基于HPLC-DAD 指紋圖譜結合化學模式識別的紅糖產地溯源方法

張雅淑，黃美婷，呂仕軍，陸莉莉，曹軼群，謝彩鋒，陸海勤，黎慶濤*，黃智*

（1.廣西大學輕工與食品工程學院,廣西南寧 530004；2.廣西壯族自治區產品質量檢驗研究院,廣西南寧 530200）

紅糖是甘蔗經過壓榨、澄清、蒸發、濃縮過程加工而成的一種非分蜜糖（non-centrifugal sugar,NCS）[1],保留了甘蔗中大部分的酚類、黃酮類化合物、維生素、礦物質以及氨基酸等成分[2-5],紅糖中營養及活性成分的差異來源于甘蔗原料的差異,原料差異主要受到甘蔗品種、種植地區生態環境和氣候等因素的影響[6-10]。隨著消費者對天然、健康食品的追求不斷增加,正品紅糖的市場需求量也在日益增長,然而這也導致了假冒偽劣產品的涌現[11]。因此,通過追溯紅糖的產地來遏制假冒和劣質商品的流通,是一種非常有效的手段。

指紋圖譜是一種可以反映樣品整體在各種條件下的化學特征和規律的技術,常用于復雜樣品的鑒定和品質控制[12]。紅糖的指紋圖譜研究主要采用一系列的分析技術,包括色譜技術[如高效液相色譜（high performance liquid chromatography,HPLC）[13]、氣相色譜（gas chromatography,GC）[14]、質譜（mass spectrometry,MS）[15]等]以及光譜技術[如紅外光譜（infrared spectroscopy,IR）[16-17]、紫外可見光譜和三維熒光光譜[18]等]。紅糖的指紋圖譜技術主要應用在質量評估、真偽鑒別和產地溯源。在品質評估方面,陸楊等[13]對35 批藥用輔料紅糖的紫外全波長融合指紋圖譜進行相似度分析,構建了藥用輔料紅糖的紫外光譜指紋圖譜,標定10 個共有峰,為制定藥用輔料紅糖的品質標準提供依據。在真偽鑒別方面,蔡瑋琦等[19]為了將白砂糖、紅糖、赤砂糖以及黑糖進行區分,建立了白砂糖、紅糖、赤砂糖與黑糖的非糖部分高效液相色譜指紋圖譜,結合模式識別發現白砂糖、紅糖、赤砂糖以及黑糖之間可以相互區分,從而達到準確區分該類食品的目的。楊婷等[20]通過氣相色譜-離子遷移譜技術建立了3 種紅糖和3 種赤砂糖揮發性成分指紋圖譜,共鑒定出65 種已知物質,主成分分析結果表明紅糖和赤砂糖揮發性成分存在明顯差異,為紅糖和赤砂糖鑒定分析提供了依據。在產地溯源方面,陳其釗等[21]建立了廣西、廣東和云南21 批紅糖的HPLC-二極管陣列檢測器（diode array detector,DAD）指紋圖譜,結合化學計量學標定13 個共有峰,發現其中11 個成分是造成不同批次樣品差異性的主要標記物,可將這3 個產地兩兩區分。但產地的覆蓋率較窄,樣本數量不足,對紅糖產地溯源的研究還不完善。Chen 等[14]采用氣相色譜-嗅覺-質譜聯用（gas chromatography-olfactory-mass spectrometry,GC-O-MS）對比分析了來自廣東、廣西和云南三省的18 批甘蔗紅糖中揮發性風味化合物的差異,結果表明建立的正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA）模型鑒別出了可區分紅糖產地的4 種化合物。

將色譜指紋圖譜與化學計量學方法結合可以充分利用圖譜信息對樣品進行品質評價[22]。模式識別是化學計量學在紅糖化合物鑒定方面的一個重要分支,用于挖掘和可視化圖譜信息,從而建立有效的識別模型用于紅糖的品質評估和產地溯源[23]。其中,無監督學習系統是常見的模式識別分類方法,可對未標記數據中的隱藏模式進行準確的預測或分類,聚類分析（hierarchical cluster analysis,HCA）和主成分分析（principal component analysis,PCA）是其中常用的兩種模型,HCA可對數據進行分類,PCA 可對類別之間的相似性進行評估[24-25]。Chen 等[18]使用紫外可見光譜、三維熒光光譜和質譜,通過PCA 和線性判別法分析圖譜數據,能夠準確區分天然紅糖和商業紅糖,建立紅糖原料的品質控制方法。

近年來,隨著消費者對食品安全的關注度不斷提高,紅糖的產地溯源問題也備受關注,但目前只有Chen 等[14]和陳其釗等[21]在紅糖溯源方面建立了指紋圖譜。以上研究雖然取得了一定的成果,但是覆蓋范圍相對有限,僅涵蓋了廣西、廣東和云南3 個地區；其次,僅分析了21 批和18 批紅糖樣本,樣本數量也不足。本研究對來自廣西、廣東、云南、貴州和香港5 個紅糖主產地的11 家制糖企業的55 批紅糖樣品進行了深入的研究,通過HPLC-DAD 檢測技術,建立5 個紅糖主產地特有的指紋圖譜和全部產地的共有指紋圖譜,并結合共有模式法、相似度評價法和化學計量學法,對55 批紅糖樣品的指紋圖譜進行比對,以期有效區分不同來源的紅糖,并準確鑒別不同產地紅糖之間的化學成分差異,實現對不同產地紅糖的快速準確鑒別,以確保紅糖產品的品質與安全。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

從廣西、廣東、貴州、香港和云南的11 家制糖企業中,選取了55 批紅糖樣品。其中,廣西地區的5 家不同制糖企業分別標記為桂中號（L1～L5）、桂南1 號（M1～M5）、桂南2 號（Z1～Z5）、桂東1 號（X1～X5）和桂東2 號（P1～P5）；廣東地區的兩家不同制糖企業標記為廣東1 號（H1～H5）和廣東2 號（G1～G5）；云南地區的兩家不同制糖企業標記為云南1 號（N1～N5）和云南2 號（Y1～Y5）；貴州地區的1 家制糖企業標記為貴州號（F1～F5）；香港地區的1 家制糖企業標記為香港號（D1～D5）。

乙腈（色譜純）:成都市科隆化學品有限公司；三氟乙酸（色譜純）:天津市科密歐化學試劑有限公司；無水乙醇（分析純）:廣東予能實驗室設備科技有限公司；超純水:成都優越科技有限公司。

1.2 儀器與設備

GRINDOMIX GM200 刀式研磨儀:德國Retsch（萊馳）公司；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司；Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×100 mm,2.7μm）色譜柱、Cary 3500 紫外可見分光光度計、Agilent 1260 液相色譜儀:美國安捷倫公司；AL204萬分之一電子天平:梅特勒-托利多儀器有限公司；TG20WS 臺式高速離心機:湖南湘立科學儀器有限公司；HYC-1378 醫用冷藏箱:青島海爾電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

將烘干的紅糖樣品用電子天平稱取8 g（精確至0.000 1 g）,使用80 mL 無水乙醇溶解在100 mL 離心管中,為使超聲過程中紅糖不受環境溫度升高的影響,在超聲波清洗器內加入冰塊,使超聲全過程保證在低溫5～15 ℃下進行,中途溫度升高需補加冰塊。超聲處理（550 W、40 kHz）30 min,將超聲處理后的溶液使用4 000 r/min 的臺式高速離心機離心8 min 取上清液,將上清液倒入直徑為15 cm 的圓形培養皿,置于通風櫥使乙醇全部揮發,加入5 mL 超純水復溶,分別用2、1 mL 超純水潤洗,定容至10 mL 制成供試品溶液。放入4 ℃醫用冷藏箱待測[21]。

1.3.2 高效液相色譜檢測

1.3.2.1 高效液相色譜條件

紅糖指紋圖譜高效液相色譜采用Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×100 mm,2.7μm）色譜柱,流動相采用乙腈-0.1%三氟乙酸梯度洗脫,檢測波長為270 nm,柱溫30 ℃,流速采用0.2～1.0 mL/min 梯度流速,進樣量20μL,洗脫程序見表1。

1.3.2.2 精密度、重現性和穩定性測定

稱取同一批次紅糖樣品6 份（X1）,并按照1.3.1方法制備供試品溶液,取其中一份樣品連續進樣6 次,取另一份樣品分別在0、2、4、8、12、24、48 h 進樣檢測,按照1.3.2.1 指紋圖譜色譜條件分別進行檢測,選擇18 號峰作為參照,并通過Microsoft Excel 軟件計算該樣品中共有峰的相對峰面積和相對保留時間,計算精密度、重復性和穩定性的相對標準偏差（relative standard deviation,RSD）,并將6 次測定結果通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.1 版）》軟件進行相似度計算。

1.3.3 數據處理

1.3.3.1 共有模式法分析產地特有峰和共有峰

將5 個產地紅糖樣品的HPLC-DAD 色譜圖數據分別導入色譜軟件中,分別生成產地各自特有的紅糖HPLC-DAD 指紋圖譜共有模式。按《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）》[26]中的要求,選取分離度好且共有的色譜峰作為參照,計算各產地紅糖指紋圖譜的相對保留時間,并匹配色譜峰。選擇某一產地90% 以上樣品中的共有峰,形成該產地特有指紋圖譜[27],再選取各產地中均存在的共有峰生成所有產地的共有指紋圖譜,通過分析特有峰的保留時間以及共有峰的峰面積來鑒別不同產地的紅糖。

1.3.3.2 相似度分析

將1.3.3.1 中建立的產地特有的HPLC-DAD 指紋圖譜共有模式和共有的HPLC-DAD 指紋圖譜共有模式,分別導入色譜軟件進行分析,比較55 批樣品各產地組內和組外的相似度差異。

1.3.3.3 基于共有峰峰面積的化學計量分析

將55 批不同產地紅糖樣品的9 個共有峰峰面積導入在線代謝組學數據分析平臺Metabo Analys 統計軟件中,以標準化數據為數據源,標準化為“Autoscale samples”,“Pearson”模式為距離測量方式,以“ward”為聚類方法對數據進行聚類分析,得到層次聚類熱圖。為了研究55 批紅糖樣品中9 種成分的分布規律,使用在線代謝組學數據分析平臺對數據進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 精密度、重復性和穩定性測定結果

經測定精密度、重復性和穩定性的檢測,發現6 組指紋圖譜共匹配了32 個共有峰,并計算共有峰的相對峰面積（relative peak area,PA）的相對標準偏差（RSD）,結果顯示RSD 均低于3%。同時,相似度均超過0.99,證明了儀器的高精密度和試驗方法的良好重現性。

2.2 產地特有的指紋圖譜共有模式分析特有色譜峰保留時間的差異

生成的產地特有的紅糖HPLC-DAD 指紋圖譜共有模式見圖1,不同產地紅糖樣品的HPLC-DAD 指紋圖譜共有峰的平均相對保留時間見表2。

圖1 不同產地紅糖的HPLC-DAD 指紋圖譜共有模式Fig.1 HPLC-DAD fingerprint patterns of brown sugar from different producing areas

表2 不同產地紅糖的HPLC-DAD 指紋圖譜共有峰的平均相對保留時間Table 2 Average relative retention time of common peaks in HPLC-DAD fingerprints of brown sugar from different origins

由圖1、表2 可知,各產地的紅糖HPLC-DAD 指紋圖譜顯示出較多的共有峰。廣西、廣東、云南、貴州和香港地區紅糖HPLC-DAD 指紋圖譜共有模式分別存在共有峰26、20、9、37 個和39 個。平均相對保留時間為1.527、1.670、1.747、1.987 和2.208 的色譜峰為廣西特有,廣東特有的色譜峰平均相對保留時間為3.915,貴州特有色譜峰平均相對保留時間為0.368 和0.505,平均相對保留時間為1.404、1.437、1.475、1.820、1.854、1.966、1.980、2.141 和2.276 的色譜峰為香港特有。廣西、廣東、貴州和香港地區紅糖分別存在特有峰5、1、2 個和9 個,通過對各地區的特有峰保留時間進行分析,可以初步區分不同產地的紅糖。

2.3 產地共有峰峰面積分析及紅糖樣品指紋圖譜

生成產地共有的紅糖HPLC-DAD 指紋圖譜共有模式見圖2。圖3 為55 批紅糖樣品指紋圖譜和產地共有的HPLC-DAD 指紋圖譜共有模式對照。全部產地共有峰的平均相對保留時間見表3,平均相對峰面積見表4。

圖2 產地共有HPLC-DAD 指紋圖譜共有模式Fig.2 Common HPLC-DAD fingerprint patterns for producing areas

圖3 紅糖樣品指紋圖譜Fig.3 Fingerprint patterns of brown sugar

表3 產地共有HPLC-DAD 指紋圖譜共有峰的平均相對保留時間Table 3 The average relative retention time of common peaks in the HPLC-DAD fingerprint of the place of origin

表4 產地共有峰的平均相對峰面積Table 4 The average relative peak area of common peaks

在紅糖的HPLC-DAD 圖譜中,色譜峰代表不同的化學組分,色譜峰面積的大小代表各組分含量的高低,共有峰的相對峰面積反映所含化學成分的相對含量,RSD 值表示了化學成分間的差異[28]。由圖3、表3、表4 可知,產地共有的HPLC-DAD 指紋圖譜共確定了9 個共有峰,共有峰的相對保留時間RSD≤1.53%。然而,不同產地紅糖中共有峰的平均相對峰面積差異較大,其RSD 值為45.565%～197.088%。這種差異主要是由于紅糖來自不同的產地,由于氣候、生態環境、原料品種和加工工藝等方面存在一定的差異,因此導致了其化學成分種類及含量的差異。廣東、廣西、云南、貴州和香港地區的S2 號共有峰的平均相對峰面積分別為 47.592% 、26.873% 、814.853% 、8.683% 和3.111%,通過S2 號共有峰的平均相對峰面積,可以成功地將這5 個產地區進行區分。

2.4 指紋圖譜相似度評價

在進行初步的產地判別后,利用相似度評價法對紅糖產地組內和產地之間進行分析和鑒別,結果見表5、表6。

表5 紅糖樣品與所屬產地的HPLC-DAD 指紋圖譜共有模式間的相似度Table 5 Similarity of common patterns between brown sugar samples and HPLC-DAD fingerprints of their respective producing areas

表6 產地特有紅糖HPLC-DAD 指紋圖譜與產地共有紅糖HPLC-DAD 指紋圖譜間的相似度Table 6 Similarity between region-specific HPLC-DAD fingerprints of brown sugar and common HPLC-DAD fingerprints of brown sugar

由表5 可知,廣西紅糖樣品與其HPLC-DAD 指紋圖譜共有模式間的相似度為0.533～0.986,廣東紅糖樣品與其HPLC-DAD 指紋圖譜共有模式間的相似度為0.686～0.966,云南紅糖樣品與其HPLC-DAD 指紋圖譜共有模式間的相似度為0.436～0.862,貴州紅糖樣品與其HPLC-DAD 指紋圖譜共有模式間的相似度為0.783～0.918,香港紅糖樣品與其HPLC-DAD 指紋圖譜共有模式間的相似度為0.992～0.999。香港紅糖樣品與其產地特有指紋圖譜共有模式之間的相似度較高,紅糖樣品與各自相應產地的HPLC-DAD 指紋圖譜共有模式間的相似度均大于0.9,說明相同產地的紅糖樣品間所含的化學成分較相似。廣西紅糖樣品與其指紋圖譜共有模式間的相似度范圍較大,分析原因可能是廣西紅糖樣本數量較多,相對于其他地區更能體現出較大的差異性,但這種差異仍在合理的范圍內。云南紅糖樣品與其指紋圖譜共有模式間的相似度較低,由于云南地處低緯高原,蔗區海拔、降雨量、日照時間等自然條件差異顯著,使得云南蔗區成為世界上生產條件最復雜的蔗區之一,這些環境因素導致了甘蔗原料的明顯差異,進而影響了云南紅糖樣品的獨特性[29]。

表6 顯示廣西、廣東、貴州、香港、云南紅糖指紋圖譜共有模式與5 個產地共有紅糖HPLC-DAD 指紋圖譜共有模式間的相似度分別為0.837、0.823、0.915、0.849、0.473,廣東、廣西和香港的紅糖之間相似度差異較小,云南紅糖與其他地區相似度存在較大的差異。貴州和云南地區的紅糖,可以明顯地區別于其他地區,表明貴州和云南的甘蔗品質和特性存在明顯差異,從而能夠與其他地區的產品立即區分出來。相似度評價雖然能夠實現初步的區分,但無法提供更精確的區分結果,為了實現更精細的區分,還需要進行化學計量學分析以得出更深入的結論。

2.5 聚類分析（HCA）法處理共有峰峰面積

使用相似度評價法分析紅糖產地,發現貴州和云南的紅糖可明顯區分,但廣東、廣西和香港的紅糖相似度高,難以區分。因此,需將產地共有指紋圖譜中的9 個共有峰結合化學模式法進一步分析,得到的聚類熱圖見圖4。

圖4 紅糖樣品聚類熱圖Fig.4 Heatmap of brown sugar samples

如圖4 所示,5 個地區的紅糖樣品之間存在明顯的差異,每個地區各自聚為一小類,小組間存在明顯差異,顯示了各地區樣本間明顯的區別。云南的紅糖樣品被分為兩個子類,這表明云南紅糖樣本之間存在組間差異,進一步驗證了2.4 相似度評價法顯示的結果。此外,廣東地區的紅糖樣品中含有較高比例的成分S4、S5、S8 和S9,香港地區的樣品含有較多的S4、S5 和S9,廣西地區的紅糖樣品中主要含有成分S4 和S5,貴州地區含有更多的S4 和S6,云南地區的紅糖樣品中顯現出含有較多的成分S1 和S6,這些不同的化學成分分布為區分不同產地的紅糖提供了依據。研究結果顯示,不同產地的紅糖樣品化學成分的種類及含量具有明顯差異,因此通過聚類分析深入分析這些化學成分的分布情況,可以準確地對紅糖產地進行追蹤溯源。

2.6 主成分分析（PCA）法處理共有峰峰面積

使用在線代謝組學數據分析平臺對數據進行主成分分析和相關性分析,結果見圖5。

圖5 紅糖樣品主成分分析Fig.5 Principal component analysis of brown sugar samples

圖5A 顯示除部分廣東紅糖樣品與廣西紅糖存在部分重疊外,其他3 個產地的紅糖樣品2D 得分圖呈現出分散的態勢,基本可以相互區分,特別是香港和貴州的紅糖能夠很好地與其他地區的紅糖進行區分。

變量載荷圖可以反映主成分與變量之間的關系,載荷的絕對值越大,對主成分的影響就越大,而這種影響可以通過載荷所代表的點到原點之間的距離來進行衡量。如果某個點在進行主成分分析之后位置在原點附近,則說明該變量對于樣本之間的區別貢獻不大[30],由圖5B 可知,PC1 主要受S4、S6、S5 的影響,PC2 主要受S6、S2、S7 的影響。

圖5C 顯示PC1 的方差貢獻率為59.9%,PC2 的方差貢獻率為17.1%,PC3 的方差貢獻率為11.6%,主成分PC1 的方差貢獻率最大,PC1、PC2 與PC3 的累計方差貢獻率為88.6%。這3 種主成分對模型的貢獻較大,可作為鑒別紅糖產地的特征性指標。

結果顯示不同產地的樣品主要受組分S4、S6、S5、S2、S7 的影響。此外,組分S3 與S8 的對稱性和平穩性幾乎相同,這意味著這兩個成分所反映的信息基本相同。主成分分析能夠很好地區分廣西、云南、貴州和香港的紅糖,但部分廣東樣品無法與廣西樣品區分,這是因為廣東與廣西所用甘蔗的品種大多相同,生產工藝相似,并且廣西和廣東兩地都位于我國南部,同屬亞熱帶季風氣候區,地理位置相近,氣候條件相似,兩地的甘蔗都具有雨熱同期的特點[31-32]。

2.7 共有峰成分定性定量分析

采用HPLC-DAD 方法,結合對照品比對以進一步確定共有峰成分,結果見圖6。

圖6 表沒食子兒茶素高效液相色譜特征峰Fig.6 Characteristic peaks of epigallocatechin in high performance liquid chromatography

由圖6 可知,根據出峰時間（5.368 min）確定S1 號色譜峰為表沒食子兒茶素,化學式為C15H14O7。

采用外標法,通過峰面積計算得出樣品中表沒食子兒茶素的含量,并將紅糖樣品中的含量結果展示在圖7。

圖7 紅糖樣品中表沒食子兒茶素的含量Fig.7 Content of epigallocatechin in brown sugar samples

由圖7 可知,55 批紅糖樣品中表沒食子兒茶素含量較高,但各批次樣品成分含量差異較大。廣東地區廣東1 號廠家含有表沒食子兒茶素平均含量最多,廣東2 號廠家含有表沒食子兒茶素平均含量最少。因此,即使是同一產地的紅糖,各廠家之間的表沒食子兒茶素含量也存在差異,這表明表沒食子兒茶素的含量與產地無關,可能受到不同加工方式的影響。

3 結論

本研究以5 個主產地的11 家制糖企業的55 批紅糖樣品作為研究對象,建立產地特有的HPLC-DAD 指紋圖譜,發現廣西、廣東、貴州和香港地區紅糖分別存在5、1、2 個和9 個特有峰,可以初步區分不同產地的紅糖。產地共有HPLC-DAD 指紋圖譜中共確定了9 個共有峰,廣東、廣西、云南、貴州和香港地區的S2 號共有峰的平均相對峰面積分別為47.592%、26.873%、814.853%、8.683%和3.111%,通過S2 號產地共有峰的峰面積,可以成功地將這5 個產地的紅糖進行區分。為了更準確地鑒別紅糖產地,采用了HCA 和PCA 兩種化學計量學方法分析峰面積,HCA 可以明顯區分不同紅糖主產地的樣品,并得到廣西、云南地區紅糖樣本之間存在差異。PCA 不僅能夠區分辨別不同地區的樣品,還能清楚地揭示對溯源有影響的成分,并準確評估其貢獻大小。本研究建立的紅糖溯源量化方法,保證了更科學的紅糖產地區分和溯源,為規范市場提供了有力的技術支持和堅實的科學依據。