鵝源副雞禽桿菌全基因組重測序及比較基因組學(xué)分析

蘇文楠,劉佳琪,鐘嘉誠,陳濟鐺,朱婉君,張溢珊,張濟培,*

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院,佛山 528225;2.佛山天牧生物科技有限公司,佛山 528225)

副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum,Apg)屬于巴氏桿菌科禽桿菌屬,是一種無鞭毛、無芽胞的革蘭陰性菌,可引起雞傳染性鼻炎。該菌不屬于泛嗜性細菌,在以往文獻報道中,除了雞以外,甚少有其它動物感染Apg的報道,即使可以從其他動物上分離到Apg,也無法用本體動物復(fù)制出相同的癥狀和病理變化[1]。但1981年Reece等[2]報道了日本地區(qū)的鵪鶉群體出現(xiàn)疑似傳染性鼻炎病例,通過對病原體分離鑒定,證實為Apg感染所致,之后該病也出現(xiàn)在印度尼西亞,成為當?shù)伫g鶉群體中的一種常見病,從鵪鶉分離的菌株重新接種回本體動物,可以復(fù)制出同樣的臨床癥狀和病理變化[3-5],說明Apg已開始出現(xiàn)跨禽種傳播的趨勢。2020年初,鐘嘉誠等[6]從廣東地區(qū)發(fā)生傳染性鼻炎的種鵝中分離出了一株Apg,經(jīng)過動物回歸試驗證實了該菌株對鵝具有致病性。目前關(guān)于Apg引起鵝傳染性鼻炎的報道不多,鮮有對于鵝源Apg的研究報道,對于鵝源Apg的來源以及與雞源Apg基因組之間的異同仍不清楚。因此本研究對3株鵝源Apg和4株雞源Apg菌株進行全基因測序及基因組分析,通過對基因組進行基于核心基因SNPs的同源性分析來了解其系統(tǒng)進化關(guān)系,并根據(jù)宿主源和致病性的差異對菌株歸類,利用同源基因分析比較不同宿主源Apg之間的基因差異,以探討Apg對不同宿主的感染機制。

1 材料與方法

1.1 菌株

由本實驗室分離保存的3株鵝源Apg(G-AP1、G-AP2、G-AP3)及4株雞源Apg(C-AP1、C-AP2、C-AP3、C-AP4),菌株的具體信息見文獻[7](表1)。

表1 菌株信息

1.2 主要試劑及分析軟件

主要試劑:Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒,生工生物工程(上海)有限公司。

分析軟件:測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估軟件FastQC(version 0.11.9),測序數(shù)據(jù)過濾軟件Trimmomatic(version 0.39),基因組序列拼接軟件Soapdenovo2(version 2.40),基因組注釋軟件prokka(version 1.14.6),圈圖繪制軟件CGView,序列比對相關(guān)軟件MEGA7、BLAST+(version 2.13.0)、BRIG(version 0.95),SNP分析軟件kSNP3(version 3.1.2),基因同源性分析軟件OrthoFinder(version 2.3.12),畫樹工具FastTree。

1.3 菌株基因組DNA的提取

參照Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書對7株菌株進行細菌基因組的提取,干冰凍存送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序工作。

1.4 基因組重測序與組裝

7株Apg菌株的全基因組重測序工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成,采用二代測序平臺Illumina PE150 進行全基因組測序。將測序的原始數(shù)據(jù)(raw data)通過FastQC軟件作序列數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估[4],利用Trimmomatic軟件進行過濾處理獲得有效數(shù)據(jù)(clean data);將有效數(shù)據(jù)利用Soapdenovo2軟件[8]進行denovo組裝后獲得高質(zhì)量的Contig片段,并進行序列補洞與修正,最終獲得基因組掃描圖。

1.5 一般生物信息學(xué)分析

采用Prokka軟件[9]對基因組掃描圖進行基因元件(編碼基因、tRNA、rRNA等)預(yù)測,Prokka軟件根據(jù)COG等數(shù)據(jù)庫對編碼蛋白進行功能預(yù)測與注釋;基因島通過IslandViewer 4在線預(yù)測,以副雞禽桿菌ESV-135(登錄號為NZ_CP050 316.1)作參照基因組;噬菌體序列由PHASTER[10]在線預(yù)測;利用VFDB數(shù)據(jù)庫(Virulence Factor Database)作毒力基因的預(yù)測。使用CGView軟件繪制基因組圈圖,并將基因島、前噬菌體信息整合到圈圖中。

1.6 基于核心基因SNPs的系統(tǒng)發(fā)育分析

運用kSNP3軟件[11],以Apg菌株ESV-135基因組作參考基因組,分別與本試驗的7株菌株基因和NCBI已公布的42個Apg基因組進行比對,獲得所有菌株的SNPs(單核苷酸多態(tài)性位點),根據(jù)核心基因SNPs,通過ML法(最大似然法)進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.7 同源基因分析

1.7.1 7株菌株基因組的同源性分析 提取7株菌株基因組的蛋白質(zhì)序列文件,運用OrthoFinder軟件[12]分析各個基因組之間共有和特有的基因。

1.7.2 鵝源菌株與雞源菌株基因組的同源性分析 為了解該地區(qū)的鵝源菌株群體與雞源菌株群體之間的同源基因分布情況,將本試驗的3株鵝源菌株設(shè)為A組,4株雞源菌株設(shè)為B組,分別對二組進行同源基因分析,隨后將鵝源菌株共有基因與雞源菌株共有基因進行聚類分析,從而獲到二者的特有基因。

1.7.3 Apg對鵝致病基因的篩查 7株Apg對鵝的致病性表征評分分別為G-AP1(1.26)、G-AP2(1.41)、G-AP3(1.16)、C-AP1(0.34)、C-AP2(0.06)、C-AP3(0.47)、C-AP4(0.41),C-AP2株對鵝的致病力最弱,且在鵝機體內(nèi)停留的時間最短,而鵝源Apg對鵝的致病性最強,另外3株雞源Apg次之[7]。為探究是否存在有助于Apg對鵝致病的相關(guān)基因,分別將低毒力的C-AP2株基因組設(shè)為A組,高毒力的鵝源菌株(G-AP1、G-AP2、G-AP3)和中等毒力的雞源菌株(C-AP1、C-AP3、C-AP4)的基因組集合設(shè)為B組,通過對A組和B組進行同源性分析比較,獲得B組特有基因。

1.7.4 Apg對雞致病基因的篩查 從Apg對雞的致病性表征表征評分分別為G-AP1(0.14)、G-AP2(0.47)、G-AP3(0.1)、C-AP1(0.51)、C-AP2(1.59)、C-AP3(1.51)、C-AP4(1.74),所有鵝源菌株和雞源菌株G-AP1對雞致病性弱,感染雞沒有明顯的臨床表征[7],為了尋找有助于Apg對雞致病的相關(guān)基因,將低毒力鵝源菌株(G-AP1、G-AP2、G-AP3)和中等毒力雞源菌株C-AP1基因組集合設(shè)為A組,3株高致病性雞源菌株(C-AP2、C-AP3、C-AP4)的基因組集合設(shè)為B組,通過對A組與B組進行同源性分析比較,獲得B組特有基因。

2 結(jié) 果

2.1 菌株基因組分析

2.1.1 基因組分析 7株Apg全基因組原始測序結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù)過濾校正后,通過組裝處理,得到7個大小為2.567 339～2.637 621 Mb的基因組片段,GC含量介于40.79%～41.02% 之間,分別預(yù)測到2 481～2 624個蛋白編碼基因(protein coding sequences,CDSs)、tRNA 53～55個、rRNA 5～9個;利用IslandViewer4對菌株進行基因島預(yù)測,分別預(yù)測到9～14個基因島;通過PHASTER在線預(yù)測,可見菌株帶有5～7個前噬菌體序列(詳見OSID “開放科學(xué)內(nèi)容與數(shù)據(jù)”)(表2)。鵝源菌株與雞源菌株的全基因組相似,結(jié)果無顯著差異。

表2 菌株基因組信息

2.1.2 功能聚類分析 COG、KEGG和GO注釋分類統(tǒng)計圖都分別包含了7株Apg各種基因功能的平均基因數(shù)和對應(yīng)的標準差,從圖1可見,基因功能主要聚集在細胞的新陳代謝、細胞的合成、膜轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA復(fù)制及修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、翻譯;根據(jù)各基因功能的基因數(shù)標準差,可知7株Apg各種基因功能對應(yīng)的基因數(shù)相差甚少。

圖1 COG、KEGG和GO基因功能聚類分析Fig.1 Functional cluster analysis of COG, KEGG and GO genes

2.1.3 毒力基因分析 利用細菌毒力因子數(shù)據(jù)庫(VFDB)在線分析,3株鵝源菌株和4株雞源菌株均預(yù)測出75個毒力相關(guān)基因,且所有菌株攜帶相同的毒力基因譜,其中占比最大的是內(nèi)毒素類的毒力基因,詳情見表3。

表3 毒力基因統(tǒng)計分析

2.2 基于核心基因SNPs的系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)核心基因SNPs構(gòu)建進化樹,發(fā)現(xiàn)Apg的進化樹分布情況與菌株的分離地區(qū)有密切關(guān)系,各地區(qū)菌株基本會聚集在鄰近的分支上,國內(nèi)除了Hp8、A2S-2-1和Z1S-2-1株外,其他菌株均聚集在相鄰分支上,包括本試驗的7株菌株。在進化樹中,3株鵝源菌株和雞源菌株C-AP3以及p4chr1株位于同一小分支上,另外3株雞源菌株分布在其它國內(nèi)菌株分支上(圖2)。

圖2 核心基因SNPs進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of core SNPs

2.3 直系同源基因分析

2.3.1 7 株菌株同源性分析 為了解Apg菌株整體的同源基因分布情況,基于所有基因組的蛋白質(zhì)序列,利用OrthoFinder軟件分析各基因組間的共有基因和特有基因。結(jié)果顯示,7 個基因組共計17 200條蛋白質(zhì)序列,其中17 131個基因之間至少有兩個基因存在同源性,還有69個基因與其他基因沒有同源性;17 131個基因共計分出的2 241個共有基因家族,菌株普遍攜帶2 ～ 3個特有基因,而C-AP2株有14個特有基因、C-AP3株有44個特有基因;根據(jù)同源單拷貝基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹,可見G-AP1株和G-AP2株獨立于其它5株菌株(圖3)。

圖3 基于同源單拷貝基因構(gòu)建的進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of homologous single copy genes

2.3.2 鵝源菌株與雞源菌株的同源性分析 通過對鵝源菌株共有基因與雞源菌株共有基因作比較,發(fā)現(xiàn)鵝源和雞源菌株共有4 711個基因,其中共有基因4 598個分為2 225個基因家族類群。另有113個基因?qū)儆谔赜谢?其中鵝源菌株特有基因有76個,雞源菌株特有基因有37個。研究表明鵝源菌株與雞源菌株在基因水平上存在差異。

2.3.3 雞源Apg對鵝適應(yīng)性基因的篩查 對A、B二組的基因組進行同源性分析,經(jīng)排除與A組(C-AP2)基因組同源的基因,剩余79個特有基因存在于B組(G-AP1、G-AP2、G-AP3、C-AP1、C-AP3、C-AP4),通過對79個特有基因的功能注釋可見,僅有22個基因編碼已知蛋白,包括ATP酶RavA、冷休克樣蛋白CspD、50S核糖體蛋白L3谷氨酰胺甲基轉(zhuǎn)移酶、雙官能團(IPC轉(zhuǎn)移酶和DIPP合成酶)、轉(zhuǎn)運蛋白家族EamA、膽堿/乙醇胺激酶、腺苷酸環(huán)化酶、Ⅰ型限制性內(nèi)切酶EcoR124II R蛋白、跨膜蛋白A、EcoKⅠ限制性修飾系統(tǒng)蛋白HsdS、抗阻遏物AntA/AntB、海藻酸鹽生物合成蛋白、巖藻糖轉(zhuǎn)移酶、DNA結(jié)合蛋白H-NS、轉(zhuǎn)肽酶D、脂多糖核心生物合成蛋白、碳水化合物二酸調(diào)節(jié)劑、唾液酸轉(zhuǎn)移酶PMO188、DoxX、乙酰轉(zhuǎn)移酶OatA、半乳糖、腸桿菌素EntS。其余57個蛋白均為假定蛋白;22個已知蛋白中,只有脂多糖核心生物合成蛋白與致病性有較大關(guān)聯(lián),其他蛋白與菌株致病性無直接聯(lián)系;由于存在大量假定蛋白,暫時無法判斷這79個基因中是否存在影響Apg對鵝的適應(yīng)性基因,需要作進一步研究。

2.3.4 鵝源Apg對雞適應(yīng)性基因的篩查 對鵝源菌株G-AP1、G-AP2、G-AP3和雞源菌株C-AP1共計9 831個基因進行同源基因分析,其中2 327個基因家族類群存在于所有樣本中,將2 327個基因家族類群記為A組。對雞源菌株C-AP2、C-AP3、C-AP4共計7 369個基因進行同源基因分析,其中2 278個基因家族類群存在于所有樣本中,將2 278個基因家族類群記為B組。對A、B二組進行同源性分析,篩選出39個B組特有基因,其中10個為有明確蛋白功能注釋的基因,包括灰分蛋白家族、β-自轉(zhuǎn)運域蛋白、Ogr/Delta樣鋅指、轉(zhuǎn)座酶DDE結(jié)構(gòu)域蛋白、P2噬菌體J蛋白、噬菌體CP4-57調(diào)節(jié)蛋白(AlpA)、螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白、質(zhì)粒穩(wěn)定系統(tǒng)蛋白、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制因子PuuR、噬菌體CI抑制因子螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白,29個為假定基因;10個功能明確的基因中,除了β-結(jié)構(gòu)域自轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因與革蘭陰性菌毒力有較直接關(guān)系外,其它基因仍有待進一步研究才能證實是否存在介導(dǎo)Apg對雞適應(yīng)的作用(表4)。

表4 已知功能蛋白

3 討 論

細菌基因組是細菌全部遺傳信息的集合,它在本質(zhì)上決定了細菌的外觀與功能,由于其基因數(shù)目龐大,且復(fù)雜多樣,導(dǎo)致研究難度較高。隨著全基因測序的發(fā)明以及比較基因組學(xué)方法的建立,讓細菌基因組的研究變得便捷且科學(xué)。本試驗3株鵝源Apg菌株基因組的整體參數(shù)與雞源Apg菌株的基因組相比差異不大[13]。借助COG、KEGG和GO數(shù)據(jù)庫對菌株基因組作注釋和聚類,可見所有鵝源菌株的基因功能主要聚集在細胞的新陳代謝、細胞的合成、膜轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA復(fù)制及修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、翻譯,與雞源菌株分布情況相似。

目前VFDB數(shù)據(jù)庫仍未公布Apg的毒力因子信息,但由于大部分細菌的毒力因子為種屬特異的,不同物種間的比對會面臨假陽性高的風(fēng)險,因此本試驗以親緣關(guān)系較為接近的流感嗜血桿菌數(shù)據(jù)庫作替代,結(jié)果顯示7株Apg均預(yù)測出75個相同的毒力基因,未找到菌株間毒力基因的差異,但可以肯定的是,仍有部分未知的Apg毒力基因在Apg感染宿主過程中起關(guān)鍵作用。

基因同源性分析試驗中,通過對鵝源菌株共有基因與雞源菌株共有基因作比較,結(jié)果顯示鵝源菌株與雞源菌株有2 225個共有基因,得到鵝源菌株特有基因76個,雞源菌株特有基因37個,說明鵝源菌株和雞源菌株存在基因水平上的差異。為了進一步了解這些基因差異是否會導(dǎo)致菌株的致病性差異以及是否會改變菌株對宿主的嗜性,作者根據(jù)菌株對不同宿主的致病性強弱進行物種的適應(yīng)性篩查。Apg對雞適應(yīng)性基因篩查結(jié)果顯示,共聚類出79個基因,其中編碼的蛋白大部分為假定蛋白,另外在22個已知蛋白中,目前較明確與致病性相關(guān)的基因為編碼脂多糖核心合成蛋白的基因,其它基因與細菌的黏附、抗宿主免疫系統(tǒng)、毒力因子和攝鐵系統(tǒng)沒有直接關(guān)聯(lián)[14-16];此外,由于假定蛋白的數(shù)量眾多,影響Apg對鵝適應(yīng)性的基因也可能存在于此,暫時無法下明確結(jié)論。在Apg對雞適應(yīng)性基因的篩查結(jié)果中,共聚類得到39個基因,其中10個編碼已知蛋白,29個編碼假定蛋白,在已知蛋白里,除β域自轉(zhuǎn)運蛋白具有明確的致病性外[17],其他蛋白與菌株的致病性沒有直接關(guān)系,另外29個假定蛋白編碼基因也可能是影響Apg感染雞的關(guān)鍵因素。

SNP是指基因組中由單個堿基突變引起的DNA序列多態(tài)性,是遺傳變異的重要依據(jù)[18-21],為研究物種起源、進化,本次利用SNP序列構(gòu)建了包含50株Apg的進化樹,從進化樹中可以發(fā)現(xiàn),Apg菌株的SNP變化基本是以地區(qū)為單位,同一國家的菌株會分布在同一或相鄰的分支上,本試驗的3株鵝源菌株與雞源菌株都分布在我國新近分離株的大分支上,且鵝源菌株和雞源C-AP3株聚集在p4chr1株的小分支上,從菌株對鵝的致病性試驗可見,這4株菌對鵝的適應(yīng)性要強于另外3株雞源菌株,由此推測,Apg對鵝機體產(chǎn)生適應(yīng)性的原因不一定是物種適應(yīng)性基因的擁有,也可能是由于菌株基因發(fā)生突變,改變了Apg的黏附能力、毒力或抗吞噬力等,從而達到實施感染致病的目的。

4 結(jié) 論

通過比較基因組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)與鵝源副雞禽桿菌(Apg)宿主適應(yīng)性有關(guān)的基因為118個,對鵝適應(yīng)性基因的篩查共聚類出79個基因,其中編碼已知蛋白的基因有22個,其余編碼假定蛋白;對雞適應(yīng)性基因的篩查聚類出39個基因,其中10個編碼已知蛋白,29個編碼假定基因為進一步闡釋Apg跨物種感染的分子生物學(xué)機制奠定了基礎(chǔ)。