κ-阿片受體激動劑U50488H通過調(diào)節(jié)巨噬細胞極化減輕體外循環(huán)致大鼠急性肺損傷的研究

李 龍, 高光潔

(中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院 麻醉科, 遼寧 沈陽, 110042)

急性肺損傷(ALI)是體外循環(huán)(CPB)心臟手術后的主要并發(fā)癥之一[1-2]。探討防治CPB致肺損傷的有效策略,對降低患者并發(fā)癥的發(fā)生率與病死率尤為重要。研究[3]表明,肺泡巨噬細胞的極化失衡是導致ALI的重要原因。本課題組前期研究[4]發(fā)現(xiàn),κ-阿片受體(KOR)激動劑U50488H對CPB大鼠肺上皮屏障具有一定的保護作用,但其具體機制尚未明確。本研究通過建立大鼠CPB模型,探討U50488H是否通過調(diào)節(jié)肺巨噬細胞的極化,減輕CPB后全身炎性反應,進而減少ALI的發(fā)生,以期為KOR激動劑用于防治CPB心臟后肺損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

24只成年雄性清潔級SD大鼠,體質(zhì)量350～450 g(中國醫(yī)科大學動物實驗科),隨機分為Sham組(假手術)、CPB組(CPB)和U50488H組(KOR激動劑+CPB), 每組8只。Sham組只在相應部位插管而不行CPB, CPB組在相應部位插管行CPB 60 min, U50488H組于CPB前30 min靜脈注射1.5 mg/kg U50488H(所用劑量參照文獻[4-5]), 其余同CPB組。

1.2 CPB模型制備

參照文獻[4-6]建立大鼠停跳復跳的CPB模型。大鼠術前禁食6 h, 禁飲2 h。2%戊巴比妥0.4 mL/100 g腹腔內(nèi)注射麻醉,氣管插管連接小動物呼吸機行機械通氣。麻醉維持采用間斷腹腔注射戊巴比妥和靜脈注射哌庫溴銨0.1 mg/kg。肝素化后通過右股動脈、右頸靜脈建立CPB環(huán)路并開始CPB。正中劈開胸骨,動脈夾阻斷主動脈,經(jīng)右頸動脈4 ℃ CHTK溶液冷灌停跳心臟20 min。CPB期間監(jiān)測大鼠血壓、體溫及動脈血氣變化。復溫至36 ℃時,開放主動脈,自主復跳后逐層關胸。復溫至37 ℃, CPB 輔助維持1 h后停轉流。3組大鼠均在停CPB后2 h時處死,并抽取靜脈血和肺組織作相應檢測。

1.3 肺組織光鏡觀察

取肺組織標本,置于10%的中性甲醛溶液中48 h以上,繼而經(jīng)脫水、常規(guī)石蠟包埋、5 μm切片及蘇木精-伊紅(HE)染色后,在光鏡下觀察肺組織形態(tài)學變化。

1.4 肺功能和血管外肺水(EVLW)測定

分別于CPB后0、1、2 h行動脈血氣分析,計算肺泡-動脈氧分壓差(A-aDO2)和呼吸指數(shù)(RI), 評估肺換氣功能。CPB 2 h處死大鼠后取完整右肺下葉,采用重力法測定血EVLW。

1.5 血漿脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL- 6)和白細胞介素-4(IL-4)含量測定

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國Elabscience公司提供)測定各組大鼠血漿LPS、TNF-α、IL-6和IL-4的光密度值(OD值)。繪制標準曲線計算含量: 根據(jù)標準孔 OD 值繪制標準曲線,計算各樣品孔中各因子的含量。

1.6 肺組織iNOS和CD206水平測定

采用免疫熒光法測定大鼠肺組織的iNOS和CD206水平,石蠟包埋大鼠肺組織, 3%雙氧水浸泡15 min, 再用0.1 mol/L枸櫞酸鈉磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗抗原修復。用山羊血清封閉, 37 ℃孵育30 min, 然后分別加入稀釋后的抗F480、抗iNOS和抗CD206抗體(北京智杰方遠科技有限公司提供), 4 ℃孵育1 h。切片在PBS中漂洗后,加入熒光標記的第二抗體,并在37 ℃下孵育30 min。在PBS中漂洗后,切片加入DAPI以染色細胞核并在室溫下溫育10 min。然后用PBS再次沖洗,用中性樹脂密封,在熒光顯微鏡下分析。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 大鼠肺組織形態(tài)學的變化

HE染色光鏡顯示,Sham組大鼠肺組織結構完整,肺泡腔清晰,肺泡間隔無水腫,毛細血管略擴張,少量炎性細胞浸潤; CPB組肺泡壁明顯增厚,肺泡內(nèi)充血/出血,炎性細胞浸潤明顯; U50488H組肺泡壁稍增厚,肺泡內(nèi)充血/出血,血管周圍炎性細胞浸潤較CPB組減輕,見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織形態(tài)學(放大200倍)

2.2 大鼠EVLW、LPS、AaDO2和RI的變化

與Sham組比較, CPB組的EVLW增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); U50488H組EVLW低于CPB組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 與Sham組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。CPB后0、1和2 h, CPB組大鼠的AaDO2和RI、LPS高于Sham組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); U50488H組的AaDO2和RI、LPS低于CPB組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖2。

A: 各組大鼠的EVLW; B: 各組大鼠的A-aDO2; C: 各組大鼠的RI; D: 各組大鼠的LPS。與Sham 組比較, *P<0.05; 與CPB組比較, #P<0.05。圖2 各組大鼠的EVLW、LPS、A-aDO2和RI比較

2.3 血漿TNF-α、IL-6和IL-4水平的變化

U50488H組與Sham組的血漿TNF-α、IL-6和IL-4水平比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與Sham組比較, CPB組的血漿TNF-α和IL-6水平增高,IL-4水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與CPB組比較, U50488H組TNF-α和IL-6水平降低, IL-4水平增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖3。

A: 各組TNF-α水平; B: 各組 IL-6水平; C: 各組IL-4水平。與Sham組比較, *P<0.05; 與CPB組比較, #P<0.05。圖3 各組大鼠TNF-α、IL-6和IL-4水平比較

2.4 肺組織iNOS和CD206水平的變化

U50488H組與Sham組大鼠肺組織iNOS、CD206和F4/80免疫熒光共定位表達比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05); 與Sham組比較, CPB組大鼠肺組織iNOS和F4/80免疫熒光共定位表達增高, CD206和F4/80免疫熒光共定位表達降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖4。

A: 大鼠肺組織iNOS水平; B: 大鼠肺組織CD206水平。圖4 各組大鼠肺組織iNOS和CD206水平比較

3 討 論

CPB心臟手術后急性肺損傷的危險因素主要為全身炎癥反應綜合征和缺血/再灌注損傷。高齡、術前心功能不全、術中輸血、長時間轉機等因素均是導致CPB術后急性肺損傷的危險因素[7]。心臟手術后患者均有不同程度的肺功能減退,輕者表現(xiàn)為一過性的亞臨床癥狀,約2%的重者表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS), 其病死率高達50%[8]。

巨噬細胞的活化和極化對維持肺組織的免疫穩(wěn)態(tài)起著關鍵作用,有效控制巨噬細胞的活化和分化,有助于調(diào)節(jié)ALI時肺組織炎癥與抗炎之間的平衡[9-12]。肺靜息巨噬細胞(M0)可被極化成促炎M1表型或抗炎M2表型。在ALI的發(fā)病機制中,潴留的肺泡巨噬細胞向M1表型轉變,從而分泌大量的促炎細胞因子。在治療階段結束時,巨噬細胞可以從M1轉變?yōu)榭寡譓2表型,從而減輕炎癥反應,加速肺恢復,抑制肺損傷[13-14]。KOR由380個氨基酸組成,是阿片類受體的一個亞型,屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族。本課題組前期研究[4]發(fā)現(xiàn), KOR激動劑預處理,可以減輕CPB后缺血再灌注損傷和全身炎性反應程度,降低肺泡上皮的通透性,對肺上皮屏障起到一定的保護作用,但U50488H對巨噬細胞極化的調(diào)節(jié)作用仍不清楚。

EVLW是ALI的關鍵指標之一,其是肺間質(zhì)和肺泡間隙液體的標志物[15]。本研究結果顯示, CPB組大鼠的EVLW含量顯著高于Sham組, U50488H預處理降低了CPB大鼠的EVLW水平。與Sham組相比, CPB組在CPB后0、1、2 h的A-aDO2和RI升高; CPB后0、1、2 h, U50488H組的AaDO2和RI、LPS低于CPB組。此外,本研究使用ELISA分析大鼠血漿中LPS含量的變化,結果顯示, CPB組LPS高于Sham組, U50488H組LPS顯著低于CPB組。采用HE染色檢測大鼠肺組織的組織學變化,結果表明, CPB組大鼠出現(xiàn)了嚴重的肺損傷和肺泡內(nèi)充血/出血,并伴有廣泛的炎癥細胞浸潤, U50488H組大鼠肺損傷顯著減輕。上述結果均提示KOR激動劑U50488H可減輕CPB后大鼠的ALI。

M1型巨噬細胞高表達iNOS、CD11c、CD16等因子,其可促進炎癥發(fā)展,加劇免疫反應; M2型巨噬細胞高表達CD206、Arg1等因子,其在抗炎、組織修復中發(fā)揮重要作用[16]。本研究進一步剖析了U50488H在CPB大鼠肺巨噬細胞極化中的調(diào)節(jié)作用。免疫熒光測定結果顯示, U50488H預處理有助于降低iNOS水平和升高CD206水平。本研究結果顯示, CPB術后大鼠血漿TNF-α和IL-6水平(M1巨噬細胞相關生物標志物)顯著升高,血漿IL-4水平(M2巨噬細胞相關生物標記物)顯著降低。反之, U50488H預處理后, TNF-α和IL-6的水平顯著降低, IL-4的水平顯著升高。

綜上所述, KOR激動劑U50488H可促進CPB后大鼠肺巨噬細胞向M2表型極化,減輕炎癥反應,增加抗炎因子釋放,進而減輕CPB后ALI的發(fā)生發(fā)展,但其調(diào)節(jié)巨噬細胞極化的具體機制尚需進一步探討。