基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接分析古方四君子湯輔助治療胃癌的作用機(jī)制*

陳小霞，陳國(guó)忠，謝彩杏，梁毅鋒，鄭日輝，楊昕

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西 南寧 530001； 2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530001

目前，胃癌的發(fā)病率在消化道惡性腫瘤中居首位［1］。歷代中醫(yī)學(xué)家多認(rèn)為，正氣虧虛是腫瘤產(chǎn)生的先決條件，氣虛不運(yùn)導(dǎo)致氣血濕痰毒之瘀滯，形成惡性腫瘤的主要病機(jī)，而脾胃為后天之本，氣血生化之源，為正氣生成的關(guān)鍵［2］。四君子湯通過(guò)補(bǔ)虛抗邪、固護(hù)人體后天之本，使機(jī)體保持氣血陰陽(yáng)平衡，提高胃癌患者免疫力，降低放化療反應(yīng)，同時(shí)促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡、抑制瘤體生長(zhǎng)［3-4］?，F(xiàn)代臨床中，四君子湯常被用作基出方聯(lián)合其他抗癌藥物治療消化系統(tǒng)在內(nèi)的多種惡性腫瘤［5-6］。但是，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，胃癌是一種復(fù)雜的惡性腫瘤，而全面闡釋四君子湯輔助治療胃癌過(guò)程的機(jī)制仍然是醫(yī)學(xué)界面臨的難題［7］。新興的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接將系統(tǒng)生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)聯(lián)結(jié)，與中醫(yī)藥整體觀念、辨證論治原則基本一致，將為全面認(rèn)識(shí)中醫(yī)藥在治療胃癌過(guò)程的機(jī)制提供一定的參考依據(jù)［8］。

1 材料與方法

1.1 提取藥物化學(xué)成分和靶點(diǎn) 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine system pharmacology，TCMSP）中選擇“Herb name”，分別檢索四君子湯中人參、白術(shù)、茯苓、甘草的化學(xué)成分，設(shè)定每個(gè)分子的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類(lèi)藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，綜合考慮藥理活性和機(jī)體利用度，并通過(guò)查詢(xún)中國(guó)知網(wǎng)、PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)，補(bǔ)充四君子湯最新的活性成分和靶點(diǎn)，去重后進(jìn)行編號(hào)。另外，在該數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)四君子湯中各藥物的靶點(diǎn)，運(yùn)用Perl語(yǔ)言在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中將靶點(diǎn)名稱(chēng)進(jìn)行基因名稱(chēng)轉(zhuǎn)換。

1.2 提取胃癌靶點(diǎn)和計(jì)算藥物-疾病共同靶點(diǎn) 以“gastric cancer”為關(guān)鍵詞，在常用疾病數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards、OMIM和TTD）中檢索胃癌靶點(diǎn)，排除重復(fù)項(xiàng)后進(jìn)行匯總。并運(yùn)用R語(yǔ)言計(jì)算藥物-疾病共同靶點(diǎn)，繪制韋恩圖。

1.3 構(gòu)建藥物-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行拓?fù)浞治?用以Tab制表符分隔的文本文檔和Microsoft Excel文件構(gòu)建藥物-疾病網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，對(duì)各節(jié)點(diǎn)進(jìn)行個(gè)性化調(diào)整。并采用network analyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析，實(shí)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.4 構(gòu)建PPl網(wǎng)絡(luò) 將已知的藥物-疾病共同靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，物種限制為人類(lèi)（Homo sapiens），隱藏游離點(diǎn)，設(shè)定較高置信度（highest confidence）＞0.7，減少假陽(yáng)性的發(fā)生并保證靶點(diǎn)的合理納入，其他保持默認(rèn)設(shè)置，保存tsv文件。然后導(dǎo)入Cytoscape中，利用network analyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析，突出PPI網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，最后用MCODE插件構(gòu)建聚類(lèi)功能模塊。

1.5 GO和KEGG富集分析 將PPI網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為“Homo sapiens”，P≤0.01，得到GO富集分析的細(xì)胞生物過(guò)程和KEGG富集分析的結(jié)果，另外利用Cytoscape的插件ClueGo進(jìn)行關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路的關(guān)系分析。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 1）小分子化合物處理：選取“1.3”項(xiàng)中得到的排名靠前和結(jié)構(gòu)各異的關(guān)鍵藥物化學(xué)成分，通過(guò)PubChem下載其sdf格式，導(dǎo)入Chem 3D，分別保存為mol2結(jié)構(gòu)文件，再導(dǎo)入Autodock Tools轉(zhuǎn)存為pdbqt格式。2）大分子蛋白處理：在PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)PPI排名前5的關(guān)鍵蛋白與胃癌相關(guān)的文獻(xiàn)，選擇研究較充分的前3個(gè)關(guān)鍵蛋白，通過(guò)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)，下載其pdb格式文件：要求人源蛋白優(yōu)先；有蛋白與配體的復(fù)合物；最好蛋白的配體與AMD的結(jié)構(gòu)類(lèi)似。再導(dǎo)入Pymol中去除水分子、分離原始配體，在Autodock Tools中轉(zhuǎn)存為pdbqt格式。3）最后設(shè)置活性口袋，利用Autodock Vina進(jìn)行分子對(duì)接，保留結(jié)合能最低的一對(duì)進(jìn)行分析展示。

2 結(jié)果

2.1 藥物化學(xué)成分和靶點(diǎn) 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和中國(guó)知網(wǎng)、PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到藥物化學(xué)成分136個(gè)，并取藥物首拼對(duì)其進(jìn)行編號(hào)，如人參：R01～R21，白術(shù)：B01～B07，茯苓：F01～F15，甘草：G01～G91。剔除1個(gè)人參和甘草的共同藥物化學(xué)成分：RG001，最終得到135個(gè)藥物化學(xué)成分，112個(gè)藥物靶點(diǎn)。

2.2 胃癌靶點(diǎn)和藥物-疾病共同靶點(diǎn) 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選胃癌靶點(diǎn)，將相關(guān)性評(píng)分限制為≥9.81（中位數(shù)），同時(shí)在OMIM和TTD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步檢索，取三者交集，得到胃癌靶點(diǎn)2847個(gè)，排除重復(fù)項(xiàng)后剩1423個(gè)。使用R語(yǔ)言計(jì)算藥物-疾病共同靶點(diǎn)，得到65個(gè)。見(jiàn)圖1。

圖1 藥物-疾病共同靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 藥物-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和拓?fù)浞治?將構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)和屬性文件導(dǎo)入Cytoscape，繪制出由252個(gè)節(jié)點(diǎn)和1050條邊構(gòu)建成的網(wǎng)絡(luò)圖。使用network analyzer插件進(jìn)行拓?fù)浞治觯?jì)算并設(shè)定節(jié)點(diǎn)平均度值為4，平均介數(shù)中心性為0.000 548 96。另外根據(jù)兩者值的大小在圖中突出顯示，篩選出關(guān)鍵的藥物化學(xué)成分。見(jiàn)圖2、表1。

表1 關(guān)鍵的藥物化學(xué)成分

圖2 藥物-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPl網(wǎng)絡(luò) 在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中得到由65個(gè)節(jié)點(diǎn)，268條邊構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)。其中MAPK8、ESR1、CCND1、EGFR、IL-6、MYC、VEGFA、CASP3等為關(guān)鍵靶點(diǎn)。另外，在MCODE插件構(gòu)建的聚類(lèi)功能模塊中，排名前三的MAPK8、ESR1、CCND1與其他靶點(diǎn)的連接程度評(píng)分均在2分以上，提示靶點(diǎn)功能團(tuán)之間連接緊密，四君子湯治療胃癌具有明顯的多藥效-多靶點(diǎn)作用關(guān)系。見(jiàn)圖3。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO和KEGG富集分析 將在Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)得到的前20個(gè)細(xì)胞生物過(guò)程按計(jì)數(shù)值（Count）排序，其中每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)富集的術(shù)語(yǔ)（term），相似度＞0.3的term通過(guò)邊連接，匯聚成功能團(tuán)，見(jiàn)圖4。

圖4 GO富集分析

另外，KEGG富集分析中，根據(jù)Count值篩選前20條通路進(jìn)行可視化，見(jiàn)圖5。關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路的關(guān)系分析見(jiàn)圖6。

圖5 KEGG富集分析

圖6 關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路的關(guān)系分析

2.6 分子對(duì)接模型 Autodock Vina以結(jié)合能表示小分子與大分子化合物結(jié)合的程度。本次研究結(jié)合能均值為-7.64 kcal/mol＜-5 kcal/mol，說(shuō)明小分子與大分子結(jié)合性好，且值越小表示構(gòu)象越穩(wěn)定，結(jié)合能由小到大，顏色由紅至藍(lán)排布，見(jiàn)圖7。選取結(jié)合能最低的quercetin和MAPK8（PDB ID：4YR8）進(jìn)行分子對(duì)接展示，MAPK8的氨基酸殘基TYR-181和THR-325分別與quercetin以氫鍵相連接，提示前期分析所得的關(guān)鍵藥物化學(xué)成分生物活性高，與核心靶點(diǎn)之間結(jié)合性好、構(gòu)象穩(wěn)定。見(jiàn)圖8。

圖7 結(jié)合能矩形熱圖

圖8 quercetin與MAPK8的對(duì)接圖

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，脾胃運(yùn)轉(zhuǎn)一身之氣，在人體正常的生命活動(dòng)中起著重要的作用。而正氣不足貫穿在惡性腫瘤的始終。四君子湯通過(guò)激發(fā)人體正氣，補(bǔ)虛抗邪，調(diào)理脾胃以安五臟，在輔助治療胃癌的中醫(yī)藥中，四君子湯始終發(fā)揮著重要作用［9］。

經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，四君子湯共有135個(gè)藥物化學(xué)成分，112個(gè)藥物靶點(diǎn)，其中與胃癌的1423個(gè)靶點(diǎn)中共有65個(gè)交集靶點(diǎn)，充分體現(xiàn)了中藥復(fù)方“多成分、多靶點(diǎn)”的特色，在構(gòu)建的藥物-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中明顯展示了此種關(guān)系。其中，篩選得到四君子湯治療胃癌關(guān)鍵的藥物化學(xué)成分為槲皮素、異鼠李素、山柰酚等。槲皮素和山柰酚存在于多種傳統(tǒng)中草藥當(dāng)中［10］，其中，槲皮素能誘導(dǎo)活性氧類(lèi)的產(chǎn)生，增加胃癌細(xì)胞凋亡的細(xì)胞數(shù)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，并改變相關(guān)基因的表達(dá)，阻斷癌基因和信號(hào)因子的傳導(dǎo)［11］。異鼠李素主要通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡因子表達(dá)，下調(diào)Bcl-2，上調(diào)Bax，達(dá)到促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的目的，并且能發(fā)揮阻斷細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)、抑制細(xì)胞增殖等作用［12］。山柰酚可對(duì)抗多種癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，尤其在干擾胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)方面具有較大的作用。IMRAN等［13］認(rèn)為，其通過(guò)抑制人胃癌細(xì)胞（MKN28和SGC7901）增殖活性和細(xì)胞自噬，將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，是促進(jìn)胃癌細(xì)胞死亡的主要機(jī)制。KIM等［14］發(fā)現(xiàn)，山柰酚通過(guò)IRE1-JNK1途徑介導(dǎo)Bcl-2-Beclin-1在胃癌細(xì)胞中的解離，從而誘導(dǎo)自噬細(xì)胞死亡，通過(guò)HDAC/G9a途徑表觀遺傳介導(dǎo)自噬細(xì)胞死亡。另外，在PPI網(wǎng)絡(luò)中，所得的關(guān)鍵靶點(diǎn)為MAPK8、ESR1、CCND1等。MAPK8也稱(chēng)為JNK1，屬于JNK激酶家族，可直接結(jié)合并促進(jìn)多種轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，參與信號(hào)傳導(dǎo)。諸如促炎性細(xì)胞因子或細(xì)胞外刺激，通過(guò)激活SAP/JNK信號(hào)傳導(dǎo)途徑，能調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞分化、癌癥進(jìn)展及程序性細(xì)胞死亡，并通過(guò)不同的分子機(jī)制誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞的自噬［15］。ESR1可促進(jìn)組裝轉(zhuǎn)錄蛋白的復(fù)合物在染色質(zhì)重塑，激活下游基因，達(dá)到調(diào)控胃癌的作用［16-17］。CCND1能抑制細(xì)胞周期蛋白表達(dá)，在G1/S過(guò)渡過(guò)程中阻斷胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，減少癌細(xì)胞的不良分化［18］。早期發(fā)現(xiàn)，使用極光激酶B（aurora kinase B，AURKB）能觸發(fā)絲氨酸磷酸化，影響細(xì)胞有絲分裂，誘導(dǎo)CCND1表達(dá)，促進(jìn)胃癌發(fā)展，與胃癌患者的總體生存期有密切聯(lián)系［19］。在分子對(duì)接中，四君子湯治療胃癌關(guān)鍵的藥物化學(xué)成分和靶點(diǎn)結(jié)合性好、構(gòu)象穩(wěn)定，較容易自發(fā)結(jié)合。另一方面，細(xì)胞生物過(guò)程多富集于RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、DNA模板的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控等途徑，在KEGG通路中，四君子湯顯著富集于p53信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路等與胃癌密切相關(guān)的癌癥途徑，這是臨床經(jīng)驗(yàn)和現(xiàn)代技術(shù)相互結(jié)合的結(jié)果［20-21］。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)，對(duì)四君子湯在胃癌中發(fā)揮的作用機(jī)制進(jìn)行分析、驗(yàn)證，再結(jié)合已有文獻(xiàn)論證方藥的作用機(jī)理，基本實(shí)現(xiàn)對(duì)方劑多靶點(diǎn)、多通路的預(yù)測(cè)。在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，將有望為臨床應(yīng)用四君子湯輔助治療胃癌提供借鑒意義。