨酸甜菜堿轉移到同型半胱氨酸，產生L-Met和二甲基甘氨酸 ［35-36］ 。

1.2.3.1葉酸依賴性甲硫氨酸合酶MetH和MetE

MetH和MetE是兩種被經過充分研究的甲硫氨酸合酶，MetE和MetH兩者在活性位點都含有一個鋅原子，該鋅原子通過類似的機制激活同型半胱氨酸 ［37］。鈷胺素依賴性甲硫氨酸合酶 （MetH）存在5-甲基四氫葉酸和SAM兩種甲基供體結合位點，可催化5-甲基四氫葉酸和同型半胱氨酸，生成四氫葉酸和L-Met［38-39］。鈷胺素輔因子在催化中起著至關重要的作用，既是甲基供體又是甲基受體［40］。在MetH 反應循環中，甲鈷胺素［MeCo（III）Cbl］被MetH將甲基轉移至同型半胱氨酸變成鈷胺素［Co（I）Cbl］，再將5-甲基四氫葉酸的甲基重新轉移至鈷胺素生成甲鈷胺素［41］。在有氧條件下，Co（I）Cbl被氧化為 Co（II）Cbl；為了避免這種非活性物質的積累，Co（II）Cbl 被黃素氧還蛋白還原為Co（I）Cbl，然后MetH使用 SAM將其甲基化為有活性的MeCo（III）Cbl［41-42］。由于大腸桿菌不合成鈷胺素，因此，在哺乳動物腸道中生長或將鈷胺素添加到生長培養基中的條件下，MetH表達且發揮功能［43］。

不依賴鈷胺素的甲硫氨酸合酶MetE催化甲基從5-甲基-四氫呋喃直接轉移到同型半胱氨酸，生成L-Met，而無需使用中間甲基載體［21］。該反應被認為涉及從一種底物到另一種底物的直接甲基轉移，需要兩種底物在三元復合物中相互作用［43］。目前人們已經確定，同型半胱氨酸與MetE活性位點的緊密結合由鋅離子連接。這種相互作用通過降低其電離常數來激活同型半胱氨酸，使硫酸鹽穩定在中性pH值［44］。MetE起源于基因復制，具有兩個同源結構域，鋅結合在MetE的C末端結構域中，相應的結合位點在大腸桿菌為Cys643、Cys726、His641 和Glu665［37］。在不添加B12和L-Met的有氧條件下，metE的轉錄水平最高，可占細菌總蛋白的3%～5%。在二硫化物的脅迫下，MetE的第645位半胱氨酸位于活性位點的入口處，容易被氧化型谷胱甘肽氧化導致蛋白活性降低，從而引起L-Met缺陷導致的生長不良［45］。

大腸桿菌基因組同時含有metE和metH，MetH的酶活性比MetE高約50倍，且它們的表達存在差異：MetH僅在維生素B12存在下發揮功能；在沒有外源性B12 的情況下，MetE是L-Met從頭合成的唯一來源［46］。

1.2.3.2 非葉酸依賴性甲硫氨酸合酶MesA、MesB、MesC和MesD

MesA、MesB、MesC和MesD是最新鑒定的四個非葉酸依賴性甲硫氨酸合酶，它們與MetE C端的催化結構域同源，但缺乏結合葉酸的N端結構域［33］。

MesA目前僅在產甲烷菌（嗜熱自養甲烷桿菌）中被鑒定；體外生化試驗證明，MesA 利用甲鈷胺作為甲基供體從同型半胱氨酸合成L-Met，但不能使用5-甲基四氫葉酸或5-甲基四氫甲蝶呤作為甲基供體。由于MesA與甲鈷胺表現出較弱的親和力且產甲烷菌中的大多數鈷胺素與類咕啉蛋白結合，因此，MesA的生理底物可能是甲基類類咕啉蛋白［33］。

MesB是在脫鹵球菌（Dehalococcoides mccartyi）中發現的甲硫氨酸合酶。MesB在體外使用甲鈷胺素，而不是5-甲基四氫葉酸作為甲基供體合成L-Met。Deobald等［39］發現， MesB不能回補大腸桿菌缺失菌株，因此，MesB可能從還原性乙酰輔酶A途徑的鈷鐵硫蛋白（CoFeSP）中獲得甲基。

MesC僅存在于厭氧古細菌的幾個屬中，是一個假定的甲硫氨酸合酶，具有保守的功能殘基。研究發現，含有MesC的所有生物都是含有編碼還原性乙酰輔酶A途徑的厭氧古細菌，并預測大多數 MesC 蛋白使用鈷鐵硫蛋白的甲基作為甲基來源［33］。

MesD是在貝利不動桿菌ADP1中發現的一種不尋常的甲硫氨酸合酶［47］，僅存在于需氧細菌中。在沒有鈷胺素的情況下， mesD和相鄰的基因mesX均是L-Met合成所必需的基因。mesD最初被注釋為 MetE 蛋白，但mesD缺乏 N 端葉酸結合結構域，并且它與 MetE的C端催化結構域有很遠的親緣關系（相似度低于30%）。相鄰基因mesX編碼未表征的DUF1852家族蛋白［33， 48］。試驗證明，5-甲基四氫葉酸不是 MesD 的甲基供體，且MesD 需要 MesX 和氧氣才能合成L-Met［33］。

1.2.3.3 同型半胱氨酸S-甲基轉移酶MmuM

同型半胱氨酸S-甲基轉移酶（homocysteine S-methyltransferases，HMT）是一種存在于植物、細菌、真菌和動物中的酶［34］。在植物中，L-Met被甲硫氨酸S-甲基轉移酶（methionine S-methyltransferase，MMT）甲基化產生S-甲基-L-Met；SMM又在同型半胱氨酸S-甲基轉移酶介導的反應中作為同型半胱氨酸的甲基供體，生成L-Met［34］。大腸桿菌K-12菌株MG1655具有由mmuM基因編碼的HMT，該基因與SMM轉運蛋白基因mmuP位于同一操縱子中［34］。大腸桿菌MmuM含有310個殘基，可以使用 SMM 或（R，S）-SAM 作為甲基供體，對SMM具有偏好性但不能使用（S，S）-SAM［49］。對于不能合成SMM的細菌，可能使用環境中或者植物體內的SMM合成L-Met［34， 49］。

1.2.3.4 甜菜堿-同型半胱氨酸甲基轉移酶Gbt/Bmt

甜菜堿-同型半胱氨酸甲基轉移酶（betaine-homocysteine methyltransferase，BHMT）是一種首先在人類和大鼠中表征的酶，使用甘氨酸甜菜堿可作為合成L-Met的替代甲基供體［36］。細菌中甘氨酸甜菜堿轉甲基化酶（Gbt）的基因最早通過生化、生理和分子方法在銅綠假單胞菌Fildes III中被鑒定［35］。在草木樨中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）102F34 中鑒定到與哺乳動物BHMT相關的細菌基因命名為bmt，但bmt與gbt并沒有同源性［36］。雖然MetH和Bmt在苜蓿中華根瘤菌中同時存在，但研究表明，植物不向細菌提供甘氨酸甜菜堿，MetH是共生過程中L-Met合成的主要途徑［36］。

2 L-Met生物合成的調控機制

L-Met的生物合成中相關酶的轉錄、翻譯和催化水平受到復雜且嚴格的控制。這些多層次的調節機制導致微生物無法自然地過量產生L-Met。

2.1 轉錄水平調控

目前對于L-Met的合成調控主要集中于大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌。在大腸桿菌中，MetR蛋白是LysR家族轉錄調控因子，L-Met的合成前體同型半胱氨酸可與MetR結合，增強MetR和靶基因啟動子（如metA、metF、metE和metH）中的TGAANNT/ANNTTCA序列的結合能力，并激活其轉錄［50-51］。MetJ作為阻遏蛋白負調控L-Met合成和轉運相關的多個基因，包括 metA、metBL、metC、metE、metF（編碼甲基供體合成酶）、metR和metNIQ（編碼L-Met轉運蛋白）［52-53］。MetJ轉錄因子與SAM一起結合到AGAC-GTCT回文序列（met-box）的啟動子區域，以抑制靶基因的轉錄［54］。CysB是大腸桿菌中硫同化途徑的主要調控因子。CysB編碼了LysR型的轉錄激活子，可以結合到基因啟動子區域促進 cysPTWAM、sbp、cysDNC、cysJIH 和cysK等基因的表達，同時抑制自身的表達。CysB與啟動子的結合能力受到 SO24- 和 S2O23-的抑制［55］。在谷氨酸棒狀桿菌中，L-Met的合成和轉運由McbR阻遏蛋白調控［20］。McbR是谷氨酸棒狀桿菌中硫代謝的全局調控因子，調控的基因包括hom、metX、metB、metE、metH、cysI（編碼亞硫酸還原酶）、cysK（編碼半胱氨酸合酶）和metK（編碼SAM合成酶）等［56-57］。在構建產生L-Met菌株的過程中，通常會敲除大腸桿菌中的抑制因子MetJ和谷氨酸棒狀桿菌中的McbR，以去除對相關基因的負轉錄調控［7］。

2.2 轉錄后水平調控

大多數革蘭氏陽性細菌通過RNA調控因子（如T-box和SAM-I核糖開關），對L-Met合成基因的5′UTR區域在轉錄后水平上調節L-Met基因的表達［58］。SAM-I（也稱為 S-box）是一類核糖開關，可與SAM結合從而調節L-Met生物合成基因表達［59］。此外，T-box類的核糖開關監測特定tRNA的氨酰化狀態，以誘導受調節基因的表達，參與L-Met和其他氨基酸的生物合成［60］。有趣的是，SAM-I和T-box 核糖開關使用相反的策略來控制L-Met生物合成，SAM-I響應SAM濃度的增加使用負反饋機制調控L-Met生物合成，而 T-box響應不帶電的Met-tRNA的積累使用正反饋機制來開啟L-Met生物合成［61-62］。2018年，Zhang等［63］首次在革蘭氏陰性菌——植物病原黃單胞菌Xcc中發現位于L-Met合成操縱子met的5'UTR 區域可作為反饋調節器調控L-Met的生物合成；隨后，Tang等［58］發現該5'UTR編碼功能性 SAM-IXcc核糖開關，響應SAM和Met - tRNA參與 met 操縱子的表達調控。

2.3 核心基因的反饋抑制

除L-Met以外，必需氨基酸異亮氨酸、賴氨酸和蘇氨酸是由L-Met合成途徑的不同分支產生［64］。在大腸桿菌中天冬氨酸激酶由lysC、thrA和metL基因編碼，受L-賴氨酸、L-蘇氨酸及產物L-Met的反饋調節， 3個基因均在轉錄水平上受到調控，但只有LysC和ThrA相關酶受其代謝途徑L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋控制［65］。在谷氨酸棒狀桿菌中，僅含有1 種天冬氨酸激酶，由lysC基因編碼，受到分支途徑L-賴氨酸和L-蘇氨酸的協同反饋抑制［66］。天冬氨酸半醛脫氫酶由asd基因編碼，在大腸桿菌中其受到L-賴氨酸、L-蘇氨酸及L-Met的反饋阻遏，但在谷氨酸棒狀桿菌中該酶不受終產物的抑制［67］。在大腸桿菌中含有兩個天冬氨酸半醛脫氫酶分別由thrA和metL基因編碼，其活性受蘇氨酸的抑制［67］。在谷氨酸棒狀桿菌中天冬氨酸半醛脫氫酶是一種單功能酶，由hom基因編碼，其表達受到產物L-Met反饋阻遏，由于其結構C-末端ACT結構域的存在，對L-蘇氨酸的反饋抑制較為敏感［68］。在大腸桿菌中metA基因和谷氨酸棒狀桿菌中metX表達及活性均受產物L-Met和代謝物SAM所抑制［69］。在構建產生L-Met菌株的過程中，反饋抑制通常通過突變核心基因關鍵位點，使它們對反饋抑制產生抵抗力。例如，構建大腸桿菌中關鍵基因metA的反饋抑制單突變體Y294C和三突變體R27C-I296S-P298L，可以消除L-Met和SAM的反饋抑制［7］。

2.4 環境因素

細菌能夠感應外界環境中的營養成分，并根據這些信息調整L-Met的生物合成。碳源和氮源的種類和比例對L-Met的產量有明顯的影響［20］。在培養基中添加半胱氨酸、乙硫氨酸等化合物均可使L-Met的產量顯著調高，如Kumar等［64］在培養基中添加半胱氨酸，可使L-Met產量從2.34 g/L提高到3.39 g/L。金利群等［70］的研究發現，當 Na2S2O3 的添加量在 3 g/L時，L-Met產量可提高41.3%。培養條件也是影響L-Met產量的關鍵，包括pH、溫度及攪拌速率等。Zhou等［71］發現pH值為7時，大腸桿菌發酵生產L-Met的產量達到最高，分別比pH值為6.5和7.5時提高了37.78 %和18.10 %，表明中性pH值有助于大腸桿菌發酵生產L-Met。攪拌速率是影響細胞生長和代謝產物生物合成的重要因素。攪拌速率在200～400 r/min 最為適宜，當攪拌速率為300 r/min時L-Met的產量最高［71］。

3 總結與展望

L-Met在所有生物體中都是必不可少的，因為它既是一種必需氨基酸，又是輔因子SAM的組成部分［72］。L-Met具有廣泛的應用和巨大的市場需求，與我們的生活息息相關。盡管化學合成仍然是生產L-Met的主要方法和最便宜的選擇，但由于資源稀缺和環境污染，它是不可持續的。因此，發展微生物發酵以取代其工業生產的傳統化學途徑是十分重要的。L-Met的生物合成是一個多分支、多層次的調控途徑，其中代謝調控由多個步驟控制，排列復雜，涉及一系列基因，目前L-Met生產的代謝工程策略主要包括：1）解除代謝途徑對關鍵酶的反饋作用；2）阻斷或削弱支路代謝途徑；3）通過基因工程方法增強L-Met的生物合成途徑；4）增強輔助因子的供應；5）轉運系統的優化；6）優化發酵條件［73］。目前通過代謝途徑改造策略在大腸桿菌W3110獲得的L-Met最高產量為30 g/L［74］。然而，通過微生物發酵實現工業規模生產仍然是一個重大挑戰。大腸桿菌已被證明是研究大多數代謝途徑的可靠模式生物，其通過O-琥珀酰化中間體和反式硫酸化從高絲氨酸生物合成L-Met的途徑得到了很好的表征［21］。然而，對包括谷氨酸棒狀桿菌［24］、枯草芽孢桿菌［75］和惡臭假單胞菌［31］在內的物種的研究表明，大腸桿菌途徑并非普遍存在。因此，細菌中L-Met的合成與調控仍然存在一些問題有待進一步研究：1）L-Met合成途徑中的酰化酶包括高絲氨酸O-琥珀酰轉移酶和高絲氨酸O-乙酰轉移酶，但是酰化酶的命名和區分仍不明確；2）在谷氨酸棒狀桿菌中直接硫化和反式硫化由不同的酶負責，但是在枯草芽孢桿菌中發現MetI具有雙功能酶活性，因此硫化相關酶的酶活機制和分類有待進一步研究；3）L-Met合成的最后一步甲基化酶MesA、MesB、MesC、MesD的甲基供體仍不清楚，不同細菌甲基化酶不同對細菌在進化上分類是否有關系也有待研究；4）革蘭氏陰性菌在轉錄后水平調控L-Met的生物合成有待進一步完善；5）不同細菌的L-Met合成途徑存在差異（圖3）［13］，鑒定更多細菌的L-Met合成途徑也是今后的研究內容。

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