UPLC-MS/MS法測定心可舒膠囊中木香烴內酯與去氫木香內酯的含量*

吳洋生 蔣 玲 周云峰 黃招光△

心可舒膠囊由葛根、山楂、三七、丹參和木香5味中藥組成,具有活血化瘀、行氣止痛的功效[1],臨床主要用于治療氣滯血瘀型冠心病引起的頭痛、胸悶、高血壓病、心絞痛、頭暈、頸項疼痛及心律失常、高血脂等癥[2,3]。心可舒膠囊方中木香為佐使藥,具有行氣止痛的功效[4],其主要的代表性成分為木香烴內酯與去氫木香內酯,屬于倍半萜內酯類化合物,具有抗炎、抗腫瘤、降血糖、解痙等作用[5-8]。心可舒膠囊的現行標準為《藥品標準·中藥成方制劑》[2],該標準只對木香進行薄層鑒別,方法專屬性不高,可能無法有效知悉木香的真實投料情況,有必要對其含量測定方法進行研究。目前,涉及心可舒膠囊含量測定的研究主要集中在葛根[9]、山楂[10]、三七[11]、丹參[1],而對該制劑中木香的含量方法的報道甚少,基于此,本研究首次采用UPLC-MS/MS法建立木香中木香烴內酯與去氫木香內酯的含量測定法,報道如下。

1 儀器與材料

沃特世H-class超高效液相-xevo TQD三重串聯四級桿質譜系統(美國waters公司);KH-250DB超聲波清洗儀(昆山禾創超聲儀器有限公司)。

木香烴內酯(批號:111524-201208,純度:99.5%)、去氫木香內酯對照品(批號:111525-201912,純度:99.5%)、木香對照藥材(批號:120921-202010)購于中國食品藥品檢定研究院;山楂(批號:220301,安徽民順堂中藥科技有限公司)、丹參(批號:220801,江西九州堂中藥飲片有限公司)、三七(批號:190801,湖南省松齡堂中藥飲片有限公司)、葛根(批號:220901,江西九州堂中藥飲片有限公司)用于制備缺木香的陰性樣品;乙腈、甲醇、甲酸為色譜純,水為屈臣氏蒸餾水。心可舒膠囊樣品(市售3批,來源于四川百草堂龍人藥業有限公司,規格為0.3 g/粒)。

2 方法與結果

2.1 檢測條件0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B)為流動相,梯度洗脫(0～2 min,20%B～20%B;2～6 min,20%B～80%B;6～9 min,80%B～80%B;9～10 min,80%B～20%B;10～13 min,20%B～20%B),流速0.3 ml/min;色譜柱:Waters ACQUITY UPLC?BEH C18;柱溫:35 ℃;進樣量:2 μl。質譜條件為電噴霧離子源ESI、多反應監測模式(MRM)、正離子電離模式;毛細管電壓為0.5 kV,錐孔電壓為24 V,霧化氣流速為900 L/h,溫度 550 ℃;木香烴內酯檢測離子對m/z 233→105、m/z 233→187、m/z 233→215;去氫木香內酯檢測離子對m/z 231→128、m/z 231→143、m/z 231→185。

2.2 對照品溶液取木香烴內酯、去氫木香內酯對照品適量,精密稱定,加甲醇溶解配成含木香烴內酯2.1498 μg/ml、去氫木香內酯2.1970 μg/ml的對照品混合母液。

2.3 供試品溶液取裝量差異項下的樣品約0.3 g,精密稱定,置于250 ml錐形瓶中,精密加入100 ml甲醇,稱定重量,常溫超聲處理35 min,放冷至室溫,用甲醇補充減失的重量,搖勻,濾過,精密量取續濾液5～50 ml量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,即得。

2.4 陰性樣品溶液取木香的陰性樣品約0.3 g,按2.3項下方法制備陰性樣品溶液。

2.5 對照藥材溶液取木香對照藥材約25 mg,按2.3項下方法制備對照藥材溶液。

2.6 標準曲線精密量取對照品混合母液1 ml、2 ml、5 ml、15 ml、25 ml分別置50 ml量瓶中,加甲醇稀釋配制成一系列濃度的對照品溶液,按照2.1項下檢測條件測定,記錄峰面積,以對照品濃度為橫坐標(X),以峰面積為縱坐標(Y)繪制標準曲線得出木香烴內酯的回歸方程為Y=25386X+1057.2,R2=0.9913;去氫木香內酯的回歸方程為Y=5036.9X+331.6,R2=0.9946。

2.7 專屬性分別取陰性樣品溶液、木香對照藥材溶液、供試品溶液、對照品溶液各2 μl,依次進行檢測,采集MRM圖。結果顯示,供試品溶液出現與木香對照藥材溶液、對照品溶液保留時間一致的色譜峰,而在陰性樣品溶液的色譜中均未有與木香烴內酯和去氫木香內酯對照品溶液保留時間一致的離子峰,說明該2種成分歸屬于木香藥味,且該制劑中其他藥味成分對測定無影響,專屬性良好。見圖1。

圖1 總離子流色譜圖

2.8 精密度 重復性 穩定性取一份木香烴內酯濃度為0.2150 μg/ml、去氫木香內酯濃度為0.2197 μg/ml的對照品溶液,連續進樣6次,記錄峰面積,木香烴內酯和去氫木香內酯的峰面積RSD分別為1.6%和2.0%;平行稱取6份樣品(批號:01221101),制備供試品溶液,測定含量,木香烴內酯和去氫木香內酯的RSD為3.6%和2.2%;取重復性項下的一份供試品溶液,在0 h、2 h、4 h、8 h、16 h測定峰面積,木香烴內酯和去氫木香內酯的RSD分別為4.9%和4.0%。

2.9 加標回收平行稱取6份樣品(批號:01221101),每份約0.15 g,精密稱定,置于250 ml錐形瓶中,精密加入混合對照品溶液4 ml(木香烴內酯濃度為0.2150 mg/ml,去氫木香內酯濃度為0.2197 mg/ml),再精密加入甲醇96 ml,按2.3項下方法制備加標樣品溶液,計算回收率結果。見表1。

表1 加標回收率

2.10 樣品結果取該廠家3批心可舒膠囊,每批稱取2份平行樣,分別按照2.3項下方法制備供試品溶液,含量測定結果見表2。

表2 心可舒膠囊中木香烴內酯和去氫木香內酯含量結果

3 討論

UPLC-MS/MS技術具有靈敏度高、分析速度快、選擇性強等特點,在中藥質量控制,尤其是定量測定方面越來越發揮著至關重要的作用[12,13]。本實驗初期采用水和乙腈、水和甲醇作為流動相,以正、負離子掃描模式分別對木香烴內酯和去氫木香內酯的質譜響應進行摸索,發現該2種成分的響應強度均較低且出現峰形拖尾情況,而在水相中加入了0.1%甲酸后,木香烴內酯和去氫木香內酯在正離子掃描模式下出現較高響應,且色譜峰峰形尖銳對稱,考慮到乙腈具有較好的分離性,最終選擇0.1%甲酸水溶液-乙腈為流動相,并以梯度洗脫方式減少極性和非極性雜質在色譜柱中的殘留及對測定的干擾。

木香烴內酯檢測離子對為m/z 233→187,去氫木香內酯檢測離子對為m/z 231→185,其裂解規律為在正離子電離模式下,木香烴內酯的母離子為m/z 233[M+H]+,失去一分子甲酸得到子離子m/z 187[M+H-HCOOH]+;去氫木香內酯的母離子為m/z 231[M+H]+,失去一分子甲酸產生子離子m/z 185[M+H-HCOOH]+。

木香烴內酯和去氫木香內酯不溶于水,可溶于甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮等溶劑中,綜合考慮溶劑的揮發性、對儀器系統的兼容性和穩定性等因素,選擇甲醇作為樣品的提取溶劑。木香烴內酯和去氫木香內酯具有熱不穩定性,采用加熱回流等方式提取可能會使上述2種成分加速水解,影響結果準確性,故直接考察在常溫下(不高于25 ℃)超聲時間對提取效果的影響,通過比較不同超聲時間發現35 min后木香烴內酯和去氫木香內酯即可提取完全。

從含量測定結果可知,各批次樣品中木香烴內酯和去氫木香內酯的含量差異較小,含量均一性較好,說明該企業的生產工藝較穩定,且木香藥味的進貨來源相對可控。

綜上所述,本研究所建立的UPLC-MS/MS法快速、準確,可用于測定心可舒膠囊中木香烴內酯和去氫木香內酯的含量,對控制木香藥味的質量具有重要作用。