circ_0114427靶向微小RNA-330-5p調控脂多糖誘導的肺泡上皮細胞凋亡及炎癥反應

楊忠信, 周 冉, 黃智超, 梅笑寒, 李一锃, 楊學峰, 李曉宇

(河南大學第一附屬醫院 胸外科, 河南 開封, 475000)

急性肺損傷是全身炎癥反應綜合征在肺部的表現[1], 其主要病理特征之一為肺泡上皮細胞損傷[2]。環狀RNA(circRNA)可通過海綿化微小RNA(miRNA)介導下游靶基因的表達,進而調控多種疾病的發展,包括肺損傷[3-5]。circ_0114427在急性腎損傷(AKI)患者血清和脂多糖(LPS)誘導的腎小管上皮細胞HK-2中表達升高,其通過靶向miR-495-3p/TRAF6軸促進LPS誘導的HK-2細胞凋亡和炎癥反應[6]。但circ_0114427能否影響肺泡上皮細胞損傷尚不清楚。CircInteractome軟件預測顯示, circ_0114427與miR-330-5p具有結合位點。研究[7]顯示, miR-330-5p在LPS誘導的肺血管內皮細胞中表達下調,上調miR-330-5p通過靶向抑制TLR4的表達阻礙LPS誘導的肺血管內皮細胞凋亡和炎性細胞因子表達, miR-330-5p可作為急性肺損傷治療的分子靶點。本研究利用LPS誘導人肺泡上皮細胞損傷模型,旨在探討circ_0114427是否通過靶向miR-330-5影響LPS誘導的人肺泡上皮細胞凋亡和炎癥。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑

人肺泡上皮細胞,武漢Procell; 聚合酶鏈反應(PCR)實驗相關試劑盒,日本Takara; 胎牛血清、DMEM, 美國Gibco; Annexin V-FITC檢測試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒,北京索萊寶; LPS, 美國Sigma公司; 引物序列、circ_0114427小干擾RNA(si-circ_0114427)及陰性對照(si-NC)、miR-330-5p模擬物(mimics)和抑制劑(anti-miR-330-5p)及陰性對照(miR-NC和anti-miR-NC)、circ_0114427野生型(WT-circ_0114427)和突變型(MUT-circ_0114427)載體,生工生物工程(上海)股份有限公司; LipofectamineTM2000試劑盒,美國Invitrogen; 白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒,南京建成生物工程研究所; 免疫印跡實驗所需抗體,美國Abcam。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組: 在CO2培養箱中,肺泡上皮細胞生長于含10%胎牛血清的DMEM。于6孔板中培養肺泡上皮細胞,接種個數為1.0×106個/孔。細胞用含10 mg/L[8]LPS的培養液培養24 h, 設為LPS組,未處理的細胞作為對照(con)組。細胞用LipofectamineTM2000轉染si-NC、si-circ_0114427、miR-NC、miR-330-5p mimics、si-circ_0114427與anti-miR-NC、si-circ_0114427與anti-miR-330-5p。然后用10 mg/L LPS處理24 h, 記為LPS+si-NC組、LPS+si-circ_0114427組、LPS+miR-NC組、LPS+miR-330-5p組、LPS+si-circ_0114427+anti-miR-NC組、LPS+si-circ_0114427+anti-miR-330-5p組。序列如下, si-NC: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′; si-circ_0114427: 5′-GACUAUGCACUCAGACUA AAUTT-3′; miR-NC: 5′-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA-3′; miR-330-5p mimics: 5′-UCUCUGGGCCUGUGUCUUAGGC-3′; anti-miR-NC: 5′-UCUACUCUUUCUAGGAGGUUGUGA-3′; anti-miR-330-5p: 5′-GCCUAAGACACAGGCCCAGAGA-3′。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測circ_0114427和miR-330-5p表達: 用RNA抽提試劑盒提取細胞中總RNA, 使用AMV第一鏈cDNA合成和miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒將RNA反轉錄生成cDNA后,行PCR擴增。引物序列: circ_0114427上游為5′-CTGCGTGAGACTGAGCGA TGC-3′, 下游為5′-CGTAGGAGCTCGGATGCCGAC-3′; miR-330-5p上游為 5′-TCTCTGGGCCTGTGTCTTAGGC-3′, 下游為5′-TTAATGGGGTGATTGGTGGT-3′;GAPDH上游為5′-GACTCCACTCACGGCAAATTCA-3′, 下游為5′-TCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′;U6上游為5′-GCTCGCTTCGGCAGCACA-3′, 下游為5′-GAGGTATTCGCACCAGAGGA-3′。采用2-△△Ct法計算circ_0114427、miR-330-5p的相對表達量,內參為GAPDH、U6。

1.2.3 流式細胞術: 收集各組細胞,利用Annexin V-FITC/PI試劑盒對細胞進行染色,最后使用流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.2.4 蛋白免疫印跡: 細胞用RIPA試劑處理提取總蛋白。蛋白經10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。膜與活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved-caspase3, 兔抗人)、活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-9(Cleaved-caspase9, 兔抗人)、GAPDH(兔抗人)一抗孵育過夜,再與二抗(山羊抗兔)孵育1 h。最后,用顯影液顯示蛋白條帶,并使用Image J軟件分析蛋白灰度值。

1.2.5 酶聯免疫吸附試驗(ELISA): 根據IL-6和TNF-α ELISA試劑盒說明書檢測細胞培養上清液中的IL-6和TNF-α水平。

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗: 肺泡上皮細胞共轉染miR-NC/miR-330-5p mimic與WT-circ_0114427/MUT- circ_0114427。48 h后,收集細胞,根據雙熒光素酶活性檢測試劑盒的說明書,檢測熒光素酶活性。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 circ_0114427和miR-330-5p在LPS誘導的肺泡上皮細胞中的表達

LPS組肺泡上皮細胞中的circ_0114427表達量(3.42±0.13), 高于con組的(1.00±0), 差異有統計學意義(P<0.05); miR-330-5p表達量(0.24±0.02), 低于con組的(1.00±0), 差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

A: circ_0114427在LPS誘導的肺泡上皮細胞與未誘導的細胞中的相對表達量; B: miR-330-5p在LPS誘導的肺泡上皮細胞與未誘導的細胞中的相對表達量。與con組比較, *P<0.05。圖1 circ_0114427和miR-330-5p在LPS誘導的肺泡上皮細胞中的表達

2.2 circ_0114427和miR-330-5p轉染效果

轉染si-circ_0114427的肺泡上皮細胞中的circ_0114427表達量(0.27±0.03), 低于轉染si-NC細胞的(1.00±0), 差異有統計學意義(P<0.05); 轉染miR-330-5p mimics的肺泡上皮細胞中的miR-330-5p表達量(3.08±0.15), 高于轉染miR-NC細胞的(1.00±0), 差異有統計學意義(P<0.05); 共轉染si-circ_0114427與anti-miR-330-5p的肺泡上皮細胞中的miR-330-5p表達量(0.41±0.04), 低于共轉染si-circ_0114427與anti-miR-NC細胞的(1.00±0), 差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

A: 轉染si-circ_0114427的肺泡上皮細胞中的circ_0114427表達量; B: 轉染miR-330-5p mimics的肺泡上皮細胞中的miR-330-5p表達量; C: 共轉染si-circ_0114427與anti-miR-330-5p的肺泡上皮細胞中的miR-330-5p表達量。與 si-NC 比較, *P<0.05; 與 miR-NC 比較, #P<0.05; 與 si-circ_0114427+anti-miR-NC比較, △P<0.05。圖2 circ_0114427和miR-330-5p轉染效果

2.3 敲減circ_0114427對LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥的影響

與con組相比, LPS組細胞凋亡率及Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平和IL-6、TNF-α水平升高,差異有統計學意義(P<0.05)。與LPS組、LPS+si-NC組相比, LPS+si-circ_0114427組肺泡上皮細胞凋亡率及Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平和IL-6、TNF-α水平降低,差異有統計學意義(P<0.05)。LPS組與LPS+si-NC組的各檢測指標比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3、表1。

A: 細胞凋亡圖; B: 蛋白條帶圖。圖3 敲減circ_0114427對LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡及相關蛋白表達的影響

表1 敲減circ_0114427對LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥的影響

2.4 circ_0114427靶向miR-330-5p

CircInteractome軟件預測circ_0114427與miR-330-5p之間存在結合位點。共轉染miR-NC與WT-circ_0114427、miR-330-5p mimics與WT-circ_0114427的肺泡上皮細胞熒光素酶活性分別為(0.96±0.07)、(0.36±0.05),差異有統計學意義(P<0.05), 說明circ_0114427靶向結合miR-330-5p。同時,轉染si-circ_0114427的肺泡上皮細胞中的miR-330-5p表達量(3.98±0.13), 高于轉染si-NC細胞的(1.00±0), 差異有統計學意義(P<0.05), 說明敲減circ_0114427促進miR-330-5p表達。見圖4。

A: circ_0114427與miR-330-5p之間存在結合位點; B: 肺泡上皮細胞熒光素酶活性檢測; C: 轉染si-circ_0114427的肺泡上皮細胞中的miR-330-5p表達量。與miR-NC+WT-circ_0114427比較, *P<0.05; 與si-NC比較, #P<0.05。圖4 circ_0114427靶向miR-330-5p

2.5 miR-330-5p抑制LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥

LPS+miR-330-5p組的肺泡上皮細胞凋亡率及Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平和IL-6、TNF-α水平低于LPS+miR-NC組,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5、表2。

A: 細胞凋亡圖; B: 蛋白條帶圖。圖5 上調miR-330-5p對LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡及相關蛋白表達的影響

表2 上調miR-330-5p對LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥的影響

2.6 miR-330-5p下調逆轉circ_0114427敲低對LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥因子表達的影響

LPS+si-circ_0114427+anti-miR-330-5p組的肺泡上皮細胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平及IL-6、TNF-α水平高于LPS+si-circ_0114427+anti-miR-NC組,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖6、表3。

A: 細胞凋亡圖; B: 蛋白條帶圖。圖6 下調miR-330-5p逆轉敲減circ_0114427對LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡及相關蛋白表達的影響

表3 下調miR-330-5p逆轉敲減circ_0114427對LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥的影響

3 討 論

肺泡上皮細胞參與肺組織結構完整及功能發揮。急性肺損傷發生時,肺泡上皮細胞被刺激產生劇烈炎癥反應,嚴重時可導致肺泡上皮細胞凋亡或壞死,進一步加劇肺組織損傷[9]。LPS是導致肺泡上皮細胞損傷的重要誘導因子[10]。本研究結果顯示,肺泡上皮細胞經LPS誘導后,細胞凋亡率增加,分泌更多的炎性因子IL-6和TNF-α, 說明LPS誘導的肺泡上皮細胞損傷模型建立成功。

隨著分子生物學的不斷發展, circRNA和miRNA在肺損傷中的作用受到廣泛關注。通過特異性改變circRNA/miRNA的表達可達到減輕肺損傷的作用,circRNA/miRNA可作為肺損傷治療的分子靶點。研究[11]顯示,敲減circ_0038467可通過上調miR-182表達抑制肺泡上皮細胞凋亡和內質網應激,提示circ_0038467可作為肺炎治療的分子靶點。研究[12]顯示, circ_0059930在LPS誘導的人胚肺成纖維細胞MRC-5中表達上調,下調circ_0059930促進LPS介導的MRC-5細胞增殖,并抑制細胞凋亡,這與circ_0059930靶向miR-382-5p正向調控TOP1的表達有關, circ_0059930/miR-382-5p/TOP1軸為急性肺損傷的發病機制的闡明提供新途徑。

circ_0114427在順鉑誘導的AKI中表達上調,其通過競爭性吸附miR-494進而上調ATF3的表達,促進AKI早期炎癥進展,敲減circ_0114427有可能起到治療AKI的作用[13]。本研究結果顯示,circ_0114427在LPS誘導的肺泡上皮細胞中表達增加,敲減circ_0114427導致LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡及炎癥因子IL-6和TNF-α的表達減少,提示敲減circ_0114427抑制LPS誘導的肺泡上皮細胞損傷。caspase3和caspase9是caspase蛋白家族成員,在受到凋亡信號刺激后被活化,誘導細胞凋亡[14]。本研究結果顯示,敲減circ_0114427降低了LPS誘導的肺泡上皮細胞中caspase3和caspase9的活化,進一步提示敲減circ_0114427抑制LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡。

miR-330-5p被證實可以調節細胞凋亡和炎癥過程[15]。研究[16]報道, miR-330-5p在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的人臍靜脈內皮細胞中表達降低,上調miR-330-5p通過靶向抑制Nod2的表達減少ox-LDL誘導的HAECs凋亡,并抑制細胞氧化應激反應,減輕人臍靜脈內皮細胞損傷; miR-330-5p是膿毒癥小鼠和LPS誘導的心肌細胞HL-1中表達降低的miRNA,過表達miR-330-5p可通過靶向下調TRAF6抑制LPS誘導的HL-1細胞炎癥和氧化應激, miR-330-5p可作為LPS誘導的心肌損傷的治療靶點[17]。本實驗數據顯示,LPS誘導的肺泡上皮細胞中miR-330-5p表達降低,上調miR-330-5p抑制了LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥,表明上調miR-330-5p減輕了LPS誘導的肺泡上皮細胞損傷。此外, miR-330-5p下調可以逆轉circ_0114427敲低對LPS誘導的細胞凋亡和炎癥的作用,這證實circ_0114427通過靶向miR-330-5p調控肺泡上皮細胞損傷。

綜上所述, LPS誘導的肺泡上皮細胞中circ_0114427表達升高,miR-330-5p表達降低; 敲減circ_0114427可通過促進miR-330-5p表達減輕LPS誘導的肺泡上皮細胞損傷。但本研究結果需進一步通過體內實驗進行驗證,且circ_0114427調控的miR-330-5p的靶基因也有待進一步探討。