NTN4對腎透明細胞癌的臨床應用價值

楊廣建

山東省聊城市人民醫院檢驗科,山東聊城 252000

腎癌是泌尿系統常見腫瘤之一,且發病率呈逐年上升趨勢,腎透明細胞癌(ccRcc)是最常見的腎癌類型,占原發性腎癌的60%～80%[1]。由于ccRcc對化療藥物不敏感,所以局灶性ccRcc主要的治療方式為手術切除,這也導致ccRcc晚期患者的治療方式有限[2]。近年來,隨著對ccRcc分子生物學和遺傳學的深入研究,ccRcc靶向治療和免疫檢查點抑制劑治療取得了多項突破和重大進展[1]。目前,晚期ccRcc的治療方式已經從既往經典的靶向治療發展到靶向免疫聯合治療[3]。然而,聯合治療會增加患者不良反應管理難度和經濟負擔[2]。因此,深入研究ccRcc的病理、生理機制,發現新的生物標志物和治療靶點,對早期診斷、治療和改善ccRcc患者的預后具有重要意義。神經導向因子4(NTN4)最初被認為是神經元發育過程中分泌的層粘連蛋白樣軸突引導蛋白,在除中樞神經系統外的非神經細胞中廣泛表達,并通過調節多種細胞功能從而影響組織發育和腫瘤進展[4]。已有研究證明NTN4可參與多種腫瘤的進展和轉移過程,并且根據不同癌癥類型表現出“促腫瘤”和“抑腫瘤”的雙重作用[5],有望成為診斷腫瘤、預測預后的生物標志物。迄今為止,NTN4在ccRcc發生、發展中的作用及其病理、生理機制,以及其表達水平與臨床特征的關系尚未明確。因此,有必要探討NTN4在ccRcc的病理、生理機制,以及其參與腫瘤調控的相關通路,尋找其上下游的關鍵調節因子。本研究以NTN4作為切入點,尋找ccRcc新的治療靶點,如開發其上下游關鍵因子的抑制劑或激動劑以達到治療目的。本研究分析了NTN4在ccRcc組織中的表達水平變化及其可能的調控機制,以及NTN4與臨床病理特征的關系,評估了其對ccRcc的臨床應用價值,構建了預后預測模型。此外,本研究進行了基因集富集分析(GSEA),從功能角度探討了NTN4參與調控ccRcc發生、發展的潛在機制。現報道如下。

1 資料與方法

1.1數據來源 從TCGA數據庫(http://cancergenome.nih.gov/)下載并整理ccRcc項目STAR流程的RNAseq數據,提取標準化后TPM(每千個堿基轉錄每百萬映射讀取的轉錄本)格式的數據(2023年3月下載的最新發布數據),同時下載ccRcc患者的臨床數據。整合相關數據[NTN4的信使RNA(mRNA)表達水平、患者生存狀態、隨訪時間、年齡、性別、組織學分級、病理學分期、腫瘤大小及局部浸潤范圍(T分期)、淋巴結受累程度(N分期)、遠處轉移情況(M分期)],去除重復及無臨床信息的樣本。

1.2方法

1.2.1NTN4蛋白表達水平分析 利用UALCAN數據庫(http://ualcan.path.uab.edu)分析正常腎臟組織和ccRcc組織中NTN4蛋白表達水平的差異。利用HPA數據庫(https://www.proteinatlas.org/)查詢NTN4蛋白在正常腎臟組織與ccRcc組織中的免疫組織化學染色結果。

1.2.2GSEA 為了探討NTN4在ccRcc組織中的潛在機制,本研究進行了NTN4基因表達水平與其他基因的Pearson相關分析,根據相關性對基因進行排序。從GSEA官方網站(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)下載“c2.cp.kegg.v2023.1.Hs.symbols”作為參考基因集。用clusterProfiler包(4.6.2版本)進行GSEA,P校正方法為Benjamini &Hochberg法。篩選顯著富集的基因集(校正后P<0.05和控制錯誤發現率q<0.05)。

1.2.3NTN4啟動子甲基化水平分析 利用UALCAN數據庫(https://ualcan.path.uab.edu)分析正常腎臟組織和ccRcc組織中NTN4啟動子甲基化水平的差異。以Beta值表示DNA甲基化水平,范圍從0～1,Beta值越高表示啟動子甲基化水平越高。

1.2.4NTN4表達分組的最佳截斷值選擇 使用survminer包的surv_cutpoint()函數確定NTN4表達水平的最佳截斷值,并以此為截點將患者分為NTN4高表達組與NTN4低表達組。

1.2.5預后模型構建及驗證 使用survival包進行比例風險假設檢驗并進行Cox回歸分析,篩選出獨立危險因素,使用rms包構建列線圖模型、Calibration校正曲線(每次重復抽樣的樣本量為200例,抽樣次數為200次),并分別進行可視化分析[6]。

2 結 果

2.1ccRcc組織、癌旁組織中NTN4的mRNA表達水平比較 從TCGA數據庫中篩選出72例癌旁組織和533例ccRcc組織樣本數據(其中72例樣本為配對組織)。533例ccRcc組織中NTN4的mRNA表達水平(6.05±1.30)低于癌旁組織(7.83±0.88),差異有統計學意義(t=10.53,P<0.05);72例配對ccRcc組織中NTN4的mRNA表達水平(6.36±1.27)低于癌旁組織(7.83±0.88),差異有統計學意義(t=8.28,P<0.05)。

2.2ccRcc組織、正常腎臟組織的NTN4蛋白表達水平比較 UALCAN數據庫分析結果顯示,ccRcc組織中NTN4蛋白表達水平[0.000(-0.690～0.811)]低于正常腎臟組織[2.087(1.789,2.537)],差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3NTN4蛋白在正常腎臟組織與ccRcc組織中的免疫組織化學染色結果比較 HPA數據庫中免疫組織化學染色結果顯示,正常腎臟組織中腎小管細胞抗體染色程度為中度水平,腎小球細胞抗體染色程度為低水平;ccRcc組織中抗體染色均為陰性。見圖1。

注:A為正常腎臟組織的免疫組織化學染色結果;B為ccRcc組織的免疫組織化學染色結果。

2.4NTN4低表達組和NTN4高表達組ccRcc患者不同臨床病理特征分布情況比較 經survminer包的surv_cutpoint()函數確定NTN4表達水平的最佳截斷值為5.496,并以此為截點將患者分為NTN4高表達組(384例)與NTN4低表達組(149例)。NTN4低表達組和NTN4高表達組ccRcc患者組織學分級、病理學分期、T分期、M分期情況比較,差異均有統計學意義(P<0.05);而年齡、性別、N分期比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 NTN4低表達組和NTN4高表達組ccRcc患者不同臨床病理特征分布情況比較[n(%)]

2.5NTN4對ccRcc的診斷及患者預后的預測價值 ROC曲線分析結果顯示,NTN4診斷ccRcc患者的曲線下面積為0.881(95%CI:0.847～0.916),最佳截斷值為6.68,靈敏度為0.65,特異度為0.94。NTN4低表達組存活69例,死亡80例。NTN4高表達組存活289例,死亡95例。Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示,NTN4高表達組ccRcc患者的預后情況優于NTN4低表達組ccRcc患者(Log-Rankχ2=39.94,P<0.05)。見圖2、3。

圖2 NTN4診斷ccRcc的ROC曲線

圖3 NTN4預測ccRcc患者預后不良的Kaplan-Meier生存曲線

2.6影響ccRcc患者預后的單因素與多因素Cox回歸分析 533例患者中,存活358例,死亡175例。單因素Cox回歸分析結果顯示,NTN4的表達水平、年齡、組織學分級、T分期、N分期、M分期、病理學分期是ccRcc患者預后的影響因素(P<0.05)。以生存狀態作為因變量(死亡=1,存活=0),將單因素Cox回歸分析中差異有統計學意義的T分期(T1和T2=0,T3和T4=1)、N分期(N0=0,N1=1)、M分期(M0=0,M1=1)、組織學分級(G1和G2=0,G3和G4=1)、病理學分期(Ⅰ期和Ⅱ期=0,Ⅲ期和Ⅳ期=1)、年齡(≤60歲=0,>60歲=1)、NTN4(低表達=0,高表達=1)作為自變量,納入多因素Cox回歸分析,結果顯示,NTN4低表達、年齡>60歲、M分期為M1是ccRcc患者預后不良的獨立危險因素(P<0.05)。見表2。

表2 影響ccRcc患者預后的單因素與多因素Cox回歸分析

2.7ccRcc組織和正常腎臟組織NTN4的Beta值比較及GSEA ccRcc組織NTN4的Beta值[0.043(0.037,0.050)]高于正常腎臟組織[0.033(0.029,0.040)],差異有統計學意義(P<0.05)。GSEA結果顯示,NTN4相關基因主要富集到RNA剪接、胞吞作用、泛素介導的蛋白質降解、神經營養因子信號通路等相關途徑。

2.8構建列線圖預測模型 納入NTN4表達、年齡、M分期構建列線圖模型,并繪制Calibration校準曲線,結果顯示,列線圖模型的C-index為0.728(95%CI:0.709～0.747,P<0.05)。見圖4、5。

圖4 預測ccRcc患者預后的列線圖模型

圖5 列線圖模型的Calibration校準曲線

3 討 論

NTN4在組織發育和腫瘤進展中發揮重要作用,已被證明通過多種信號通路影響腫瘤的發生與發展過程。然而,NTN4的具體功能可能取決于疾病類型[5],例如,在胃癌中,NTN4通過受體激活JAK/Stat3、Akt/PI3K和ERK/MAPK信號通路促進胃癌細胞的增殖和侵襲[7];在結直腸癌中,NTN4結合其受體介導抗腫瘤血管生成,從而抑制腫瘤生長及侵襲[8];在乳腺癌中,NTN4通過抑制上皮-間質轉化,降低基底膜剛度,阻斷Wnt/β-catenin通路抑制乳腺癌的發生和發展[5]。盡管有上述這些研究,但NTN4在ccRcc組織中的表達水平及其臨床意義仍不清楚。因此,本研究運用高通量數據結合多組學技術,探討了NTN4在ccRcc組織中的表達水平,分析了其對ccRcc患者預后的預測價值及NTN4在ccRcc中的潛在機制。

本研究結果顯示,相比于癌旁、正常腎臟組織,ccRcc組織中NTN4的mRNA表達水平和蛋白表達水平均下降,差異均有統計學意義(P<0.05)。NTN4啟動子甲基化水平分析結果顯示,相比于正常腎臟組織,ccRcc組織中NTN4的Beta值升高,提示ccRcc組織中NTN4啟動子甲基化水平升高,而啟動子甲基化通常可以抑制轉錄,在一定程度上解釋了ccRcc組織中NTN4表達水平降低的原因。ROC曲線分析結果顯示,在將6.68作為最佳截斷值的情況下,NTN4診斷ccRcc的靈敏度為0.65,而特異度高達0.94,說明NTN4檢出ccRcc患者的能力一般,而排除患者的能力較強。因此,可以將檢測NTN4表達水平作為排除診斷予以應用,同時NTN4也可聯合其他指標輔助診斷ccRcc。另外,本研究結果顯示,NTN4低表達組和NTN4高表達組ccRcc患者組織學分級、病理學分期、T分期、M分期情況比較,差異均有統計學意義(P<0.05),Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示,NTN4高表達組ccRcc患者的預后情況優于NTN4低表達組(P<0.05)。單因素與多因素Cox回歸分析結果也顯示,NTN4低表達、年齡>60歲、M分期為M1是ccRcc患者預后不良的獨立危險因素(P<0.05)。本研究納入上述3個獨立危險因素構建了列線圖預測模型,并繪制了Calibration校準曲線進行模型驗證,結果顯示,該模型C-index可達到0.728,表明該模型可較準確地預測ccRcc患者的預后,表現出良好的臨床適用性。提示NTN4可能在ccRcc的發生、發展中具有重要的調控作用,因此,本研究進行了GSEA,結果顯示,NTN4可通過多種途徑參與調控ccRcc的進展,如RNA剪接、胞吞作用、泛素介導的蛋白質降解、神經營養因子信號通路等。為揭示NTN4在ccRcc組織中發揮調控作用的潛在機制提供了方向。近年的研究表明,選擇性剪接失調不是癌癥的偶然關聯,而是一種幾乎普遍存在的基本分子特征,在腫瘤發生、發展過程中發揮重要作用。癌癥相關剪接失調可通過多種機制促進腫瘤發生,包括促進細胞增殖、減少細胞凋亡、增強細胞遷移和轉移潛能、抵抗化療和免疫逃逸等[9-10]。有研究表明,異質核核糖核蛋白A1介導的含卷曲螺旋結構域蛋白50選擇性剪接通過鋅指蛋白395促進ccRcc的進展[11]。胞吞作用已經從最初的營養吸收途徑演化為復雜的多種胞吞途徑,在營養供應、黏附、信號傳導和細胞遷移等的調控中起重要作用,也可以影響藥物穩定性、治療效果及免疫細胞功能。紊亂的胞吞作用具有致癌潛力,涉及癌癥的發生、發展和調節[12-13]。細胞胞吞途徑的改變可改變細胞功能,影響腫瘤的許多特征。在腫瘤細胞中,每一種胞吞途徑都可能失調,而不同類型腫瘤中的這些變化是異質性和復雜的。有研究報道,內吞介導的氨基酸補充促進嫌色腎癌的癌細胞增殖和存活[14]。神經系統分布于全身,對運動、感覺、器官和組織的發育、穩態、再生及可塑均具有重要調控作用[15-16],表明神經系統對癌癥表型具有類似的調控作用。一系列惡性腫瘤的各種臨床前模型表明,神經系統活動可以控制癌癥的發生,并有力地影響癌癥的進展和轉移。同時,癌癥也會重塑和劫持神經系統的結構和功能[17]。在胰腺導管腺癌(PDAC)小鼠模型中觀察到腫瘤交感神經控制釋放的慢性應激誘導的去甲腎上腺素刺激PDAC細胞中表達的β2腎上腺素能受體,從而促進神經生長因子和腦源性神經營養因子的表達和分泌,產生自分泌和旁分泌效應,共同加速腫瘤發生[15]。蛋白質穩態包括獲得正確的蛋白結構、定位和具有更高秩序的復合物,以及合適的蛋白水平,其對細胞功能至關重要,錯誤定位、含量過度或因錯誤折疊或其他損傷導致的異常都會損傷細胞。由泛素介導的蛋白降解系統(UPS)是調節蛋白穩態的關鍵過程,其紊亂可導致易發包括腫瘤在內的多種疾病。有研究人員認為,通過UPS中降解決定子突變和E3泛素連接酶突變可能參與至少10%的多系統腫瘤的發生和進展[18-19]。另外有研究表明,蛋白酶體亞基通過泛素化降解IκBα蛋白,激活核因子-κB信號轉導通路,從而影響ccRcc的惡性進展[20]。前面的分析顯示NTN4在ccRcc中表現出“抑腫瘤”作用,作用機制可能為在生理濃度下NTN4通過相應結構域結合其配體,抑制下游“促腫瘤”信號通路(如在乳腺癌中,NTN4通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路抑制乳腺癌的發生和發展)或維持“抑腫瘤”信號通路激活,維持機體正常代謝。啟動子DNA甲基化可影響轉錄并參與腫瘤形成。而在ccRcc組織中,NTN4啟動子甲基化水平明顯升高,抑制NTN4表達,導致RNA剪接失調、胞吞作用紊亂、泛素介導的蛋白質降解異常、神經營養因子信號通路障礙等,各種因素共同導致NTN4不能發揮其“抑腫瘤”作用,從而造成ccRcc的發生與發展。因此,可以NTN4為切入點,尋找新的ccRcc治療靶點,如尋找導致NTN4啟動子甲基化水平升高的關鍵因子[21],開發關鍵甲基轉移酶的抑制劑或去甲基化酶的激動劑,降低其甲基化水平,提高NTN4表達水平;探尋NTN4下游通路的關鍵因子,開發其激動劑或抑制劑,抑制“促腫瘤”信號通路或激活“抑腫瘤”信號通路,從而達到抑制腫瘤發生、發展的目的。然而,NTN4上下游的關鍵調節因子仍未明確,其如何通過上述信號通路影響ccRcc的發生與進展的具體機制仍需進一步研究。

綜上所述,NTN4在ccRcc組織中的表達水平下降,與臨床特征密切相關,而且可以作為預測ccRcc患者預后的生物標志物。構建的預測模型具有較好的準確度與臨床應用價值。另外,也為ccRcc尋找新的治療靶點提供了理論支持和方向。然而,本研究所用的數據來源于公共數據庫,尚缺少基礎試驗的驗證,存在一定的局限性。盡管如此,仍為NTN4在ccRcc組織中的作用機制提供了新的研究思路。