GluA對須糖多孢菌生長發(fā)育和丁烯基多殺菌素生物合成的影響

摘 要：谷氨酸轉運蛋白（GluA）是一類ATP結合蛋白，可通過調控谷氨酸的主動運輸影響細胞內碳代謝、氮代謝和次級代謝，屬于ABC轉運系統(tǒng)。為研究GluA對放線菌須糖多孢菌（Saccharopolyspora pogona）生長發(fā)育及丁烯基多殺菌素生物合成的影響，本研究通過基因編輯技術對編碼該蛋白的基因gluA-1分別構建了過表達和敲除菌株。表型分析顯示，過表達菌株S. pogona：：gluA-1丁烯基多殺菌素產量升高了4.2倍，菌體生長發(fā)育對數期延長，菌株最高菌體密度和乙酰輔酶A含量顯著提升，但菌絲體形態(tài)無明顯改變。敲除菌株S. pogona-ΔgluA-1丁烯基多殺菌素產量則下降了37%，菌株生長明顯受抑制，乙酰輔酶A含量顯著下降，且菌絲體縮短變粗，分支減少。以上結果表明，GluA對須糖多孢菌生長發(fā)育和丁烯基多殺菌素生物合成具有一定的促進作用，這為研究其在鏈霉菌次級代謝過程中的作用奠定了重要基礎。

關鍵詞：須糖多孢菌；丁烯基多殺菌素；谷氨酸轉運蛋白；生物合成；基因編輯

中文分類號：Q93" " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.05.009

Abstract： Glutamate transporter GluA， is a class of ATP-binding proteins that can affect intracellular carbon metabolism， nitrogen metabolism and secondary metabolism by regulating the active transport of glutamate， belonging to the ABC transport system. To study the effects of GluA on the strain growth development and butenyl-spinosyn biosynthesis in Saccharopolyspora pogona， gluA-1 overexpression and deletion strains were constructed by genetic engineering technology. Phenotypic analysis showed that the butenyl-spinosyn production increased by 4.2 times， the bacterial growth logarithmic phase was prolonged， the maximum bacterial density and acetyl-CoA content significantly increased， whereas the mycelium morphology was not significantly changed in overexpressed strain S. pogona：：gluA-1. The butenyl-spinosyn production decreased by 37%， the strain growth was inhibited obviously， the acetyl-CoA content significantly decreased， and the mycelium was shortened and thickened， branching was reduced in deletion strain S. pogona-ΔgluA-1. These results indicated that GluA could promote the growth development and the butenyl-spinosyn biosynthesis in S. pogona， which laid an important foundation for the study of GluA's role in the secondary metabolism of Streptomyces.

Key word： Saccharopolyspora pogona; butenyl-spinosyn; glutamate transporter protein; biology synthesis; gene editing

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（5）： 470-480）

近年來，化學農藥的嚴重濫用導致環(huán)境污染，并威脅了糧食安全和人類健康，因此，對綠色友好型殺蟲劑的市場需求越來越大，基于此，多國政府和研究人員組織重點攻關進行研究和開發(fā)。丁烯基多殺菌素是由須糖多孢菌（Saccharopolyspora pogona）經好氧發(fā)酵產生的具有快速觸殺及攝食毒性的新型高效廣譜微生物源殺蟲劑，是當前國際上能取代有殘留化學農藥的最有發(fā)展前景的綠色殺蟲劑［1］。與多殺菌素相比，丁烯基多殺菌素具有更強的殺蟲活性，更廣的殺蟲譜，如對多殺菌素無法防治的蘋果蠹蛾具有很好的殺蟲活性。但須糖多孢菌菌株生長緩慢，發(fā)酵周期長，丁烯基多殺菌素產量極低，限制了其在農業(yè)上的大規(guī)模推廣應用［2］。

為提高丁烯基多殺菌素的產量，滿足市場需求，近年來研究人員主要采取代謝工程改造促進丁烯基多殺菌素生物合成來解決須糖多孢菌產量低的問題，主要涉及：1）途徑基因調控，如通過過表達鼠李糖合成相關基因（gtt、gdh、epi、kre）和聚酮合酶基因簇（pks），使丁烯基多殺菌素產量分別提升2.7倍和3.25倍［3-4］。2）代謝流調控，如通過過表達參與核苷酸代謝的聚核苷酸磷酸化酶基因pnp和鐵儲存調節(jié)基因bfr，使丁烯基多殺菌素產量分別提升1.92倍和3.0倍［5-6］。采用精簡基因組的策略刪除了2個競爭性基因簇（cluster 13和cluster 14），使前體最大化流向目標產物合成途徑，促使丁烯基多殺菌素產量分別提升4.06倍和4.72倍［7-8］。3）轉錄調控，如在須糖多孢菌中鑒定出多個影響丁烯基多殺菌素生物合成的轉錄調控基因，包括PhoU調控因子、pII調控因子、TetR家族調控因子、SenX3-RegX3雙組分系統(tǒng)等［9-12］。4）異源生物合成，如通過RedEx方法在spn基因簇中將busA基因中的延伸模塊插入spnA基因中獲得spnbusA基因，并在白色鏈霉菌（Streptomyces albus）J1074中異源表達得到了2.36 mg/L丁烯基多殺菌素A，實現從無到有的合成［13］。然而，參與丁烯基多殺菌素生物合成的重要功能酶基因和調控基因未知，使得通過代謝工程改造提高其產量的幅度并不明顯，因此，尋找影響丁烯基多殺菌素生物合成的關鍵酶基因和調控基因并進行定向遺傳改造，促進丁烯基多殺菌素生物合成成為近年研究的熱點之一。

谷氨酸是重要的營養(yǎng)物質，不僅參與細胞的構建，還可作為重要的調控因子參與次生代謝過程，如通過直接參與三羧酸循環(huán)形成α-酮戊二酸，影響中心碳代謝的進行；另外，谷氨酸調控轉氨作用，是多種氨基酸合成的前體，并且與激素、核苷酸等次生物質的代謝相關，連接并影響生物體內的碳代謝、氮代謝和次級代謝［14］。丁烯基多殺菌素的合成前體包括乙酰輔酶A、丙二酰輔酶A、甲基丙二酰輔酶A、鼠李糖、福樂糖胺和S-腺苷-甲硫氨酸等，可通過中心碳代謝和氮代謝轉化生成，由此可見谷氨酸與丁烯基多殺菌素生物合成有著密切聯系。微生物主要通過ABC轉運系統(tǒng)來攝取環(huán)境中的谷氨酸，如GluABCD系統(tǒng)［15-16］。有研究報道，將來自谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）的GluABCD系統(tǒng)在大腸桿菌（Escherichia coli）中異源表達后，可顯著增強后者對胞外谷氨酸的轉運能力［17］。因此，推測GluABCD系統(tǒng)可通過調控谷氨酸的轉運來影響須糖多孢菌的生長發(fā)育與丁烯基多殺菌素的生物合成。在GluABCD系統(tǒng)中，GluA為ATP結合蛋白，可通過水解ATP為谷氨酸轉運提供能量，嚴格控制著細胞對胞外谷氨酸的攝取效率。

在本研究中，我們選擇對編碼GluA的基因gluA-1進行基因編輯，利用融合PCR和原生質體轉化等技術，在須糖多孢菌中分別過表達和敲除gluA-1基因，成功構建了S. pogona：：gluA-1和S. pogona-ΔgluA-1工程菌株。通過比較兩株工程菌株與原始菌株在丁烯基多殺菌素產量、菌株生長、乙酰輔酶A合成以及菌絲體形態(tài)分化等方面的差異，以明確GluA在須糖多孢菌中的生物學功能。本研究為GluA在須糖多孢菌中的作用與功能提供了新的重要信息，為通過合成生物學構建高產工程菌株提供了重要修飾靶基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒和引物

本研究所用的相關菌株和質粒見表1，所用引物見表2。

1.1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

使用細菌LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基用于大腸桿菌DH5α的活化與培養(yǎng)；使用完全補充培養(yǎng)基（complete supplement medium，CSM）用于須糖多孢菌種子活化；使用半合成發(fā)酵培養(yǎng)基用于須糖多孢菌丁烯基多殺菌素產量、菌體密度、乙酰輔酶A含量測定以及菌絲體形態(tài)觀察；使用R5培養(yǎng)基用于須糖多孢菌原生質體轉化試驗。上述培養(yǎng)基配方按照參考文獻［18］提供的配方進行配置，所使用抗生素為阿泊拉霉素（apramycin，Apr），終質量濃度為50.0 mg/mL。

1.1.3 主要試劑

PrimeSTAR HS DNA聚合酶，限制性內切酶Hind III、EcoR I、EcoR V，T4 DNA聚合酶購自寶生物工程有限公司；細菌基因組DNA和質粒DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、PCR產物回收試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；抗生素等其他生化試劑均購自天恒生物科技有限公司。

1.2 gluA-1與gluA-2基因在須糖多孢菌中時序表達分析

將活化后的野生型須糖多孢菌接種至半合成發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別在第48、96、144、192 h取樣進行總RNA提取并將其反轉錄為cDNA。以16S rRNA為內參基因，gluA-1與gluA-2基因為目標基因，各自設置4組重復。反應程序為：95℃、10 min，95℃、15 s；60℃、1 min；40個循環(huán)。反轉錄實時定量PCR（real-time quantitative reverse tranion PCR，qRT-PCR）加樣體系（10.0 μL）：SYBRTM Green Master Mix 5.0 μL，上、下游引物（10.0 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，Nuclease-free water 3.0 μL。使用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.3 gluA-1基因過表達和敲除載體構建

1.3.1 gluA-1基因過表達載體構建

以pOJ260-PermE質粒為模板，設計引物對PermE-F/PermE-R，PCR擴增出紅霉素強啟動子PermE，以須糖多孢菌基因組為模板，設計引物對gluA-1-F/gluA-1-R，PCR擴增出gluA-1基因片段。紅霉素強啟動子PermE與gluA-1基因片段純化回收后，再利用重疊延伸PCR將兩片段進行融合生成融合產物PermE-gluA-1。然后，將融合產物PermE-gluA-1與pOJ260載體同時經Hind III/EcoR I雙酶切以及T4 DNA連接酶連接，最后，將連接產物通過熱激轉化轉入大腸桿菌DH5α中，并涂布于含有阿泊拉霉素的LB固體板上。待平板長出轉化子后，隨機挑取6～8個單克隆進行培養(yǎng)和質粒提取，提取的重組質粒經PCR鑒定和測序驗證，最終獲得過表達載體pOJ260-PermE-gluA-1。

1.3.2 gluA-1基因敲除載體的構建

以pOJ260質粒為模板，設計引物對apr-F/apr-R，PCR擴增出阿泊拉抗性基因apr；以須糖多孢菌基因組為模板，設計2對引物對gluA-1-up-F/gluA-1-up-R和gluA-1-down-F/gluA-1-down-R，PCR擴增出gluA-1基因上、下游同源臂。阿泊拉抗性基因apr與gluA-1基因上、下游同源臂純化回收后，再利用重疊延伸PCR將三片段進行融合生成融合產物upgluA-1-apr-downgluA-1。然后，將融合產物upgluA-1-apr-downgluA-1與pOJ260載體同時經Hind III/EcoR V雙酶切以及T4 DNA連接酶連接。最后，將連接產物通過熱激轉化轉入大腸桿菌DH5α中，并涂布于含有阿泊拉霉素的LB固體板上。待平板長出轉化子后，隨機挑取6～8個單克隆進行培養(yǎng)和質粒提取，提取的重組質粒經PCR鑒定和測序驗證，最終獲得敲除載體pOJ260-upgluA-1-apr-downgluA-1。

1.4 gluA-1基因過表達和敲除工程菌構建

采用原生質體轉化的方法來構建工程菌株S. pogona：：gluA-1和S. pogona-ΔgluA-1。分別將構建成功的過表達載體 pOJ260-PermE-gluA-1和敲除載體pOJ260-upgluA-1-apr-downgluA-1在PEG2000的介導下與須糖多孢菌原生質體進行混合，并涂布于R5固體板上，經阿泊拉霉素覆抗后在恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待平板上長出轉化子后，隨機挑取6～8個單克隆進行培養(yǎng)和基因組提取，通過對轉化子進行qRT-PCR驗證，最終獲得過表達菌株S. pogona：：gluA-1和敲除菌株S. pogona-ΔgluA-1。

1.5 工程菌株丁烯基多殺菌素產量分析

按5%接種量將gluA-1基因過表達和敲除菌株與出發(fā)菌株接種于半合成發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵。由于丁烯基多殺菌素在發(fā)酵至第240 h時，其產量會趨于穩(wěn)定，因此取該時間點的發(fā)酵液用于丁烯基多殺菌素產量測定。樣品處理及檢測步驟如下：取0.5 mL發(fā)酵液和等體積乙酸乙酯于1.5 mL EP管中混勻，在經過70℃水浴鍋中水浴1 h以及超聲破碎99次后，12 000 g離心10 min，取上清液轉移至新的EP管內并用冷凍濃縮儀進行濃縮至管中僅剩淡黃色固體，隨后加入0.1 mL甲醇進行溶解，12 000 g離心10 min，取上清用于檢測樣品中丁烯基多殺菌素含量。本研究利用高效液相色譜1290檢測分析丁烯基多殺菌素含量，其檢測條件如下：色譜柱型號為ZORBOX SB-C18，規(guī)格為柱長150 mm，柱內徑4.6 mm，柱溫40℃；以乙腈：水體積比為1：9和9：1分別配制流動相A和流動相B，上樣體積為10.0 μL，流速為1.0 mL/min，檢測波長為250 nm。同時，并收集目的峰進行質譜鑒定，檢測條件如文獻［19］所述。

1.6 工程菌株生長曲線測定

按5%接種量將gluA-1基因過表達和敲除菌株以及出發(fā)菌株接種于半合成發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵，每隔24 h取1.0 mL發(fā)酵液，備用（至少3個平行對照），直至菌體密度趨于穩(wěn)定停止取樣。采用分光光度計法來測定菌體含量。測定前，用適量體積的半合成發(fā)酵培養(yǎng)基稀釋菌體，使測定結果處于0.2～0.8之間，以保證測定結果可靠。測定時，空白對照為半合成發(fā)酵培養(yǎng)基，測定數字穩(wěn)定時計數。

1.7 工程菌株乙酰輔酶A含量分析

按5%接種量將gluA-1過表達和敲除菌株以及出發(fā)菌株接種于半合成發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵，取發(fā)酵至第48、96、144 h的發(fā)酵液用于菌體乙酰輔酶A含量檢測，其檢測方法和步驟完全按照乙酰輔酶A檢測試劑盒說明書進行。

1.8 工程菌株菌絲體形態(tài)觀察

按5%接種量將gluA-1基因過表達和敲除菌株以及出發(fā)菌株于半合成發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵，取發(fā)酵至第48 h的發(fā)酵液用于菌絲體形態(tài)觀察。樣品經戊二醛固定和乙醇脫水后，可使用冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡SU8010對其進行菌絲體形態(tài)觀察。

1.9 數據統(tǒng)計與分析

采用單因素方差分析方法進行數據統(tǒng)計學分析，Plt;0.05即差異有統(tǒng)計學意義；使用GraphPad Prism 8軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 gluA基因在須糖多孢菌基因組中的分布及其時序表達分析

全基因組序列分析發(fā)現，須糖多孢菌基因組中存在兩個gluA基因，分別命名為gluA-1（SP_4996）和gluA-2（SP_2672）（圖1a）。gluA-1基因的編碼產物由252個氨基酸組成，gluA-2基因的編碼產物由249個氨基酸組成，二者同源性為71%（表3）。qRT-PCR分析結果顯示，僅有gluA-1在所分析的4個時間點中均存在表達，且從48 h到144 h表達水平顯著下調，從144 h到192 h表達水平顯著上調，該檢測結果不僅說明gluA-1的編碼產物在谷氨酸轉運過程中發(fā)揮重要作用，還表明gluA-1基因的表達水平下調很可能存在限制菌株生長發(fā)育與丁烯基多殺菌素生物合成的問題（圖1b）。因此，本研究選擇對gluA-1進行過表達和敲除來探索GluA表達水平改變如何影響須糖多孢菌生長發(fā)育和丁烯基多殺菌素生物合成。

表3 gluA-1與gluA-2基因編碼產物同源性比較

Tab. 3 Homology comparison of gluA-1 and gluA-2 gene encoding products

Score Method Identities Positives Gaps

364 bits （935） Compositional matrix adjust 71% 85% 0%

2.2 gluA-1基因過表達與敲除載體構建與鑒定

過表達載體pOJ260-PermE-gluA-1的構建流程如圖2a所示。以pOJ260-PermE為模板進行PCR擴增，得到大小約為300 bp的紅霉素強啟動子PermE，以須糖多孢菌基因組為模板進行常規(guī)擴增，得到大小為756 bp的gluA-1基因，然后通過重疊延伸PCR得到大小約為1.0 kb的融合片段PermE-gluA-1。分別以apr-F/apr-R、PermE-F/PermE-R為引物對，對從平板挑取的轉化子進行PCR驗證，結果如圖2b所示。所挑取的轉化子可擴增得到大小約為1.2 kb的apr基因和大小約為300 bp的紅霉素強啟動子PermE，而對照pOJ260未能擴增出該片段。經測序驗證正確后，得到陽性過表達質粒pOJ260-PermE-gluA-1。

敲除載體pOJ260-upgluA-1-apr-downgluA-1的構建流程如圖2c所示。以須糖多孢菌為模板，進行PCR擴增得到gluA-1基因上、下游同源臂，大小均約為1.0 kb，以pOJ260-PermE為模板進行PCR擴增，得到大小約為1.2 kb的apr基因，然后通過重疊延伸PCR得到大小約為3.2 kb的融合片段upgluA-1-apr-downgluA-1。以gluA-1-up-F/gluA-1-down-R為引物對，對從平板挑取的轉化子進行PCR驗證，結果如圖2d所示，轉化子可擴增得到大小約為3.2 kb的目的片段，而對照pOJ260未能擴增出該片段。經測序驗證正確后，得到陽性敲除質粒pOJ260-upgluA-1-apr-downgluA-1。

2.3 gluA-1基因過表達與敲除工程菌構建與鑒定

將過表達質粒pOJ260-PermE-gluA-1和敲除質粒pOJ260-upgluA-1-apr-downgluA-1通過原生質體轉化轉入須糖多孢菌中。過表達質粒pOJ260-PermE-gluA-1通過單交換同源重組整合至須糖多孢菌染色體上，敲除質粒pOJ260-upgluA-1-apr-downgluA-1則通過雙交換同源重組使apr基因替換gluA-1基因。由于質粒pOJ260在須糖多孢菌中無法復制，只有整合到須糖多孢菌基因組上才能維持自身的存在，因此，以能否在阿泊拉抗性平板上長出轉化子來初步判斷gluA-1基因過表達和敲除工程菌株是否構建成功。隨后對轉化子進行qRT-PCR驗證，結果顯示，在工程菌S. pogona：：gluA-1中gluA-1基因的轉錄水平明顯增強，而在工程菌S. pogona-ΔgluA-1中幾乎檢測不到gluA-1基因的轉錄水平，證明gluA-1基因過表達與敲除工程菌構建成功（圖3）。

2.4 gluA-1基因表達水平改變對須糖多孢菌丁烯基多殺菌素生物合成的影響

利用高效液相色譜1290檢測分析出發(fā)菌株、過表達菌株S. pogona：：gluA-1與敲除菌株S. pogona-ΔgluA-1發(fā)酵液中丁烯基多殺菌素產量。結果顯示，出發(fā)菌株在保留時間為13.65 min處的色譜峰有明顯的丁烯基多殺菌素色譜峰特征，經質譜鑒定，發(fā)現該時間點的色譜峰含有相對分子質量為189.27的三甲基鼠李糖碎片峰，證明該色譜峰存在丁烯基多殺菌素。經比較發(fā)現，出發(fā)菌株丁烯基多殺菌素峰面積為78.6 mAU，過表達菌株S. pogona：：gluA-1在該時間點的峰面積可達330.3 mAU，為出發(fā)菌株的4.2倍，而敲除菌株S. pogona-ΔgluA-1在該時間點的峰面積僅有49.3 mAU，為出發(fā)菌株的63%。該結果表明，gluA-1基因過表達能促使丁烯基多殺菌素產量的提高，而gluA-1基因的敲除則使丁烯基多殺菌素產量降低（圖4）。

2.5 gluA-1基因表達水平改變對須糖多孢菌生長的影響

對過表達菌株S. pogona：：gluA-1、敲除菌株S. pogona-ΔgluA-1與出發(fā)菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長特性進行了實時檢測。結果如圖5所示：過表達菌株S. pogona：：gluA-1與出發(fā)菌株在生長對數期早期（前48 h）的變化基本同步，但從48 h開始，過表達菌株S. pogona：：gluA-1的生長速率要明顯弱于出發(fā)菌株，出現了一個相對較長的對數生長期，維持約120 h，于168 h進入穩(wěn)定期，而出發(fā)菌株則在96 h就已進入穩(wěn)定期；此外，過表達菌株S. pogona：：gluA-1的菌體最高密度要略高于出發(fā)菌株。敲除菌株S. pogona-ΔgluA-1從接種開始，其生長速率要明顯弱于出發(fā)菌株與過表達菌株，于96 h進入穩(wěn)定期，整個生長周期也顯著縮短，菌體最高密度顯著降低。

2.6 gluA-1基因表達水平改變對須糖多孢菌菌絲體形態(tài)的影響

使用冷場掃描電鏡觀察出發(fā)菌株、過表達菌株S. pogona：：gluA-1與敲除菌株S. pogona-ΔgluA-1的菌絲體形態(tài)。結果如圖6所示，過表達菌株S. pogona：：gluA-1與出發(fā)菌株菌絲體形態(tài)無明顯差異，菌絲體均以長絲狀與多分支為主，菌絲體較為密集，但敲除菌株S. pogona-ΔgluA-1菌絲體呈短棒狀，部分呈現碎片化，證明敲除gluA-1基因可使菌株菌絲體形態(tài)發(fā)生顯著改變。

2.7 gluA-1基因表達水平改變對須糖多孢菌胞內乙酰輔酶A合成的影響

對過表達菌株S. pogona：：gluA-1、敲除菌株S. pogona-ΔgluA-1與出發(fā)菌株在發(fā)酵至第48 h、96 h和144 h的菌體進行了乙酰輔酶A檢測。結果如圖7所示，三種菌株的乙酰輔酶A的質量濃度均在第48 h檢測到最高，隨后逐級遞減。其中，過表達菌株S. pogona：：gluA-1胞內乙酰輔酶A的質量濃度始終高于出發(fā)菌株，最高檢測質量濃度是出發(fā)菌株的1.32倍，敲除菌株S. pogona-ΔgluA-1則相反，最高質量濃度僅為野生型菌株的53%，說明提高gluA-1基因的表達水平可促進乙酰輔酶A的合成。

3 討論

由須糖多孢菌經好氧發(fā)酵產生的丁烯基多殺菌素因具有高效、安全、無污染、殺蟲譜廣等優(yōu)點，成為當前國際上最具發(fā)展前景的綠色生物殺蟲劑，而如何有效提高其產量成為了當前研究亟需解決的問題。多年的研究表明，利用基因編輯技術定向改良須糖多孢菌基因組以提高丁烯基多殺菌素產量是極具潛力的，如phoU、bccA、reg和regX3等基因的定向改造均可促進丁烯基多殺菌素生物合成，但產量的提升并沒有得到較大突破［4， 7， 9， 11-12］。繼續(xù)篩選和挖掘參與丁烯基多殺菌素生物合成的重要功能酶基因和調控基因并進行定向遺傳改造促進丁烯基多殺菌素生物合成成為近年研究的熱點之一。

谷氨酸轉運蛋白廣泛存在于動物、植物和微生物中，但僅在醫(yī)學領域的研究中取得了一定的進展，而在微生物中對谷氨酸轉運蛋白的研究較少［20-22］。目前，已發(fā)現的參與谷氨酸轉運的系統(tǒng)有兩類，一類是GLT（GltIJKL）轉運系統(tǒng)［23］，另一類是GluABCD轉運系統(tǒng)［24］，均屬于ABC轉運系統(tǒng)中的成員。通過對須糖多孢菌全基因組序列進行分析，發(fā)現該菌株基因組中只存在編碼GluABCD轉運系統(tǒng)的4個基因，表明GluABCD轉運系統(tǒng)負責須糖多孢菌對胞外谷氨酸的吸收。有關GluABCD轉運系統(tǒng)的研究僅在谷氨酸棒桿菌和天藍色鏈霉中有所闡述，研究發(fā)現，當胞外存在較高濃度谷氨酸時，可通過調控因子GluR來增加gluABCD的表達促進谷氨酸的攝取［21， 25］。GluABCD轉運系統(tǒng)分別由ATP結合蛋白（GluA）、谷氨酸結合蛋白（GluB）和2個跨膜轉運蛋白（GluC和GluD）構成。當GluB結合谷氨酸后，需在GluA水解ATP獲得能量的前提下才能通過跨膜轉運蛋白進入胞內，由此可見，GluA在谷氨酸的轉運中有著至關重要的功能，是影響谷氨酸轉運的重要調控基因，但其表達水平改變能否通過調節(jié)谷氨酸轉運影響菌株生長發(fā)育和次生代謝的研究鮮有報道。

在須糖多孢菌基因組中，我們發(fā)現有2個可編碼GluA的基因（gluA-1和gluA-2），但基因轉錄水平時序表達分析結果顯示，gluA-1基因在整個發(fā)酵周期均檢測到有轉錄，而gluA-2基因的轉錄幾乎檢測不到，說明只有gluA-1在須糖多孢菌谷氨酸轉運中發(fā)揮重要作用。本研究首次利用遺傳改造技術對須糖多孢菌基因組中的gluA-1基因進行過表達和敲除研究，通過比較gluA-1基因表達水平改變對菌株生長發(fā)育與丁烯基多殺菌素產量的差異，來明確其對須糖多孢菌生長發(fā)育與丁烯基多殺菌素生物合成的調控模式。通過高效液相色譜1290檢測丁烯基多殺菌素產量，發(fā)現過表達菌株S. pogona：：gluA-1丁烯基多殺菌素產量提高了4.2倍，而敲除菌株S. pogona-ΔgluA-1產量下降了37%。通過生長曲線和菌絲體形態(tài)的比較，發(fā)現過表達菌株S. pogona：：gluA-1的生長對數期時長和最高菌體密度明顯比出發(fā)菌株高，而敲除菌株S. pogona-ΔgluA-1的生長明顯受到抑制，且菌絲體呈短棒狀，由此說明，gluA-1基因對須糖多孢菌中丁烯基多殺菌素生物合成和菌株生長發(fā)育起正調控作用。結合谷氨酸代謝途徑分析發(fā)現，谷氨酸能通過參與三羧酸循環(huán)形成α-酮戊二酸，也能在谷氨酸脫氫酶的作用下參與轉氨基作用，同時是多種次級代謝產物合成的前體［26］。本研究通過過表達gluA-1，可使 S. pogona：：gluA-1的谷氨酸轉運能力增強，強化中心碳代謝途徑，為菌株的生長發(fā)育與丁烯基多殺菌素生物合成提供更多的前體和能量，而gluA-1基因的缺失則不利于S. pogona-ΔgluA-1對胞外谷氮酸的轉運與利用，使得涉及到的氨基酸循環(huán)和能量循環(huán)不能順利進行，在一定程度上阻斷了菌株正常的生長發(fā)育與丁烯基多殺菌素的生物合成。有研究報道，當gluABCD在菌體內的表達水平增強后，除了能夠提高菌株對胞外谷氨酸的攝取，還能促進菌株對胞外葡萄糖的吸收與利用［27］，后者可通過糖酵解直接轉化生成乙酰輔酶A作為菌株生長與次級代謝的前體來源，推測gluA-1基因很可能以間接方式正調控乙酰輔酶A的合成。為確定gluA-1基因對乙酰輔酶A合成的影響，本研究測量了菌株發(fā)酵液中乙酰輔酶A含量，結果顯示，過表達菌株S. pogona：：gluA-1胞內乙酰輔酶A含量遠高于野生型須糖多孢菌，敲除菌株S. pogona-ΔgluA-1中的乙酰輔酶A含量與此相反，猜想得到驗證。

綜上所述，gluA-1基因可以通過調節(jié)谷氨酸轉運來影響菌株的中心碳代謝與氨基酸代謝，從而為須糖多孢菌的生長發(fā)育與丁烯基多殺菌素生物合成提供更多的前體和能量，最終促進目標產物丁烯基多殺菌素的生物合成。上述結果為后續(xù)如何通過合成生物學技術進一步促進須糖多孢菌丁烯基多殺菌素的生物合成和提高產量提供了重要研究基礎。

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