基于網絡藥理學和分子對接顛倒瀉心湯治療慢性萎縮性胃炎的作用機制

劉 姣 劉卿輝 游運舸

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis, CAG）是由于胃黏膜上皮反復遭受炎癥或其他刺激導致胃腺萎縮，黏膜層變薄，腺體數目減少，歸屬于胃癌前狀態[1]。胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，延緩或逆轉Correa 模式（萎縮性胃炎-腸化生-異型增生-胃癌）[2]是預防胃癌發生發展的重要措施。有研究發現，CAG 患者胃黏膜的血流灌注量相對淺表性胃炎患者更低，提示胃黏膜腺體萎縮可能與胃內血流灌注低相關[3]，胃黏膜胃鏡下表現是胃腑氣血是否充盛的直接體現，CAG 胃鏡下可見黏膜皺襞變平，血管顯露，胃黏膜紅白相間，以白為主，伴有結節狀或顆粒樣表現[4]。“胃黏膜以白為主”是脾胃虛弱、胃絡失養之象，為CAG 中醫病理基礎；“結節狀或顆粒樣改變”可歸屬為“胃內癥瘕”。有學者提出胃癌前病變即微癥瘕，微者小也，此微癥瘕為極小癥瘕，非肉眼所能見也[5]。

CAG 常呈虛實夾雜、本虛標實之象，以脾胃虛弱為本，氣滯痰凝血瘀為標。血瘀是CAG 久病的主要病機[6]，在胃黏膜萎縮演化成胃癌的過程中起著重要作用。在CAG“升降失司、氣血失和”的中醫病機基礎上，再靈活運用“微癥瘕”理論，將半夏瀉心湯與顛倒木金散聯合起來，組成顛倒瀉心湯治療CAG。本研究基于網絡藥理學和分子對接就顛倒瀉心湯治療CAG 的作用機制進行分析?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 顛倒瀉心湯藥物活性成分及作用靶點的篩選

分別對顛倒瀉心湯中的黨參、大棗、甘草、法半夏、黃芩、黃連、干姜、木香、郁金、莪術10 種藥物使用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）進行檢索，設置OB≥30%，DL≥0.18，獲得有效成分后通過其MOL.ID 號搜尋單味藥成分作用靶點。利用uniprot（http://www.uniprot.org/）數據庫下載化合物數據表格，匹配靶點基因名。最后將化學成分的相關靶點蛋白利用Uniprot 數據庫，對其進行注釋。篩選掉沒有靶點的無效成分。

1.2 篩選疾病相關靶點和顛倒瀉心湯治療CAG 的潛在靶點

在GeneCards、OMIM 數據庫中輸入關鍵詞“Chronic Atrophic Gastritis”，查找CAG 疾病相關靶點，剔除重復基因，合并后即為本研究的疾病靶點。運用Venny 2.1 在線繪圖工具將“1.1”和“1.2”獲取的基因取交集后，最終獲得顛倒瀉心湯治療CAG的潛在靶點。

1.3 中藥成分-靶點-疾病網絡圖的構建

將交集靶點、藥物成分數據導入Cytoscape 3.9.0作圖軟件，進行網絡拓撲學分析，根據基因的連接數量（Degree 值）調整靶點圖形、顏色、透明度和大小，構造“成分-靶點-疾病”網絡圖。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建

將潛在靶點導入String 平臺，獲取蛋白質相互作用關系。將結果導入Cytoscape3.9.0 軟件中，選擇“network Analyzer”，得到網絡拓撲學參數。然后把下載好的TSV 文件導入cytoscape 軟件做PPI 圖，其中節點越大、顏色越紅代表Degree 值越大，根據Degree 值篩選出排名前10 的核心靶點。

1.5 基因本體（gene ontology, GO）生物過程和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）通路富集分析

利用Bioconductor 在R 軟件內安裝運行Pathview、clusterProfiler 和Stringin 程序包，對其進行生物學過程的GO、KEGG 通路富集分析，得到的數據中，pvalue 值越大表示富集程度越大，選取排名前10 的GO 值、排名前15 及與疾病相關的KEGG 值繪制條形圖。

1.6 分子對接

將拓撲學參數排名靠前的大分子和小分子進行分子對接。蛋白質晶體結構由 alphafold 數據庫（https://alphafold.ebi.ac.uk/）獲取。對接小分子庫由搜索TCMSP 數據庫（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中的中藥獲取并建立。運用Autodock 程序完成分子對接后，將結果導入pymol 進行可視化。

2 結果

2.1 顛倒瀉心湯藥物活性成分及靶點的篩選

共篩選得到234 種藥物成分，刪除70 種無對應靶點蛋白的化合物，將12 種多藥物共有成分去重整合后，得到141 種藥物活性成分。在TCMSP 數據庫對141 種藥物有效成分MOL.ID 進行搜索，共獲得2 262 個藥物作用的靶點蛋白，經過去重處理后，剩余236 個。利用Uniprot 數據庫匹配236 個靶點蛋白對應基因名。

2.2 篩選疾病相關靶點和顛倒瀉心湯治療CAG 的潛在靶點

從Genecards 數據庫、OMIM 數據庫查找篩選CAG 疾病靶點，去重整合后，最后得到933 個疾病靶點，與236 個藥物作用靶點進行韋恩分析，最終得到101 個交集靶點（圖1），作為顛倒瀉心湯治療CAG 的潛在關鍵靶點。

圖1 “中藥靶標基因-疾病基因”韋恩圖

2.3 成分-靶點-疾病網絡的構建

為了進一步探索顛倒瀉心湯治療CAG 的作用機制，將101 個潛在關鍵靶點與236 個藥物作用的靶點蛋白比對，去除無對應的藥物成分，最終獲得16 種藥物活性成分，將其與101 個交集靶點的數據導入Cytoscape 3.9.0 軟件，構建成分-靶點-疾病網絡圖（圖2），圖中不規則四邊形節點代表疾病名稱、菱形節點代表藥物靶點及疾病交集靶點、正六邊形節點代表藥物活性成分。選擇Analyze network 選項分析網絡中的節點，最終得到各節點的度值。藥物活性成分對應的交集靶點越多度值越高，按照度值高低選擇排名前5 的藥物活性成分作為顛倒瀉心湯治療CAG 的核心成分（圖3）。

圖2 成分-靶點-疾病網絡

圖3 核心成分

2.4 PPI 網絡的構建

通過String 平臺獲取蛋白質相互作用關系，導入Cytoscape 3.9.0 作圖軟件進行PPI 網絡構建（圖4），該圖共有96 個節點和456 條邊。節點越大、顏色越紅代表Degree 值越大。根據Degree 值篩選出前10的核心靶點（圖5）。

圖4 PPI 網絡

圖5 核心靶點

2.5 GO 功能富集分析

GO 富集分析共獲得4 530 條，其中生物過程（BP）3 915 條、細胞組成（CC）251 條、分子功能（MF）364 條，根據富集的基因數量各取排名前10的條目進行可視化，圖中條形長度代表富集的基因數量。見圖6。

圖6 GO 富集結果

2.6 KEGG 通路富集分析

共獲得符合篩選標準的條目232 條，按照P值進行排序，選取基因數前15 的條目及與CAG 密切關聯的MAPK、JAK-STAT、胃癌、PI3K-Akt 及幽門螺桿菌感染中的信號通路進行可視化，圖中條形的長度代表相應條目所富集基因數量（圖7）。涉及通路包括脂質和動脈粥樣硬化、IL-17 信號通路、TNF信號通路、肝細胞癌、胰腺癌、肝炎等。

圖7 KEGG 通路富集結果

2.7 分子對接

從“圖3”中選取前3 的核心成分槲皮素（Quercetin）、黃芩素（baicalein）和β-胡蘿卜素（beta-carotene），從“圖5”中選擇度值排名前3 的靶蛋白STAT3、JUN 和AKT1，將其分別進行結合能力預測（表1），形成的對接模型的結合能均小于-5 kcal/mol，說明結合活性較好。

表1 關鍵靶點與成分對接結果

3 討論

CAG 屬于中醫學“胃痞”，中焦虛弱，外邪漸深，由氣入血，直至胃絡，最終形成“胃內癥瘕”。胃絡失養，胃腺萎縮，胃黏膜變薄，日久成萎。其中，胃絡瘀阻是本病的關鍵病理環節。若病理提示腸化生或異型增生，則更應重視，其性乖戾，久稽于胃，若不積極治療，可惡變成癌。

CAG 的臨床治療目標應在改善患者臨床癥狀的基礎上，盡量延緩或阻滯“炎-癌”轉化進程[7]。顛倒瀉心湯中郁金辛苦，辛能散能行，苦能燥能泄，且又入血分，能行氣解郁，活血止痛，以化瘀為主；木香味辛性溫，辛散溫通，主入氣分，行氣止痛，調中導滯，以理氣為要，二藥相須配伍，疏肝行氣、活血通絡，臨床常用于治療氣滯血瘀之證。黨參、甘草、大棗甘溫益氣，以補脾虛。中虛失運，升降失調，又以半夏散結除痞、和胃降逆，黃芩、黃連泄熱開痞，干姜溫中散寒。此四藥相伍，具有寒熱平調、辛開苦降之效。莪術消積止痛、破血消癥，現代藥理學表明，莪術的主要物質基礎“莪術油”具有廣泛的抗腫瘤作用[8]，可有效防治癌前病變、腸上皮化生及非典型增生。

藥效成分方面，槲皮素可以促進黏膜愈合，發揮抗炎、抗氧化效用，是一種潛在的抗胃黏膜炎癥的生物活性物質[9]；喻春紅等[10]的研究表明采用槲皮素治療后大鼠胃黏膜炎癥顯著減輕，胃黏膜病理明顯轉歸，可對CAG“炎-癌”轉化產生防治作用。黃芩素不僅具有抗氧化、抗菌、抗炎和抗腫瘤等功效[11]，還能通過抑制細菌繁殖和減弱細菌致病力發揮抗幽門螺桿菌的作用[12]。黃芩素也能通過抑制炎癥因子的釋放從而阻斷其對胃黏膜的損傷[13]。段雲霄等[14]的研究表明，黃芩素能顯著抑制胃癌HGC-27 細胞增殖，其作用隨時間和濃度依賴性增加。β-胡蘿卜素可以有效改善CAG 的臨床癥狀，并逆轉“炎-癌”轉化進程[15]。已有研究[16]證實β-胡蘿卜素可以通過調控STAT3 等多條信號通路發揮抗腫瘤作用。

治療靶點方面，STAT3 是一種轉錄因子，也是JAK/STAT 信號通路的最終蛋白，其可進入核內發揮促轉錄的作用，研究已證實STAT3 的過表達可以促進胃癌細胞的轉移[17]。進一步的細胞生物學行為的研究結果表明STAT3 能夠促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲[18]。崔姍姍[19]在研究中發現半夏、黃芩、黃連及干姜均能通過抑制STAT3 轉錄因子下游基因的表達，從而誘導胃癌細胞SGC-7901 凋亡。多項動物實驗[20-21]均證實了抑制STAT3 信號通路及以其介導的IL-1β 和TNF-α 促炎因子表達，可使胃內炎癥微環境得到改善，加快細胞凋亡，最終達到治療CAG的目的。駱梅[22]在研究中證實了JUN 能與DKK1啟動子結合，促進DKK1 啟動子的活性，激活DKK1-PI3K/AKT/mTOR 信號通路從而促進胃癌細胞的增殖和侵襲。AKT1 可通過調控PI3K/Akt 等多條信號通路誘導胃癌細胞凋亡[23]。李樹靜等[24]以WNT/β-Catenin 信號通路為切入點，從細胞水平證實了AKT1 可能通過調節MMP-9 蛋白的表達，促進胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移。

結合“成分-靶點-疾病”網絡圖分析結果可知，顛倒瀉心湯可作用于FOS、IL6、TP53、MAPK1、TNF、MAPK3 及MAPK14 等多靶點，其中TP53 不僅是CAG 的關鍵靶標，也是腸化生、不典型增生的監測指標[25]。MAPK3 過度表達及活化可以使下游STAT3 水平升高，從而誘導胃癌細胞的增殖、轉移和侵襲[26]。TNF-α 和IL6 等炎癥因子過表達會損傷胃黏膜，且表達程度與損傷程度成正比，可影響CAG的發展與轉歸[27-28]。

顛倒瀉心湯作用于CAG的癌癥通路有P53、TNF及胃癌通路等；炎癥通路有IL-17 信號通路、NF-κB、EGFR 及幽門螺桿菌感染中的上皮細胞信號傳導通路等；與代謝相關的通路有脂質和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE 信號通路等；與CAG 密切相關的有JAK-STAT 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK信號通路等。PI3K-Akt 信號通路可以調控細胞增殖，積極參與腫瘤的轉移和擴散。抑制PI3K/AKT 信號通路介導的細胞擴散能延緩“炎-癌”轉化并減少胃癌細胞的增殖和分化[29]。MAPK 信號通路可以調控多種細胞的增殖與凋亡[30]。通過降低胃黏膜中MAPK水平，促進CAG 細胞凋亡，起到治療CAG 的作用。眾多研究發現CAG 的發病與炎癥因子密切相關[31-33]，JAK-STAT 信號通路可以促進IL-6 和TNF-α 等炎癥因子的釋放，導致胃黏膜受損[34]。

綜上所述，顛倒瀉心湯可能通過調節細胞增殖與凋亡、免疫炎癥反應、脂質代謝、致癌因子等多途徑治療CAG。脂質和動脈粥樣硬化信號通路是KEGG 通路富集分析結果中基因數量最多的通路，這與上文提到的CAG“微癥瘕”理論相符，或許可為CAG 下一步研究提供新思路。