基于SNP芯片分析徽縣青泥黑豬遺傳多樣性和遺傳結構

宋科林,閆尊強,王鵬飛,程文昊,李 杰,白雅琴,孫國虎,滾雙寶,2*

(1.甘肅農業大學動物科學技術學院,蘭州 730070;2.甘肅省現代養豬工程技術研究中心,蘭州 730070;3.甘肅省畜牧技術推廣總站,蘭州 730030)

畜禽遺傳資源是畜牧業的“芯片”,也是培育畜禽優良品種的基礎,作為國家重要的戰略資源,具有不可再生性[1]。我國是生豬養殖大國,生豬出欄量和存欄量均居于世界領先地位,也擁有非常豐富的豬種資源,現有豬品種共102個,其中本地品種83個、培育品種13個、引入品種6個,本地品種占總品種的81.37%[2]。根據地理環境和氣候條件的不同,我國地方豬可分為6大類,包括華北型、華南型、華中型、西南型、高原型和江海型,這些豬種具有肉質好、抗病力強等優良特性[3]。隨著市場經濟的發展,生長周期長的地方豬種難以滿足養殖戶的需求,很多優良地方豬種被國外豬種雜交,導致我國部分地方豬品種血緣混雜、遺傳多樣性降低。因此,加強畜禽遺傳資源的保護,對未來我國畜牧業的可持續發展、促進畜牧業轉型升級和打贏種業翻身仗具有重要意義。

在第三次全國畜禽遺傳資源普查時,甘肅省發現了徽縣青泥黑豬群體,其原產地為甘肅省隴南市徽縣,主要生長在當地青泥嶺附近的山林、荒坡中,喜歡在青泥中覓食、打滾,當地人將其稱為“青泥黑豬”。過去由于信息閉塞,散養在大山深處的青泥黑豬無人問津。近年來,當地政府依托青泥黑豬這一產業,組建了青泥黑豬生態養殖專業合作社,有力提升了青泥黑豬的知名度,青泥黑豬的養殖規模不斷擴大。該豬種體型外貌有別于其他地方豬種,具有繁殖性能高、肉質口感佳等特點,很可能是新遺傳資源。為了進一步挖掘和豐富我國豬遺傳資源,有必要對其進行基因組鑒定。

隨著生物技術的不斷發展,很多分子技術,如線粒體DNA標記[4-5]、微衛星標記[6-7]、簡化基因組測序[8-10]、全基因組重測序[11-12]等被廣泛應用于生物遺傳多樣性評判及新品種鑒定。單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)是DNA序列中某個位點上單個核苷酸發生變異引起DNA序列多態性,包括轉換、顛換、插入和缺失。SNP作為第三代分子標記,具有遺傳穩定性高、多態性位點豐富、易實現自動化檢測等特點[13],將數百萬個DNA標記序列排列并固定在特殊硅片上,形成的SNP探針微陣列就是SNP芯片[14]。SNP芯片已廣泛應用于畜禽種質特性、遺傳多樣性和新品種鑒定等方面研究。王小鵬等[15]使用60K SNP芯片對35個中外地方豬種共986個個體進行掃描,篩選出了萊蕪豬品種特異位點,并結合PCA分析和進化樹分析相互驗證,品種鑒別準確率達到100%。劉晨曦等[16]對45個歐亞豬種1 228頭豬的芯片數據進行遺傳距離、鄰接系統發育樹及遺傳分化系數等分析,證實了紅燈籠豬的品種獨立性。Ma等[17]利用高密度SNP芯片揭示了華西牛獨特的遺傳特征和系統發育關系,為其重要經濟性狀的遺傳機制解析提供了依據。Diao等[18]基于SNP芯片數據研究了我國南方地區豬的遺傳多樣性、種群結構和連鎖不平衡程度(LD),發現部分地方豬的遺傳多樣性喪失,且存在西方商品豬的滲入。目前,關于徽縣青泥黑豬遺傳結構及遺傳多樣性的研究鮮有報道,因此,本研究利用“中芯一號”50K SNP芯片對3個不同豬種68頭豬進行全基因組范圍內SNP檢測,進一步了解徽縣青泥黑豬遺傳資源特性,為其作為新資源申報、保護和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用甘肅已知地方豬種(八眉豬、合作豬各20頭)和待鑒定新豬種(徽縣青泥黑豬28頭)共計68頭豬,各群體數目及樣本信息來源見表1。用剪耳鉗沿耳朵下邊緣剪取約0.5 g耳組織,置于2 mL凍存管中,帶回實驗室-20 ℃保存。

表1 3個豬種數目及樣本信息來源

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取與質量檢測 按照康為世紀的CWE9600 Blood Spots DNA Kit試劑盒說明書提取基因組DNA,NanoDrop 2000和Qubit 2.0測定DNA純度和濃度,0.8%瓊脂糖凝膠電泳(170 V,25 min)檢測DNA完整性。

1.2.2 SNP分型與數據質控 質檢合格的DNA樣品使用“中芯一號”50K SNP芯片(康普森農業科技有限公司,北京)進行SNP分型,利用Plink(v1.90)軟件進行數據質控[19],質控標準為:常染色體上SNP檢出率(call rate)大于等于90%、個體檢出率大于等于90%、MAF大于等于0.01。

1.2.3 群體遺傳多樣性分析 采用Plink(v1.90)軟件計算期望雜合度(He)、觀察雜合度(Ho)、多態標記比例(PN),VCFtools(v0.1.17)軟件計算核苷酸多樣性(Pi),SNeP(v1.1)軟件[20]計算有效群體含量(Ne),PopLDdecay(v1.90)計算連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD)情況,通常用r2表示連鎖不平衡程度。

1.2.4 群體遺傳結構分析 利用GCTA(v1.94)軟件進行主成分分析(principle component analysis,PCA)[21],基于IBS遺傳距離,利用Mega X(v10.0)軟件[22]構建進化樹,利用Admixture(v1.3)軟件分析群體結構。

1.2.5 群體分化指數分析Fst用于衡量種群分化程度[23],Fst取值范圍在0～1之間,當Fst取值為1時,表示兩個群體完全隔離,完全分化;取值為0時,群體間隨機交配,沒有分化。本研究使用VCFtools(v0.1.17)軟件進行Fst分析。

1.2.6 親緣關系分析 利用Plink(v1.90)軟件計算徽縣青泥黑豬IBS遺傳距離,并構建狀態同源(identity by state,IBS)矩陣,分析徽縣青泥黑豬個體之間的遺傳距離;利用Gmatrix(v2)軟件構建G矩陣[24],分析徽縣青泥黑豬個體間的親緣關系,并使用R語言對分析結果進行可視化。

2 結 果

2.1 基因組DNA提取與檢測

對所有組織樣品進行DNA提取,經紫外分光光度計(Nanodrop2000)檢測其OD260 nm/OD280 nm值在1.7～2.1之間,表明提取的DNA純度較高,0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性,結果顯示DNA條帶清晰,無拖尾現象(圖1),表明提取的DNA完整性較好,可用于后續試驗。

M. DNA相對分子質量標準;1～10. 基因組DNA樣品M. The DNA reference marker;1-10. The genomic DNA samples

2.2 SNP位點的質控

共檢測到55 156個SNPs標記分型結果,MAF<0.01的標記有811,SNP檢出率<0.90的標記有808個,X染色體上的標記有4 252個,插入/缺失標記6個,通過質控的標記為49 279個(表2)。根據SNP在染色體上的分布,繪制SNPs在染色體上的分布圖(圖2)。

圖2 SNPs在染色體上的分布圖Fig.2 Distribution of SNPs on chromosomes

表2 SNP質量控制統計結果

2.3 群體遺傳多樣性分析

3個品種的觀察雜合度(Ho)均高于期望雜合度,且HX群體的觀察雜合度和期望雜合度最高,分別為0.386 4、0.370 7,HZ群體的觀察雜合度和期望雜合度最低,分別為0.352 4、0.324 0;同樣,HX群體的有效群體含量、多態標記比例和核苷酸多樣性均高于HZ和BM群體,分別為2.2、0.915 7、0.378 6(表3)。

表3 3個豬種的遺傳多樣性指標

LD分析表明,3個品種的LD系數r2隨著位點距離的增加均降低,LD系數(r2)由高到低依次為BM、HZ、HX,衰減速度由快到慢依次為HX、HZ、BM(圖3)。

圖3 LD衰減圖Fig.3 LD decay

2.4 群體遺傳結構分析

PCA分析顯示,PC1、PC2的貢獻率分別為12.83%和6.83%,3個群體分別聚類,HX群體相對聚集,根據PC1(PC1>0)可將HX群體和HZ、BM群體區分開(圖4)。進化樹分析結果發現,HX群體獨自聚為一支,BM群體和HZ群體同屬于另一大分支,隨后BM和HZ分離出來(圖5)。根據研究群體,取多個K值,一般CV值越小所對應的K值越佳,以此確定最佳分群數,K=3為最優分群數(圖6)。由群體結構可知,K=2時,可將HZ群體與HX、BM區分開,3個群體含有共同血緣,K=3時,可分為3個亞群,與分析群體數量一致,HX開始顯現出與HZ、BM不同的進化路線,但HX包含多種祖先成分,K= 4時,3個群體也能很好的進行區分,但血統都更加復雜(圖7)。

圖4 3個豬種的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of 3 pig breeds

圖5 3個豬種的進化樹Fig.5 Evolutionary tree of 3 pig breeds

圖6 交叉驗證錯誤率Fig.6 Cross validation error rate

每一列表示一個個體,不同顏色片段的長度表示該個體基因組中某個祖先所占的比例,橫坐標代表群體名稱Each column represents an individual, where the length of the different colored segments indicate the proportion of a particular ancestor in that individual’s genome, and the horizontal coordinates represent the name of population

2.5 群體分化指數分析

為了量化HX群體和BM、HZ群體之間的遺傳關系,計算了3個群體之間的分化指數(Fst),HX群體與BM群體的分化指數為0.123 6,與HZ群體的分化指數為0.159 8,BM與HZ群體的分化指數為0.134 5,表明HX和BM、HZ之間存在一定程度的遺傳分化(表4)。

表4 3個豬種之間的分化指數

2.6 徽縣青泥黑豬IBS距離矩陣分析

HX的平均IBS遺傳距離為0.294 8±0.001 1,表明HX個體間存在較遠的遺傳距離。IBS矩陣分析顯示,大部分HX個體間遺傳距離較遠,親緣關系亦較遠,少數個體之間遺傳距離較近,親緣關系亦較近,表明HX群體內部存在近交風險(圖8)。

IBS距離矩陣中每一個小方格代表第一個到最后一個樣本兩兩之間的遺傳距離值,該值越大越接近紫色,即兩個個體的遺傳距離越大,反之亦然Each small square in IBS distance matrix represents the value of genetic distance between two pairs from the first sample to the last sample, the larger the value, the closer it is to purple, that is, the larger the genetic distance between two individuals, and vice versa

2.7 徽縣青泥黑豬G矩陣分析

HX群體基因組親緣關系系數為0.036 1±0.009 5,G矩陣分析結果顯示,HX大部分個體之間親緣關系較遠,少數個體親緣關系較近(圖9),與IBS距離矩陣分析結果一致,表明HX群體有近交趨勢,需強化保種措施,避免近交衰退。

G矩陣結果中,每一個小方格代表第一個到最后一個樣本兩兩之間的親緣關系值,該值越大越接近紫色,即兩個體親緣關系越近In the G matrix results, each small square represents the value of the relationship between two pairs from the first sample to the last sample, the larger the value, the closer it is to purple, that is, the closer relationship between two individuals

3 討 論

遺傳多樣性是地球上生物所攜帶的全部遺傳信息的總合,包括種內群體間和群體內個體間的遺傳變異,生物體遺傳多樣性越高,遺傳變異越豐富,對環境適應力就越強,不容易遭受滅絕[25-26]。畜禽遺傳多樣性與人類生產生活緊密相關,保護畜禽遺傳多樣性就是保護人類所擁有的全部可遺傳變異材料,有助于人類挖掘畜禽優良基因,實現畜牧業可持續發展,加速人類文明進展,促進國家經濟發展[27]。Jiang等[28]利用27個微衛星標記研究了萊蕪豬的遺傳多樣性,發現萊蕪豬的遺傳多樣性非常低,表明萊蕪豬品種存在一定程度的近交。Leng等[29]基于“中芯一號”芯片分析了榮昌豬群體特征,發現榮昌豬遺傳多樣性較低。觀察雜合度是指群體內某一位點是雜合子的個體數占總個體數的比率,期望雜合度指的是群體內任一個體的任一位點發生雜合的概率[30]。本研究發現,HX的平均觀察雜合度為0.386 4,高于HZ(0.352 4)和BM(0.370 7),也高于其他一些地方豬種如盆周山地豬(0.294 7)[31]、杭豬(0.359 0)[32]、藍塘豬(0.351 0)[18]、梅花豬(0.360 0)[18]、里岔黑豬(0.351 2)[33]等,HX的平均期望雜合度為0.370 7,高于HZ(0.324 0)和BM(0.356 8),也高于青峪豬(0.329 3)[34]、撒壩豬(0.263 0)[35],但低于梅山豬(0.382 0)[36]、米豬(0.382 0)[37]、金華豬(0.570 0)[37]等地方豬種,且HX的觀察雜合度高于期望雜合度,說明HX群體可能引入了其他品種的血緣,導致品種不純。有效群體含量是指與實際群體具有相同的基因頻率方差或相同雜合度衰減的理想群體含量[20]。本研究發現,3個豬種中,HX的有效群體含量最高,為2.2,低于里岔黑豬(8.7)[33]、青峪豬(12)[34]、通城豬(102)[38],可能是HX群體保種規模有限,且群體內發生了近交而導致有效群體含量降低。多態標記比例是指群體中表現為多態的位點所占的比例,核苷酸多樣性是指兩個序列間每個位點上核苷酸差異的平均值,兩者都能反映群體多態性水平。本研究發現,HX群體多態標記比例為0.915 7,高于HZ(0.816 5)、BM(0.846 7),也高于伍隍豬(0.641 9)[39]、里岔黑豬(0.827 0)[33]、丫杈豬(0.875 0)[40]和榮昌豬(0.515 0)[29],表明HX群體中有91.57%的位點具有多態性。HX群體的核苷酸多樣性為0.378 6,高于合作豬(0.332 3)、八眉豬(0.367 0),表明HX群體具有更高的多態性水平。以上分析均表明HX遺傳多樣性高于HZ和BM群體。LD描述了不同基因座上等位基因的非隨機線性關聯,且這種關聯是由遷移、選擇及遺傳漂變產生[41]。LD分析可以揭示不同群體在進化過程中受到選擇的強度及遺傳物質多態性的高低,提供種群進化信息[37],在LD分析中,LD衰減越慢,受選擇強度越大,可推斷各種群的受選擇強度的差異。本研究發現,3個豬種中BM和HX群體的LD系數較高,HX衰減速度最快,由此推斷該群體受選擇程度較弱,BM衰減速度最慢,推斷該群體受選擇程度較強。

研究品種之間的遺傳距離和遺傳結構對于了解豬種的形成和分類有重要意義[37]。Li等[42]利用26個微衛星標記,對10個中國地方豬種和3個引進豬種的遺傳多樣性和親緣關系進行分析,發現中國地方豬種的遺傳多樣性高于引進豬種,10個地方豬種群聚類與地理分布基本一致。黃樹文等[43]研究了廣東省5個地方豬種遺傳距離和遺傳結構,發現地方豬種與亞洲野豬遺傳距離較近,與西方豬種遺傳距離較遠,梅花豬和粵東黑豬均混入了西方豬種的血液。本研究中,PCA和進化樹分析發現HX群體相對聚集,與HZ群體遺傳距離較遠,且HX群體獨自聚為一支,BM和HZ屬于同一分支,后逐漸分離。群體結構分析顯示,當K=3時,HX群體顯現出與HZ、BM群體不同的進化路線,但HX群體中有多個祖先成分,可能是祖先本身多態性或者近期發生了雜交導入了其他祖先基因所造成。因此,要對血緣純正的HX群體加強保種,防止其血緣更為混雜。群體分化指數的解釋標準為:0～0.05很小分化程度;0.05～0.15中等程度分化;0.15～0.25高度分化;高于0.25極度分化[44]。本研究發現,HX群體與HZ群體之間分化指數為0.159 8,HX群體與BM群體之間分化指數為0.123 6,HZ與BM群體之間的分化指數為0.134 5,表明3個豬種之間均存在一定程度的遺傳分化。

當前,我國地方豬種保種多采用閉鎖繁育的方式,導致群體的遺傳結構和親緣關系容易受到選擇的影響。因此,了解保種群的親緣關系對于群體的保種顯得至關重要[45]。本研究計算了HX群體基因組親緣關系系數為0.036 1±0.009 5,G矩陣可視化,表明HX群體中大部分個體之間親緣關系較遠,少數個體之間親緣關系較近。同時本研究計算了HX群體遺傳距離為0.295 0±0.001 1,低于劉彬等[34]報道的青峪豬(0.260 4±0.025 2)、劉晨龍等[32]報道的杭豬(0.178 3±0.025 5)、Liu等[46]報道的涼山豬(0.282 3±0.025 9),表明HX群體內遺傳距離相對較遠?；谶z傳距離構建IBS距離矩陣,IBS距離矩陣顯示HX群體中大部分個體之間遺傳距離較遠,少數個體較近。G矩陣和IBS距離矩陣都表明,HX群體中部分個體之間親緣關系較近,推測群體內可能存在一定程度的近交,需要加強保種,避免近交衰退。以上分析均揭示了HX群體獨特的遺傳背景,為其作為新品種資源的申報提供了理論依據。

4 結 論

本研究基于“中芯一號”50K SNP芯片數據,分析了徽縣青泥黑豬的遺傳多樣性及遺傳結構,發現徽縣青泥黑豬遺傳多樣性高于合作豬和八眉豬,與八眉豬、合作豬群體相對獨立,存在一定程度的遺傳分化,證實徽縣青泥黑豬很可能是一個甘肅地方新豬種。徽縣青泥黑豬部分個體間存在近交,需要加強保種,避免近交衰退。本研究為進一步挖掘徽縣青泥黑豬新遺傳資源和合理保種開發利用提供了理論依據。