山羊皮膚組織miRNA測序與miR-129-5p調控黑色素生成的功能研究

肖 敏,趙 威,孫 武,2,娜日蘇,3,趙 樂,劉陶祿,張繼攀*,趙永聚*

(1.西南大學動物科學技術學院,草食動物科學重慶市重點實驗室,重慶市牧草與草食家畜重點實驗室,重慶400715;2.青海大學畜牧獸醫科學院,西寧 810016;3.內蒙古農業大學動物科學學院,呼和浩特 010018)

動物皮毛顏色是畜牧生產中的重要性狀,更是育種工作中品種鑒定、品系劃定的關鍵依據[1-2],因此探究動物毛色形成機制意義重大。本質上,動物膚色和毛色與皮膚中黑色素細胞(melanin cell,MC)數量和黑色素種類(真黑色素和褐黑色素)密切相關[3]。黑色素細胞起源于神經嵴細胞[4],由背外側路徑遷移至外胚層定植,并增殖分化為成熟黑色素細胞。黑色素細胞中黑素小體合成的色素顆粒由胞吐等方式運輸至周圍細胞[5],發揮吸收散射紫外線和清除自由基等作用[6-7]。黑色素生成涉及復雜的調控過程,受多個基因、轉錄因子、非編碼RNA等的影響[8-9]。大量研究表明,酪蛋白酶(tyrosinase,TYR)、酪蛋白酶相關蛋白酶1(tyrosinase related protein 1,TYRP1)、酪蛋白酶相關蛋 白酶2(tyrosinase related protein 2,TYRP2)、小眼畸形相關轉錄因子(microphthalmia-associated transcription factor,MITF)等基因在黑色素生成的過程中發揮了重要作用[10]。其中TYR編碼的蛋白是黑色素合成過程的限速酶,可將機體內酪氨酸氧化形成L-二羥基苯丙氨酸(L-dihydroxyphenylalanine,L-DOPA),TYRP1、TYRP2則與其協同作用,共同參與黑色素的生成[11-12]。MITF是調控哺乳動物黑色素沉積的重要轉錄因子,與黑色素細胞的發育、存活、遷移、增殖及分化有關,是多條黑色素合成相關信號通路的共同作用位點[13-14]。MITF基因參與黑色素合成主要的信號通路有Wnt/β-catenin、EDN-1/EDNRB、SCF/c-kit、NO等[15]。

近年來,越來越多的miRNA被證實參與調控哺乳動物毛色的形成。Tian等[16]通過測序篩選鑒定出了48個在棕色和白色羊駝皮膚組織中差異表達的miRNAs,Wu等[17]對被毛顏色為白色和黑色的山羊毛囊組織進行miRNA測序,篩選鑒定出6個差異表達miRNAs,其中5個在黑毛毛囊中表達上調,暗示這些差異miRNA可能參與了毛色或膚色的調控。進一步研究發現,miR-125b-5p能夠通過靶向MITF下調黑色素的生成[18]。此外,Wu等[19]在小鼠皮膚中注射pre-miR-434-5p后發現皮膚中TYR表達量顯著下調,黑色素合成過程被抑制,導致小鼠毛發顏色變白。Dong等[20]研究也證實,miR-137過表達會導致小鼠毛色由黑變黃。

本試驗通過對膚色有差異的酉州烏羊(Youzhou dark goat,YZDG)和川東白山羊(Chuandong white goat,CDWG),毛色有差異的大足黑山羊(Dazu black goat,DBG)和成年內蒙古絨山羊(Inner Mongolia cashmere goat,IMCG)分別進行小RNA測序,取兩組測序差異miRNA交集,篩選黑色素生產的核心miRNA。并以B16-F10細胞為模型,以共同差異miR-129-5p為對象,通過轉染其模擬物(mimics)、抑制劑(inhibitor)及相應對照組(mimics NC、inhibitor NC)進一步探究miRNA在細胞黑色素生成中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

蘇木素-伊紅染色試劑盒(Sigma,中國),FBS(Thermo,美國),RPMI 1640(Thermo,美國),Lipofectamine 2000(Thermo,美國),Trizol(TaKaRa,日本),PrimeScriptTM RT Master Mix(TaKaRa,日本),MiR-XTM miRNA FirstStrand Synthesis(TaKaRa,日本),TB Green Premix Ex TaqII(TaKaRa,日本),RIPA蛋白裂解液(康為世紀,中國),MITF、TYR、TYRP1一抗(Bioss ANTIBODIES,中國),辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(碧云天,中國),黑色素標準品(Aladdin,中國)。

1.2 樣本采集

選擇相同飼養環境下健康、純種酉州烏羊(n=3)和川東白山羊(n=3)妊娠母羊,在其妊娠期第100天進行剖腹產手術,采集胎兒肩胛骨后緣3～5 cm處皮膚組織。選擇相同飼養環境下2～3周歲的大足黑山羊(n=3)和內蒙古絨山羊(n=3),手術采集山羊左側肩胛骨后緣5～10 cm處皮膚樣本。將采集的每一份皮膚組織剪成兩份,一份經液氮保存后用于小RNA測序,一份保存在含4%多聚甲醛離心管中用于組織切片試驗。

細胞試驗部分所用的B16-F10皮膚黑色素瘤細胞系來自重慶市畜牧科學院。

1.3 皮膚切片制作

4%多聚甲醛固定的皮膚樣品經梯度濃度酒精(75%、85%、90%、95%和100%)脫水、二甲苯透明后進行石蠟包埋。利用切片機進行平行于皮膚表面的橫切和垂直于皮膚表面的縱切,切片厚度為7 μm。切片用常規蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,中性樹膠封片,于倒置顯微鏡下觀察組織學形態并捕獲組織學圖像。

1.4 小RNA測序及分析

取液氮凍存的皮膚樣本,研磨后使用Trizol提取總RNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整度及污染,Nanodrop檢測RNA濃度及純度。檢測合格的RNA樣品經打斷、末端修復、加A尾、接頭和PCR富集等過程構建文庫后,于Illumina NovaSeq 6000測序平臺進行測序。對原始測序數據進行質量控制后,將對比上參考基因組的reads序列和數據庫miRBase(v22)中成熟miRNA序列進行比對,并利用miRDeep2軟件進行新miRNA的預測。使用FPKM[21]法對表達量進行歸一化,以獲得miRNA相對表達量。基于篩選條件P-value<0.05、FC≥1.5或FC≤0.66獲得差異miRNAs。利用Venn分析,獲得兩個測序數據集的差異miRNA交集,以篩選關鍵miRNAs。

1.5 B16-F10細胞復蘇與轉染

凍存的B16-F10細胞37 ℃水浴復蘇,1 500 r·min-1離心5 min,棄去凍存液。使用預熱37 ℃的PBS清洗3次,10% FBS的RPMI 1640培養基重懸,細胞接種到培養基及六孔板中,在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。每48 h換液。六孔板中培養細胞融合度達到70%左右時進行轉染處理,轉染的模擬物及抑制劑終濃度為33 nmol·L-1,初次更換培養基時間記為0 h,分別繼續培養18、27和36 h后,用qPCR檢測轉染效率,以尋找最高轉染效率的時間。

1.6 總RNA提取、第一鏈合成及引物設計

使用Trizol提取細胞總RNA,使用核酸測定儀檢測RNA濃度和OD260 nm/OD280 nm值,對RNA完整性進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,用無酶水調整RNA濃度至500 ng·μL-1,使用相應反轉錄試劑盒進行mRNA及miRNA反轉錄。利用NCBI和Primer Premier 5.0設計β-actin、TYR、MITF、TYRP1和miR-129-5p引物序列,交由華大公司合成,U6及miRNAs下游通用引物均來自于miRNA反轉試劑盒。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 qPCR檢測mRNA及miRNA表達

以相應cDNA為模板進行PCR反應,反應總體系為10 μL:包含TB Green Premix Ex TaqII 5 μL,cDNA 1 μL,上、下游引物各0.4 μL和ddH2O 3.2 μL。在Biorad CFX96實時熒光定量系統中執行熱循環反應:95 ℃預變性30 s;95 ℃ 5 s,59 ℃退火30 s,共循環40次?；诙肯到y自動生成的閾值線,獲得Ct值。基于參考基因,應用2-ΔΔCt法計算mRNA及miRNA的相對表達量。依據qPCR產物的熔解曲線判斷循環反應的特異性。

1.8 Western blotting檢測黑色素相關蛋白

轉染處理的B16-F10細胞,使用蛋白酶混合物及RIPA裂解液提取總蛋白。蛋白樣品通過10% SDS-PAGE分離并轉移到PVDF膜上。使用5%脫脂奶粉封閉1 h,TBST搖晃清洗3次(5 min·次-1),一抗(MITF、TYR、TYRP1)按比例稀釋后常溫孵育1 h,4 ℃孵育過夜。再次使用TBST清洗PVDF膜3次后,二抗(辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L))孵育2 h,孵育結束后TBST清洗二抗,并進行顯影。

1.9 黑色素含量測定

黑色素標準曲線制作:稱量黑色素標準品,用1 mol·L-1的NaOH液將其配制成2 mg·mL-1的黑色素標準液;標準液經梯度稀釋后,獲得不同濃度(20、40、60、80、100 μg·mL-1)黑色素溶液;在酶標儀上測定各吸光值,以制作成標準曲線。在待測的黑色素細胞沉淀中加入適量1 mol·L-1NaOH于37 ℃金屬浴中孵育1 h充分裂解,然后測定其在A500處的吸光值,用黑色素標準曲線計算黑色素含量,每個樣品設置3個技術重復。

1.10 統計學分析

本研究結果用SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA),用LSD法進行多重比較。試驗結果以“平均值±標準誤”表示。

2 結 果

2.1 黑色素含量在山羊皮膚組織中差異表達

觀察發現,兩個山羊品種YZDG和CDWG的被毛以白色為主(圖1A-B),但YZDG胎羊全身皮膚為烏色(圖1C)、CDWG膚色為白色(圖1D)。皮膚切片染色結果顯示,YZDG胎羊皮膚中可明顯觀察到黑色素顆粒沉積,而CDWG皮膚中無明顯黑色素顆粒存在(圖1E-F)。

A、B.YZDG及CDWG品種照;C、D.100日齡YZDG及CDWG胎羊;E、F.100日齡YZDG及CDWG胎羊皮膚HE染色切片(400×)A, B. The representative breed photographs of YZDG and CDWG; C, D. 100-day-old YZDG and CDWG fetal; E, F. HE-stained sections of skin from 100-day-old YZDG and CDWG fetal(400×)

在另外一組對比試驗中,DBG黑色被毛、白色皮膚(圖2A、C),而IMCG白色被毛、白色皮膚(圖2B、D)。皮膚HE染色結果也顯示,DBG及IMCG表皮中皆無明顯黑色素顆粒沉積;但在DBG毛囊組織的毛球、毛干及外根鞘等部位沉積量較大,與其黑色被毛的表型一致,IMCG毛囊中幾乎沒有黑色素沉積(圖2E-F)。

2.2 小RNA測序及差異miRNA篩選

本研究通過對具有膚色差異的YZDG、CDWG,和具有毛色差異的DBG、IMCG分別進行小RNA測序。結果顯示,在烏皮和白皮胎羊皮膚樣本中,鑒定到62個差異表達miRNAs,其中31個在烏皮山羊皮膚中表達上調,31個在白皮山羊中表達下調,表2為部分差異miRNAs。在黑色被毛及白色被毛山羊皮膚測序中,篩選到38個差異miRNAs,其中10個在黑色被毛山羊中上調,28個在白色被毛山羊皮膚中下調,表3為部分差異表達miRNAs。對兩組測序數據進行Venn分析,發現miR-129-5p在烏色皮膚及黑色被毛山羊皮膚組織中均高表達(圖3)。故進一步進行細胞試驗,以驗證miR-129-5p對黑色素生成的作用。

圖3 兩組小RNA測序的共同差異miRNAsFig.3 The overlaping differential miRNAs between two small RNA sequencing data

表2 酉州烏羊、川東白山羊胎兒皮膚中差異表達miRNAs

表3 大足黑山羊、內蒙古絨山羊皮膚中差異表達miRNAs

2.3 miR-129-5p對黑色素生成的影響

為了確定miR-129-5p對黑色素生成的影響,進行過表達和減低表達miR-129-5p,檢測黑色素含量、基因、蛋白表達量的變化情況。轉染結果顯示,除轉染18 h的inhibitor組無顯著變化外,其余各轉染組都出現相應過表達和減低表達情況(圖4),而在27 h miR-129-5p過表達和減低表達效果最為顯著(P<0.01),故后續試驗均以此時間進行。

圖4 最佳轉染時間篩選Fig.4 The time screening of optimal transfection

為檢測轉染處理后黑色素生成量變化,使用堿溶法提取細胞黑色素。離心后miR-129-5p mimics組細胞沉淀呈灰黑色,顏色較其它3組深,而其它3組細胞沉淀呈灰色(圖5A),黑色素含量檢測結果也顯示miR-129-5p mimics組的黑色素含量比NC組高18.9%(P<0.05);而inhibitor組黑色素含量與其NC組無顯著差異(P>0.05)(圖5B)。

A.不同轉染組的細胞沉淀;B.不同轉染組B16-F10細胞的黑色素相對含量A. Cell sedimentation in different transfection groups; B. Relative melanin content in B16-F10 cells in different transfection groups

為揭示黑色素含量變化的原因,對轉染處理后細胞黑色素生成相關基因表達情況進行檢測。結果如圖6所示,與空白對照組相比,miR-129-5p mimics、inhibitor組MITFmRNA相對表達量無顯著差異(P>0.05)(圖6A),而mimics組的TYR及TYRP1 mRNA表達量相對空白對照組分別上調57.3%和16.5%(P<0.05)(圖6B、C),inhibitor組TYRmRNA表達量顯著下調38.9%(P<0.05),而TYRP1 mRNA表達量無顯著變化(P>0.05)(圖6B、C)。

A～C.不同轉染組MITF、TYR、TYRP1基因相對表達量;D～F.不同轉染組MITF、TYR、TYRP1蛋白印跡及蛋白相對表達量A-C. Relative expression of MITF, TYR, and TYRP1 genes in different transfection groups; D-F. Protein blotting and relative protein expression of MITF, TYR, and TYRP1 in different transfection groups

蛋白定量結果顯示,MITF蛋白在inhibitor組中表達量顯著下調28.4%(P<0.05),而mimics組MITF蛋白的表達量沒有顯著差異(圖6D);mimics組TYR、TYRP1蛋白相較NC組分別顯著上調49.2%及40.2%(P<0.05),inhibitor組TYR、TYRP1蛋白水平則分別下調21.1%及25.3%,差異顯著(P<0.05),兩個基因受調控情況一致(圖6E、F)。

3 討 論

皮膚中黑色素的沉積量是不同膚色和毛色形成的關鍵。大量研究指出,黑色表型的綿羊[22]、豬[23]、獺兔以及牦牛[24]等動物皮膚中黑色素沉積量高于白色表型個體。本研究同樣發現,黑色素顆粒在烏皮山羊的表皮及黑毛山羊的毛球、毛干、外根鞘等部位大量沉積,但在白皮、白毛山羊的表皮及毛囊組織中沉積量很少,表明黑色素含量與膚色及毛色的深淺呈正相關。而黑色素的沉積不僅涉及調控黑色素細胞的成熟、增殖、遷移和黑色素產生的多個基因及信號通路,還受到miRNAs相互作用形成的復雜調控網絡影響[25]。本研究通過分別對膚色及毛色有差異的4個品種山羊進行小RNA測序,發現miR-129-5p是兩組測序共同差異miRNA,且在黑色表型個體中高表達。已有研究顯示,miR-129-5p廣泛參與癌細胞抑制、炎癥反應、血管再生和神經發育等生物學過程,已知的靶基因包括高遷移率族蛋白B1(High mobility group protein B1,HMGB1)[26]、同源框C13(Homeobox C13,HOXC13)[27]、轉錄因子4(Transcription factor 4,TCF4)[28]等,然而在調控黑色素合成方面暫無具體報道。故本研究通過細胞試驗進一步驗證miR-129-5p對黑色素生成的影響。結果顯示,過表達miR-129-5p會顯著增加細胞黑色素沉積量,會顯著上調TYR、TYRP1等黑色素合成相關基因的mRNA和蛋白表達,對黑色素生成有促進作用,而抑制miR-129-5p則顯著下調TYRmRNA及蛋白表達,而TYRP1 mRNA表達水平無顯著差異,僅蛋白表達顯著下調。前人研究證明,TYR基因家族的3個成員TYR、TYRP1、TYRP2都對黑色素的合成有影響[29-30],并且在動物表皮和毛囊中大量表達[31]。Zhao等[32]研究也發現,在小鼠黑色素細胞中過表達及抑制miR-27a-3p,對靶基因WNT3A mRNA水平無顯著影響,但對WNT3A蛋白表達有顯著調節作用,且影響細胞黑色素生成。張利環等[33]研究同樣證明,miR-96-5p僅調節MITF蛋白表達,但對細胞黑色素生成有顯著影響,說明miR-129-5p確實可通過調節TYR與TYRP1基因或蛋白的表達影響黑色素的沉積。但miR-129-5p是以怎樣的形式促進黑色素的沉積,仍需進一步探索。

經典的分子生物學理論認為,miRNA主要是通過與胞質中靶基因mRNA的3′UTR的5～8個堿基進行配對,進而抑制靶基因表達,與靶基因表達呈負相關關系。miR-101a-3p和miR-144a-3p等可通過靶向負調控MITF基因下調羊駝皮膚黑色素沉積[34],但本試驗中miR-129-5p表達與TYR、TYRP1等黑色素相關基因表達及黑色素沉積量呈正相關。因此推測,miR-129-5p有兩種調節黑色素沉積的可能機制,其一是miR-129-5p能通過靶向抑制黑色素生成通路的上游的某個因子,進而促進TYR及TYRP1的表達。Wang等[35]的研究即證明,miR-21a-5p可通過抑制SRY-box轉錄因子5(SRY-box transcription factor 5,SOX5)基因的表達,使MITF、TYR的mRNA和蛋白水平顯著上調,黑色素生成增加。其二是隨著研究的深入,科研工作者發現miRNAs不一定是抑制基因表達。如細胞在G0期時,miRNA活性將從翻譯抑制轉為翻譯激活[36],另一報道顯示,miR-10a還可以與編碼核糖體蛋白(ribosomal protein,RP)的mRNA 5′UTR區結合,增強其表達[37]。除此之外,還有研究表明成熟的miRNA存在于細胞核中[38],且核內miRNAs還被報道能與靶基因啟動子、增強子等元件結合以促進基因轉錄。如miR-205被證實在前列腺癌細胞中能靶向腫瘤抑制因子白介素24(interleukin-24,IL-24)和IL-32啟動子中的特定位點激活其表達[39]。miR-24-1也被發現與多個相鄰編碼基因的增強子結合轉錄出增強子RNAs(enhancer RNAs,eRNAs),進而增強基因轉錄[40]。miRNAs的轉錄激活作用已被大量報道,科學家推測這或許是一種待發掘的疾病治療新方法。本研究中,miR-129-5p在細胞中過表達后能顯著的提高黑色素相關基因TYR、TYRP1等mRNA和蛋白水平的表達,能顯著提高細胞黑色素含量,是黑色素合成通路的重要調控因子,但其在調控過程中是否發揮黑色素合成上游基因沉默或下游基因翻譯增強、轉錄激活等作用還需更進一步的研究。

4 結 論

本研究結果表明,miR-129-5p在烏皮山羊及黑色被毛山羊中高表達,可通過調控TYR、TYRP1等關鍵基因的表達進而影響黑色素的生成,是山羊膚色和毛色形成過程中的重要調節因子。