染色質調節因子相關的lncRNA腎透明細胞癌預后模型的構建和驗證

肖智良 董 洋 史振鐸 韓從輝▲

1.江蘇大學醫學院，江蘇鎮江 212000；2.江蘇省徐州市中心醫院泌尿外科，江蘇徐州 221000

在腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）亞型中，腎透明細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）占主導地位，約占總數的75%，而且過去幾年全球范圍內其患病率明顯增加，尤其是60～70 歲男性[1]。盡管近年來程序性死亡-1/程序性死亡配體1 等免疫檢查點抑制劑療法已經取得一定進展，但還有部分ccRCC患者不能受益于該治療[2-3]。因此，緊迫的任務是要尋找新的治療方案和生物標志物，以改善ccRCC 的診療和預后。

染色質調節因子（chromatin regulator，CR）是一類酶，具有特定的功能域，能夠通過改變染色質結構或修飾染色質來形成和維持表觀遺傳狀態，并與各種癌癥的發生密切相關[4]。研究表明，ccRCC 的發生、發展與CR 的異常表達密切相關[5-7]。例如，BAP1 作為一個腫瘤抑制因子，其缺失或失活會導致PRC1 介導的癌癥相關通路基因的激活或修飾[5-6]。此外，BAP1 突變可以導致ccRCC 的遠處轉移和腎靜脈侵襲[7]。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類可參與和調控多種病理生理過程的非編碼RNA，并且被報道在ccRCC 中通過多種調控作用影響其發生、發展[8-11]。然而，CR 相關的lncRNA 是否可能參與并影響ccRCC 的進展與預后仍有待闡明。因此，本研究全面分析了ccRCC 中與CR 相關的lncRNA，并建立了一種新的預后模型，旨在優化和改善ccRCC患者的預后管理。

1 資料與方法

1.1 數據的獲取與處理

從TCGA 數據庫（http：//cancergenome.nih.gov/）下載ccRCC 轉錄組測序數據及患者臨床信息（包括生存狀態、生存時間、年齡、性別、臨床分級、臨床分期、TNM 分期）。排除隨訪時間＜30 d、資料不完善（包括年齡、性別、臨床分級、臨床分期、TNM 分期）和臨床分級、臨床分期不能評估的樣本，最終納入237 個腫瘤樣本和72 個癌旁正常組織樣本。利用“caret” R軟件包將ccRCC 樣本以7∶3 的比例分為訓練集和驗證集，并分析兩個隊列患者臨床病理變量的分布差異。從Ensembl 數據庫（http：//www.ensembl.org/index.html）中下載人類基因轉錄組的注釋信息，將基因類型為“3prime overlapping ncRNA”“Antisense”“lincRNA”“macro lncRNA”“processed transcript”“sense intronic”和“sense overlapping”的RNA 標記為lncRNA，進一步提取lncRNA 表達矩陣。

1.2 差異表達基因及相關lncRNA 的篩選

從文獻調研中檢索并下載870 個CR[12-17]。采用“DESeq2” R 軟件包行基因差異分析，篩選標準為|log2FC|＞2 且FDR＜0.05。對差異表達的CR 和lncRNA 行Spearman 相關性分析，當相關系數|rs|＞0.3 且P＜0.05 時，被認為具有相關性，并構建共表達網絡。

1.3 預后模型的構建

基于“survival” R 軟件包，對CR 相關的lncRNA行單因素Cox 回歸分析。采用“glmnet” R 軟件包行Lasso分析，通過十折交叉驗證獲得最佳的調優參數λ。利用Lasso 回歸選中的lncRNA 行多因素逐步Cox 回歸分析，基于赤池信息準則（Akaike information criterion，AIC）挑選最佳預后模型[18]。預后風險評分的計算公式：

1.4 預后模型的評估

根據預后風險評分的中位數，將ccRCC 患者分成高、低風險組。繪制K-M 曲線評估高、低風險組的生存差異；受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估風險模型預后效能；Wilcoxon秩和檢驗探索預后風險評分與臨床病理變量之間的關系；單因素和多因素Cox 回歸分析評估風險模型的獨立預后性能。通過“DynNom”和“shiny” R 包進行在線工具的開發。

1.5 預后模型與免疫微環境的關系

使用“GSVA” R 軟件包進行單樣本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis，ss-GSEA），探索高、低風險組免疫浸潤微環境及經典免疫檢查點之間的差異。

1.6 統計學方法

所有分析均基于Rstudio 軟件（4.1.2）執行。計數資料用例數或百分率表示，兩組間比較采用χ2檢驗；等級資料采用Wilcoxon 秩和檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗；差異表達的CR 與lncRNA 的相關性采用Spearman 相關性分析；生存率的比較采用log-rank χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CR 和lncRNA 的差異表達鑒定

差異分析顯示，41 個CR 和1 512 個lncRNA 的表達水平具有顯著差異（|log2FC|＞2，FDR＜0.05）；其中包括26 個CR 上調，15 個CR 下調；1 167 個lnc RNA上調，345 個lncRNA 下調，見圖1A～B。前30 個差異表達的CR 和lncRNA 的表達情況通過熱圖呈現，見圖1C～D。此外，通過Spearman 相關性分析確定了1 025 個與CR 相關的lncRNA（|rs|＞0.3，P＜0.05）。

圖1 ccRCC 和癌旁正常組織間差異表達的CR 及lncRNA

2.2 構建與CR 相關的lncRNA 的預后模型

訓練集和驗證集一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。單因素Cox 回歸分析得到234個預后相關的lncRNA（P＜0.001）。Lasso 回歸最佳參數λ 的區間見圖2A；基于最小平均誤差λ，選中了14 個候選lncRNA，見圖2B；多因素逐步Cox回歸最終得到7 個lncRNA 構建預后模型，見表2；圖2C 表明CR 與lncRNA 之間的潛在作用關系；此外，除了AC026462.3 是保護因子外，其余lncRNA 均為ccRCC 的風險因子，見圖2D。

表1 訓練集和驗證集一般資料比較[例（%）]

表2 多因素Cox 分析結果

圖2 預后模型的構建

2.3 風險評分模型的評估

根據風險評分公式：風險評分=0.495×DUXAP8-1.106×AC026462.3+0.890×LINC01460+1.530×AL 592494.1+0.603×AL353804.2+0.929×AC012462.1+1.594×AC009518.1。根據風險評分中位數0.907 將樣本分為高、低風險組。訓練集和驗證集的風險評分、生存狀態和模型lncRNA 的表達情況分別如圖3A～F 所示。生存分析結果表明，高風險組患者的預后在訓練集（log-rank χ2=50.6，P＜0.001）和驗證集（log-rank χ2=7.3，P=0.014）中均低于低風險組，見圖3G～H。ROC 曲線顯示，在訓練集中，1、3、5 年生存率的曲線下面積（area underthecurve，AUC）＞0.8，同時在驗證集中AUC＞0.75，見圖3I～J。

圖3 預后模型的評估

2.4 預后模型與臨床病理特征的關系及獨立預后分析

箱線圖結果表明，不同臨床分級、臨床分期患者預后風險評分比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；不同年齡、性別患者預后風險評分比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4。單因素和多因素Cox 回歸分析中，風險評分的HR 值分別為4.058（95%CI：2.530～6.508，P＜0.001）和3.096（95%CI：1.887～5.080，P＜0.001），見圖5A～B。列線圖見圖5C，校準曲線顯示，1、3、5 年的擬合曲線接近回歸線，見圖5D。ROC 曲線顯示，風險評分的AUC 達到了0.856，高于其他臨床病理指標，見圖5E。在線工具網站為：https：//xzlmodelshiny.shinyapps.io/DynNomapp/，在此工具上輸入模型lncRNA 的基因表達量可以實時預測ccRCC 患者的預后生存率，輔助臨床決策。

圖4 預后模型與臨床病理特征的關系

圖5 獨立預后分析

2.5 預后模型與免疫微環境的關系

ssGSEA 結果表明，在高風險組患者中，MDSC 和Tregs 細胞等免疫抑制細胞的浸潤比例高于低風險組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖6A；此外，高風險組中趨化因子、免疫檢查點及副炎癥等通路的富集水平高于低風險組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖6B；高風險組中，TNFRSF25、TNFSF14、CD80、CD276等免疫檢查點的表達高于低風險組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖6C；風險評分與免疫檢查點TNFRSF25 和TNFSF14 呈正相關（rs＞0.3，P＜0.05），見圖6D。

圖6 免疫微環境分析

3 討論

近年來，研究報道CR 在調節腫瘤表觀遺傳學中具有不可替代的作用[19]。研究人員對這些因子進行了廣泛研究，發現他們與腫瘤發生、發展及預后和藥物耐藥性密切相關[20-22]。例如，PBRM1 突變可以改變轉移性RCC 的表觀遺傳和轉錄調控，從而導致對拉帕霉素的耐藥性[20]。在某些腫瘤中，染色質調節因子可以預測預后和指導治療[23-24]。但CR 相關的lncRNA 與ccRCC 預后和治療的關系尚未得到充分的研究。

本研究基于差異分析、相關性分析、單因素Cox、Lasso 及多因素逐步Cox 分析，最終篩選出7 個CR相關lncRNA（DUXAP8、AC026462.3、LINC01460、AL592494.1、AL353804.2、AC012462.1、AC009518.1）構建預后模型。生存分析、ROC 曲線、單因素和多因素Cox 回歸分析結果表明，預后模型風險評分可以獨立有效地預測ccRCC 患者的預后，并且與臨床分級、分期密切相關。在線工具的開發可以更好地輔助臨床決策。值得注意的是，高風險組MDSC 和Tregs 等免疫抑制細胞的浸潤程度明顯高于低風險組。Tregs 和MDSC 不僅可通過多種機制抑制抗腫瘤免疫反應導致腫瘤免疫逃逸和進展，還與腫瘤血管生成、耐藥和轉移密切相關[25-28]。這可能會部分解釋高風險組患者預后較差，且可能對免疫治療反應更好的原因。此外，風險評分與TNFRSF25 和TNFSF14 呈正相關。然而，本研究具有一定局限性，本研究建立在回顧性分析的基礎上，后期仍需要進一步的實驗及多中心前瞻性研究來進一步驗證。此外，模型中lncRNA 的具體作用機制也有待進一步深入研究。

綜上所述，本研究基于TCGA 數據庫成功構建了包含7 個CR 相關的lncRNA 的預后模型。此模型是一種非常有潛力的預后生物標志物，可以獨立、有效地預測ccRCC 患者的預后，并且在線工具的開發，有助于輔助臨床決策從而改善ccRCC 患者的預后管理。其次，預后模型與免疫微環境及免疫治療密切相關，為CR 相關lncRNA 在ccRCC 中的研究以及探索新的免疫治療靶點提供了新的見解。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。