Sirt1對高糖誘導的足細胞外泌體釋放的影響

丁琳　周燕　劉珊珊　劉南池　馬瑞霞

［摘要］目的探討煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的去乙酰化酶1（Sirt1）對高糖誘導的足細胞外泌體釋放的影響。方法將永生化小鼠足細胞MPC5分為正常糖組（5.5 mmol/L葡萄糖，A組）、高滲組（5.5 mmol/L葡萄糖＋24.5 mmol/L甘露醇，B組）、高糖組（30.0 mmol/L葡萄糖，C組）、高糖＋Sirt1過表達慢病毒轉染組（Sirt1過表達慢病毒轉染＋30.0 mmol/L葡萄糖，D組）、高糖＋陰性慢病毒轉染組（陰性慢病毒轉染＋30.0 mmol/L葡萄糖，E組）、高糖＋外泌體分泌抑制劑組（GW4869＋30.0 mmol/L葡萄糖，F組）6組。采用免疫印跡法檢測各組細胞Sirt1、足細胞裂孔膜蛋白（Nephrin、Podocin）及CD63、CD81、Alix的表達水平，采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測D、E組細胞Sirt1 mRNA表達水平，使用透射電子顯微鏡觀察足細胞外泌體形態，采用納米粒子跟蹤分析技術檢測外泌體的粒徑和濃度。結果RT-qPCR結果顯示，D組足細胞Sirt1 mRNA相對表達量顯著高于E組（t=14.580，P<0.01）。納米粒子跟蹤分析及免疫印跡結果顯示，A～C組間足細胞Sirt1、Nephrin和Podocin蛋白相對表達量比較差異均具有顯著性（F=49.84～106.40，P<0.01）；與A組相比，C組足細胞外泌體分泌顯著增加（t=14.550，P<0.01），Nephrin、Podocin、Sirt1相對表達量顯著減少（t=7.446～15.110，P<0.01）；與E組相比，D組足細胞外泌體分泌顯著減少（t=74.610，P<0.01），Nephrin、Podocin、Sirt1相對表達量顯著增加（t=4.657～32.860，P<0.05）；與C組相比，F組足細胞外泌體分泌顯著減少（t=16.300，P<0.05），Nephrin、Podocin相對表達量顯著增加（t=3.790、8.151，P<0.01），Sirt1表達水平無統計學差異（P>0.05）。結論高糖誘導的足細胞Sirt1減少可促進外泌體分泌及足細胞損傷。

［關鍵詞］糖尿病腎病；血糖；足細胞；外泌體；抗衰老酶1

［中圖分類號］R587.24［文獻標志碼］A

Effect of Sirt1 on high glucose-induced exosome release from podocytes? DING Lin， ZHOU Yan， LIU Shanshan， LIU Nanchi， MA Ruixia（Department of Nephrology， The Affiliated Hospital of Qingdao Univesity， Qingdao 266003， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effect of nicotinamide adenine dinucleotide-dependent deacetylase 1 （Sirt1） on high glucose-induced exosome release from podocytes. MethodsImmortalized mouse podocytes MPC5 were divided into six groups： normal glucose group （5.5 mmol/L glucose， group A）， high mannitol group （5.5 mmol/L glucose+24.5 mmol/L mannitol， group B）， high glucose group （30.0 mmol/L glucose， group C）， high glucose+Sirt1-overexpressed lentivirus transfection group （Sirt1-overexpressed lentivirus transfection+30.0 mmol/L glucose， group D）， high glucose+negative lentivirus transfection group （negative lentivirus transfection+30.0 mmol/L glucose， group E）， and high glucose+exosome secretion inhibitor group （GW4869+30.0 mmol/L glucose， group F）. Western blot was used to analyze the expression levels of Nephrin， Podocin， Sirt1， CD63， CD81， and Alix in each group. Real-time quantitative polymerase chain reaction was used to analyze the expression level of Sirt1 mRNA in D and E group. The morphology of podocyte exosomes was observed by a transmission electron microscope. The particle size and concentration of exosomes were determined by nanoparticle tracking analysis. ResultsThe results of RT-qPCR showed that the relative expression of Sirt1 mRNA was significantly increased in group D compared with that in group E （t=14.580，P<0.01）. The results of nanoparticle tracking analysis and Western blot showed that the relative expression of Sirt1， Nephrin， and Podocin proteins in podocytes among groups A to C was significantly different （F=49.84-106.40，P<0.01）. Compared with group A， group C had significantly increased secretion of podocyte exosomes （t=14.550，P<0.01） and significantly reduced expression of Sirt1， Nephrin， and Podocin （t=7.446-15.110，P<0.01）. Compared with group E， group D had significantly reduced release of podocyte exosomes （t=74.610，P<0.01） and significantly increased relative expression of Sirt1， Nephrin， and Podocin （t=4.657-32.860，P<0.05）. Compared with group C， group F had significantly reduced release of podocyte exosomes （t=16.300，P<0.05） and significantly increased relative expression of Nephrin and Podocin （t=3.790，8.151，P<0.01）， but showed no significant change in the expression level of Sirt1 （P>0.05）. ConclusionLoss of Sirt1 in high glucose-treated podocytes promotes exosome secretion and podocyte injury.

［KEY WORDS］Diabetic nephropathies; Blood glucose; Podocytes; Exosomes; Sirtuin

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見并發癥，已成為導致慢性腎臟病和終末期腎病的首要原因[1]。DN以腎小球肥大、腎小球基底膜增厚、系膜區擴張、足細胞損傷為特征性表現，其中足細胞損傷是DN發病的中心環節[2]。外泌體是細胞主動分泌的直徑約為50～150 nm的均一膜性囊泡結構，其可攜帶豐富的生物活性分子，能夠在可溶性分子之外介導細胞間新型對話[3]。既往研究發現在高糖環境刺激下，足細胞分泌外泌體增加，但其具體機制尚不清楚[4]。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的去乙酰化酶1（Sirt1）是去乙酰化酶家族成員，可促進高糖環境下腎臟細胞穩態，對DN發病時的腎細胞氧化應激、細胞凋亡、腎組織炎癥、腎臟纖維化等有改善作用[5]。但Sirt1是否影響DN足細胞外泌體分泌目前尚無研究報道。本研究擬通過體外實驗闡明Sirt1在DN足細胞外泌體分泌中的作用。

1材料與方法

1.1細胞、試劑與儀器

永生化小鼠足細胞MPC5由東南大學腎臟病研究所惠贈。ECL化學發光底物購買于北京Biosharp公司，IFN-γ購自美國PeproTech公司，慢病毒購買于上海吉瑪基因，直標抗體GAPDH、β-actin購買于上海Abway公司，Sirt1、Nephrin抗體購自英國Abcam公司，Podocin抗體購自美國Invitrogen公司，CD63、CD81、Alix抗體購買于上海Santa Cruz公司。Nano-drop 2000購買于美國Thermo Fisher公司，逆轉錄儀購自德國Eppendorf公司。

1.2足細胞分組與處理

足細胞MPC5復蘇后以Mundel法[6]培養，分為以下6組：①正常糖組（A組）：在含5.5 mmol/L葡萄糖的RPMI 1640培養基當中培養48 h；②高滲組（B組）：在含5.5 mmol/L葡萄糖和24.5 mmol/L甘露醇的RPMI 1640培養基中培養48 h；③高糖組（C組）：在含30.0 mmol/L葡萄糖的RPMI 1640培養基中培養48 h；④高糖＋Sirt1過表達慢病毒轉染組（D組）：足細胞轉染Sirt1過表達慢病毒后，在含30.0 mmol/L葡萄糖的RPMI 1640培養基中培養48 h；⑤高糖＋陰性慢病毒轉染組（E組）：足細胞轉染陰性慢病毒后在含30.0 mmol/L葡萄糖的RPMI 1640培養基中培養48 h；⑥高糖＋外泌體分泌抑制劑組（F組）：在含有30.0 mmol/L葡萄糖的RPMI 1640培養基中加GW4869后培養48 h。

1.3足細胞外泌體提取與鑒定

將A、C、D、E、F組足細胞在不含胎牛血清的培養基中培養48 h后，分別收集等量細胞上清液，使用差速離心法[7]分離足細胞外泌體。使用透射電子顯微鏡觀察外泌體形態，然后使用納米粒子跟蹤分析（NTA）技術檢測外泌體粒徑和濃度。

1.4免疫印跡法檢測各組足細胞Nephrin、Podocin、Sirt1及外泌體相關標記蛋白相對表達量

RIPA裂解液、PMSF、堿性磷酸酶抑制劑按照100∶1∶1比例配置后用于提取各組培養48 h的足細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白的濃度，在提取的總蛋白中加入上樣緩沖液和雙蒸水，制成等濃度等體積的蛋白樣本，充分混勻，100 ℃水浴加熱5 min。將處理好的蛋白樣本經聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移至聚偏氟乙烯膜上，以快速封閉液室溫封閉15 min以后，分別加入一抗（Nephrin、Podocin、Sirt1、CD63、CD81及Alix以1∶1 000稀釋，直標GAPDH、β-actin以1∶10 000稀釋）4 ℃孵育過夜。洗膜后加入對應的二抗（以1∶3 000稀釋），室溫孵育1 h，再洗膜以后使用超敏ECL化學發光液顯影。采用Image J軟件檢測各個目的條帶的灰度值，以β-actin為內參蛋白，計算各目標蛋白相對表達量。每組實驗重復3次，結果取均值。

1.5RT-qPCR法檢測D、E組足細胞Sirt1 mRNA表達水平

提取D、E組培養48 h的足細胞總RNA后，用Nano-drop 2000檢測兩組足細胞RNA的濃度和純度，用HiScript Ⅲ RT SuperMix在逆轉錄儀中逆轉錄成mRNA，然后在7300 RT-qPCR檢測系統中使用PCR試劑盒進行檢測。實驗所用引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司設計合成，Sirt1引物的序列為F：5′-GCTGACGACTTCGACGACG-3′，R：5′-TCGGTCAACAGGAGGTTGTCT-3′，β-actin引物序列為F：5′-GGGAAATCGTGCGTGAC-3′，R：5′-AGGCTGGAAAAGAGCCT-3′。以β-actin作為內參基因，采用2-△△CT計算細胞Sirt1 mRNA的相對表達水平。

1.6統計學分析

使用GraphPad Prism 8.0進行數據分析，計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有顯著意義。

2結果

2.1各組足細胞Sirt1、Nephrin、Podocin表達水平比較

RT-qPCR結果顯示，D、E組Sirt1 mRNA相對表達水平分別為15.50±2.43、1.01±0.17，D組足細胞Sirt1 mRNA 相對表達量顯著高于E組（t=14.580，P<0.05）。免疫印跡法分析顯示，A～C多組間足細胞Sirt1、Nephrin和Podocin蛋白相對表達量比較差異均有顯著性（F=49.84～106.40，P<0.01）；與A組相比，C組足細胞Sirt1、Nephrin以及Podocin相對表達量顯著降低（t=7.446～15.110，P<0.01），B組足細胞Sirt1、Nephrin和Podocin相對表達量無顯著差異（P>0.05）；與E組相比，D組足細胞Sirt1、Nephrin和Podocin相對表達量均顯著升高（t=4.657～32.860，P<0.05）；與C組相比，F組足細胞Nephrin、Podocin相對表達量顯著升高（t=3.790、8.151，P<0.01），Sirt1表達水平無統計學差異（P>0.05）。見表1、圖1。

2.2足細胞外泌提取及體分泌情況

透射電鏡下可見各組足細胞外泌體呈現典型的茶托樣結構（圖2A）。NTA檢測結果顯示，A、C、D、E、F組足細胞外泌體濃度分別為（61.30±1.50）×106/L、（87.00±2.60）×106/L、（21.2±0.30）×106/L、（66.00±1.00）×106/L和（6.40±0.46）×106/L；與A組相比，C組足細胞外泌體分泌顯著增加（t=14.550，P<0.01）；與E組相比，D組足細胞外泌體分泌顯著減少（t=74.610，P<0.01）；與C組相比，F組足細胞外泌體分泌量顯著減少（t=16.300，P<0.05）。免疫印跡法結果顯示，與A組相比，C組足細胞外泌體相關標志蛋白Alix、CD63以及CD81表達增加（圖2B）；與E組相比，D組足細胞Alix、CD63以及CD81表達減少（圖2C）。

3討論

DN是糖尿病患者嚴重微血管并發癥，是一種慢性進行性疾病，是終末期腎臟病的常見病因，近年來其發病率與日俱增[6]。目前DN的發病機制尚不完全清楚。研究顯示，足細胞是位于腎小球基底膜外表面的終末分化細胞，在維持腎小球濾過屏障的結構和功能方面發揮重要作用[8]。越來越多的證據表明，腎小球足細胞在DN的發病過程中起關鍵作用[9-12]，但其具體機制仍不十分清楚。

外泌體是一種直徑為50～150 nm的細胞外囊泡，通過細胞內吞過程形成，并且由細胞內多泡體（MVBs）釋放[3]。越來越多的證據表明，外泌體介導細胞間通訊，參與各種腎臟疾病的發生發展[13-14]。由于足細胞可分泌含有多種因子的外泌體[15-16]，且足細胞功能受外泌體的調節[17-18]，因此外泌體分泌異常可能是DN足細胞功能障礙的重要機制。既往研究發現，在體外高糖環境刺激下，足細胞分泌外泌體增加。此外鏈脲佐菌素誘導6、12周小鼠體內尿足細胞外泌體分泌增加，且先于尿蛋白升高[4]。但DN足細胞外泌體分泌增加的具體機制尚不清楚，本研究發現其可能與Sirt1表達的減少有關。

Sirt1是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的去乙酰化酶家族成員，在機體衰老、炎癥中發揮著重要作用[19]。研究發現，Sirt1可維持高糖環境下腎臟細胞的穩態，對DN發病時的腎細胞氧化應激、細胞凋亡、腎組織炎癥、腎臟纖維化等有改善作用[20]。既往研究表明，Sirt1在DN患者足細胞和腎小球細胞中表達降低，且糖尿病小鼠Sirt1全身敲除及足細胞特異性敲除均可加速DN的進展[21]。此外，Sirt1活性增高可以預防糖尿病誘導的足細胞損傷，并有效緩解DN的進展[22]。關于Sirt1與外泌體分泌間的關系，LATIFKAR等[23]發現在乳腺癌細胞中，Sirt1的缺失可能通過影響V型質子ATP酶催化亞基A（ATP6V1A）mRNA的穩定性，來影響溶酶體膜上ATP6V1A的表達，造成溶酶體酸化功能障礙，進而引起MVBs與質膜融合，增加外泌體釋放。上述過程中能夠在細胞水平上促進癌細胞的浸潤，但是Sirt1在DN足細胞外泌體分泌中的作用尚未見報道。在本研究中高糖誘導的足細胞Nephrin、Podocin以及Sirt1表達減少，足細胞外泌體分泌增加。對足細胞轉染Sirt1過表達慢病毒后，發現高糖環境下足細胞外泌體釋放減少，Nephrin、Podocin及Sirt1表達增加，足細胞損傷減輕。此外，外泌體釋放抑制劑GW4869干預高糖誘導的足細胞后，足細胞損傷也有所減輕。以上結果提示Sirt1可能通過抑制外泌體分泌減輕DN足細胞損傷，但上述結論還需進一步體內實驗驗證，且需對Sirt1下游機制進行探討。

綜上所述，本研究發現高糖誘導的足細胞外泌體分泌增加與Sirt1的減少有關，而過表達Sirt1可減輕足細胞的損傷，減少外泌體分泌。本研究首次研究了Sirt1與DN足細胞外泌體分泌的關系，補充了足細胞外泌體釋放的具體分子機制，為DN治療新靶點提供了理論依據。

作者聲明：丁琳、馬瑞霞參與了研究設計；丁琳、周燕、劉珊珊、劉南池、馬瑞霞參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 范睿心 厲建強）